李闊宇，潘魯湲，孫永華

(中國科學(xué)院水生生物研究所，淡水生態(tài)與生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家斑馬魚資源中心，武漢 430072)

在現(xiàn)代生命科學(xué)等相關(guān)學(xué)科的發(fā)展歷程中，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物發(fā)揮了重要的作用。那些被廣泛認(rèn)同、使用、研究的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物物種，被稱為模式動(dòng)物。斑馬魚(Daniorerio)是一種原產(chǎn)于印度半島熱帶淡水水域的新興模式動(dòng)物[1]，它具有胚胎體外受精、體外發(fā)育、發(fā)育迅速、胚體透明、體型較小、性成熟快、產(chǎn)卵量大、適于高通量養(yǎng)殖和篩選等優(yōu)點(diǎn)[2]，因而受到遺傳學(xué)[3]、發(fā)育生物學(xué)[4, 5]、神經(jīng)生物學(xué)[6]、腫瘤學(xué)[7]、再生和干細(xì)胞研究[8]、疾病模型和藥物篩選[9, 10]、環(huán)境毒理學(xué)[11]、水產(chǎn)基礎(chǔ)學(xué)[12]等科研領(lǐng)域的青睞。自上世紀(jì)70年代末Steisinger和同事們首次將斑馬魚作為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行全面和詳細(xì)的描述以來[13]，斑馬魚作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物已歷經(jīng)30多年的研究應(yīng)用和系統(tǒng)發(fā)展。上世紀(jì)90年代，位于德國Tübingen和美國Boston的研究者對斑馬魚進(jìn)行了大規(guī)模的誘變和篩選，獲得了大批具有不同表型的突變品系，奠定了斑馬魚作為模式動(dòng)物的堅(jiān)實(shí)地位[4, 5]。在此后的20年中，以斑馬魚為實(shí)驗(yàn)材料的研究飛速發(fā)展，研究總量擴(kuò)展了近20倍[6, 14]，現(xiàn)已成為僅次于小鼠的第二大脊椎模式動(dòng)物。

一般認(rèn)為，我國的斑馬魚研究始于上世紀(jì)末清華大學(xué)孟安明實(shí)驗(yàn)室的建立。我國的斑馬魚研究在本世紀(jì)得到了飛速的發(fā)展，2001～2013年，我國以斑馬魚為研究材料發(fā)表的科研論文總數(shù)占全世界同類文章的比重，由2.09%迅速提高到15.6%[15]。順應(yīng)這種發(fā)展，在國家科技部和中國科學(xué)院的支持下，我國的國家斑馬魚資源中心(China Zerabfish Resource Center，以下簡稱CZRC)于2012年10月在中國科學(xué)院水生生物研究所正式掛牌成立。CZRC的主要任務(wù)是收集、創(chuàng)制、保藏、分享斑馬魚轉(zhuǎn)基因和突變品系等相關(guān)資源，為中國、亞洲乃至全球的斑馬魚研究領(lǐng)域提供斑馬魚資源和技術(shù)服務(wù)。

本文將重點(diǎn)介紹全球范圍內(nèi)斑馬魚研究資源的開發(fā)與保藏現(xiàn)狀，以及CZRC的相關(guān)建設(shè)情況。

1 斑馬魚資源的開發(fā)技術(shù)

1.1 斑馬魚品系資源的正向遺傳篩選

斑馬魚作為模式動(dòng)物的一大優(yōu)勢在于其非常適合于開展高通量遺傳篩選[4, 5]。早期使用γ射線誘變斑馬魚胚胎的方法獲得突變體以進(jìn)行正向遺傳篩選[16]。由于γ射線會(huì)導(dǎo)致斑馬魚染色體大片段的缺失、異位等損傷，會(huì)對后續(xù)表型-基因型關(guān)聯(lián)分析帶來困難，因此很快被N-乙基-N-亞硝基脲(ENU)隨機(jī)誘變所取代[17]。以ENU處理成年雄性斑馬魚可高效率地誘變減數(shù)分裂前的精原干細(xì)胞，其單位點(diǎn)突變效率可達(dá)每(1～1.5)×105bp出現(xiàn)1個(gè)點(diǎn)突變[18]。德國Nüsslein-Volhard和美國Driever研究小組分別同時(shí)使用ENU大規(guī)模誘變斑馬魚，篩選出4000多種和2000多種斑馬魚突變品系[4, 5]。這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室的研究表明斑馬魚是開展高通量飽和誘變篩選的理想的脊椎模式動(dòng)物。

雖然ENU的誘變效率高，但是對其所造成的點(diǎn)突變進(jìn)行圖位克隆需要耗費(fèi)相當(dāng)大的人力物力。為解決這一問題，研究人員在斑馬魚中建立了利用逆轉(zhuǎn)錄病毒或轉(zhuǎn)座子插入染色體的突變技術(shù)[19, 20]。該技術(shù)是通過將轉(zhuǎn)座子或逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA導(dǎo)入斑馬魚胚胎，外源DNA隨機(jī)插入胚胎原始生殖細(xì)胞的染色體內(nèi)，經(jīng)后續(xù)培養(yǎng)、篩選可形成穩(wěn)定遺傳的突變品系。通過已知的外源DNA序列，可以較為方便地鑒定造成特定表型的突變基因。Kawakami研究小組利用Tol2轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的增強(qiáng)子捕獲技術(shù)成功地篩選得到72個(gè)斑馬魚突變品系[20]。Hopkins研究小組通過將小鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA注射入斑馬魚胚胎，篩選得到約1000個(gè)斑馬魚突變品系[21]。但是，與ENU誘變技術(shù)相比較，轉(zhuǎn)座子或逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的突變效率相對較低，這也是一個(gè)必需考量的因素。

1.2 斑馬魚品系資源的反向遺傳篩選

隨著斑馬魚全基因組測序的基本完成[22]，反向遺傳篩選技術(shù)在斑馬魚突變品系大規(guī)模開發(fā)方面發(fā)揮出越來越大的作用。在斑馬魚中，基于ENU誘變庫的TILLING(targeting induced local lesions in genomes)技術(shù)是最早得以被成功應(yīng)用的反向遺傳篩選技術(shù)[23-25]。經(jīng)典的TILLING策略是：PCR擴(kuò)增誘變庫中目的基因片段，將PCR產(chǎn)物變性和退火處理，用能夠識別并切割非互補(bǔ)堿基的核酸內(nèi)切酶CELI酶切退火產(chǎn)物加以判斷，并進(jìn)一步通過DNA測序確認(rèn)[26-29]。近年來，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，對文庫整體進(jìn)行定點(diǎn)測序替代了原有的酶切檢測方法。TILLING技術(shù)具有高通量、自動(dòng)化、快速有效地從ENU誘變的突變?nèi)后w中鑒定出點(diǎn)突變等優(yōu)點(diǎn)。

逆轉(zhuǎn)錄病毒或者轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的插入突變技術(shù)也被用于斑馬魚反向遺傳篩選[30]。與正向遺傳學(xué)方法不同，這種篩選并非基于表型主導(dǎo)的突變基因發(fā)掘，而是從已知插入序列出發(fā)，直接尋找突變庫中可能存在的目的基因突變。北京大學(xué)、美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)、加州大學(xué)洛杉磯分校(UCLA)等機(jī)構(gòu)合作，利用小鼠白血病病毒構(gòu)建斑馬魚插入突變庫，液氮凍存F1代精子后通過側(cè)翼序列檢測技術(shù)分析外源DNA的插入位點(diǎn)[31, 32]，研究人員可選擇目標(biāo)基因攜帶外源插入的F1精子復(fù)蘇開展進(jìn)一步基因功能研究。與此類似，有研究者利用Tol2和睡美人轉(zhuǎn)座子插入突變構(gòu)建了斑馬魚插入突變庫[33, 34]。

基于ENU誘變的TILLING技術(shù)、逆轉(zhuǎn)錄病毒或轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的插入突變在應(yīng)用到斑馬魚反向遺傳篩選時(shí)，需要耗費(fèi)大量的人力物力用以建立大規(guī)模突變庫；另一方面，篩選過程也相對耗時(shí)費(fèi)力。人工靶向核酸酶技術(shù)的出現(xiàn)，開創(chuàng)了快速、定向突變特定基因、獲得穩(wěn)定突變品系的新紀(jì)元。對于每一種人工靶向核酸酶技術(shù)，斑馬魚都是作為最早實(shí)現(xiàn)該技術(shù)的模式動(dòng)物之一。

鋅指核酸酶(zinc finger nucleases，ZFN)技術(shù)的出現(xiàn)使得斑馬魚中的定點(diǎn)突變成為可能。Chandrasegaran實(shí)驗(yàn)室首次將能夠識別特異性DNA序列的鋅指核酸酶和FokI核酸內(nèi)切酶酶切結(jié)構(gòu)域融合，使得人工定制識別特定DNA靶位的內(nèi)切酶成為可能[35]：鋅指核酸酶的DNA結(jié)合域能夠特異性的識別靶位點(diǎn)序列，引導(dǎo)FokI核酸內(nèi)切酶對靶位點(diǎn)進(jìn)行酶切，形成DNA雙鏈斷裂(DSBs)，細(xì)胞采取非同源末端修復(fù)的機(jī)制修補(bǔ)DSBs時(shí)，常伴有堿基片段的插入或缺失從而導(dǎo)致靶基因的突變。利用ZFN技術(shù)，在斑馬魚中已經(jīng)建立了多種定點(diǎn)基因敲除突變品系，例如ntl和kdr等突變品系[36, 37]。但是由于鋅指核酸酶的DNA結(jié)合域構(gòu)建難度較大，識別效率較低，在TALEN(transcription activator-like effector nuclease)技術(shù)出現(xiàn)后被迅速取代。TALEN技術(shù)是將TALE因子的DNA結(jié)合域與FokI的DNA切割域融合，同樣能夠特異性切割靶序列造成基因突變[38, 39]。北京大學(xué)的張博實(shí)驗(yàn)室是世界上最早使用TALEN技術(shù)在斑馬魚中實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)誘變的實(shí)驗(yàn)室之一[40, 41]。最近，他們利用TALEN技術(shù)結(jié)合長片段同源序列介導(dǎo)的DNA重組，實(shí)現(xiàn)了對斑馬魚中3個(gè)基因的同源重組基因打靶[42]。與ZFN技術(shù)相比，TALEN技術(shù)具有TALE模塊識別關(guān)系簡單、構(gòu)建相對快捷、識別效率高、非特異性結(jié)合少等優(yōu)勢。然而，TALEN依然需要根據(jù)靶位點(diǎn)的DNA序列進(jìn)行特異性TALE模塊的設(shè)計(jì)和構(gòu)建，這一步驟相對復(fù)雜和費(fèi)時(shí)，限制了該技術(shù)高通量應(yīng)用的前景。

近年來，一種新興的定向基因敲除技術(shù)，CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9技術(shù)，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于各種生物中[43-46]。CRISPR/Cas系統(tǒng)源于細(xì)菌中的原始獲得性免疫機(jī)制[47]。該技術(shù)只需將特異性識別靶位點(diǎn)的導(dǎo)向RNA(gRNA)和表達(dá)Cas9核酸內(nèi)切酶的RNA或表達(dá)載體共同導(dǎo)入胚胎或細(xì)胞，利用gRNA在染色體上識別靶點(diǎn)并引導(dǎo)Cas9切割靶點(diǎn)DNA而產(chǎn)生突變。北京大學(xué)熊敬維等實(shí)驗(yàn)室也是最早在斑馬魚中實(shí)現(xiàn)CRISPR/Cas9敲除技術(shù)的實(shí)驗(yàn)室之一[46, 48]。由于CRISPR/Cas9技術(shù)的靶序列識別是由gRNA與靶點(diǎn)DNA的一一對應(yīng)來實(shí)現(xiàn)的，無需構(gòu)建復(fù)雜的識別模塊，所以操作更簡便、快捷，有可能應(yīng)用于高通量的基因敲除。同時(shí)，由于CRISPR/Cas9技術(shù)識別和切割雙鏈DNA的效率非常高，為利用其造成的靶位DSBs進(jìn)行更深入的基因組編輯提供了條件，例如使用2個(gè)或多個(gè)gRNA引導(dǎo)多位點(diǎn)酶切造成大片段缺失或多基因的平行編輯，以及在雙鏈斷裂處插入外源DNA序列等。

1.3 條件性轉(zhuǎn)基因資源的開發(fā)

條件性轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)時(shí)空特異地表達(dá)或關(guān)閉特定基因，因此利用這一類技術(shù)可以更為深入地研究目標(biāo)基因及相關(guān)生物學(xué)過程。Gal4/UAS和Cre/loxP系統(tǒng)是最被廣泛使用的條件性轉(zhuǎn)基因技術(shù)。Gal4/UAS 系統(tǒng)中，需要構(gòu)建兩種不同的轉(zhuǎn)基因品系，其中一個(gè)品系組織特異性表達(dá)或者誘導(dǎo)表達(dá)酵母轉(zhuǎn)錄因子Gal4；另一個(gè)品系中的目的基因受到Gal4蛋白識別的UAS序列的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。在這兩個(gè)品系雜交后獲得的子代中，目的基因僅在Gal4表達(dá)的細(xì)胞中得以表達(dá)。Campos-Ortega實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建了鯉魚β-actin啟動(dòng)子和SVTK啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的Gal4轉(zhuǎn)基因品系和UAS-myc-notch1:intra轉(zhuǎn)基因品系，通過雜交首次在斑馬魚中實(shí)現(xiàn)了由Gal4表達(dá)驅(qū)動(dòng)的目標(biāo)基因表達(dá)[49]。與Gal4/UAS 系統(tǒng)相類似，Cre/loxP系統(tǒng)需要獨(dú)立構(gòu)建兩個(gè)不同的轉(zhuǎn)基因品系：一個(gè)轉(zhuǎn)基因品系中表達(dá)噬菌體Cre重組酶，另一個(gè)轉(zhuǎn)基因品系基因組中引入被Cre酶所識別的loxP序列。在這兩個(gè)品系雜交的后代中，誘導(dǎo)表達(dá)的Cre重組酶可以將loxP位點(diǎn)之間的靶序列切除，從而實(shí)現(xiàn)靶基因在特定時(shí)間和組織中的失活或表達(dá)[50]。利用該系統(tǒng)，Zon實(shí)驗(yàn)室在斑馬魚中誘導(dǎo)表達(dá)了人類原癌基因kras和myc從而構(gòu)建可誘導(dǎo)的腫瘤模型[51]。我們在斑馬魚中建立了原始生殖細(xì)胞中高效、特異的Cre/loxP和Gal4/UAS條件性基因表達(dá)和轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)[52]，這將為更高效獲得具備生殖傳遞能力的轉(zhuǎn)基因和突變品系提供技術(shù)平臺。

2 斑馬魚資源的開發(fā)現(xiàn)狀

近十多年來，隨著斑馬魚研究領(lǐng)域的拓展，研究技術(shù)的發(fā)展和新遺傳學(xué)工具的涌現(xiàn)，各種斑馬魚突變庫的規(guī)?；瘎?chuàng)建成為新的熱點(diǎn)[53]。英國Sanger研究所開展的ZMP(Zebrafish Mutation Project，http://www.sanger.ac.uk/Projects/D_rerio/zmp/)計(jì)劃是一項(xiàng)基于ENU誘變的大規(guī)模斑馬魚突變篩選計(jì)劃[54]。近年來，該項(xiàng)目使用高通量測序技術(shù)對突變品系庫進(jìn)行全基因組測序，試圖獲得該品系庫所攜帶的全部突變信息并建立相應(yīng)的突變品系。目前該計(jì)劃已經(jīng)篩選檢測到約24000多種突變，相應(yīng)的品系建立工作也在進(jìn)行中。

美國麻省理工學(xué)院的Hopkins實(shí)驗(yàn)室利用逆轉(zhuǎn)錄病毒大規(guī)模插入誘變技術(shù)、構(gòu)建了斑馬魚插入突變品系資源庫(http://web.mit.edu/hopkins/)。基于表型篩選的方法已經(jīng)篩選得到約340個(gè)突變品系[55]。同時(shí)，美國NIH、北京大學(xué)、美國UCLA等的多個(gè)實(shí)驗(yàn)室共同努力，在NIH和中國國家自然科學(xué)基金委員會(huì)的共同資助下，利用高通量逆轉(zhuǎn)錄病毒插入突變技術(shù)，展開了構(gòu)建斑馬魚插入突變資源庫的工作。目前，該計(jì)劃已獲得約3000多個(gè)斑馬魚的基因突變[32]。

美國NIH資助了斑馬魚TILLING計(jì)劃(Zebrafish TILLING Project，http://webapps.fhcrc.org/science/tilling/)。該計(jì)劃由Moens和Solnica-Krezel兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室共同主持。與ZMP相類似，基于ENU誘變技術(shù)和改進(jìn)后的TILLING技術(shù)，應(yīng)用下一代測序，直接從1萬多株突變斑馬魚中尋找特定突變。該計(jì)劃為同行提供特定基因的無義突變篩選服務(wù)，現(xiàn)已成功獲得100多個(gè)基因的無義突變品系。研究人員可以向這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室直接索取這些斑馬魚突變體。

2010 年，歐盟啟動(dòng)了ZF-HEALTH(Zebrafish Regulomics for Human Health)計(jì)劃(http://zf-health.org/)。該計(jì)劃使用高通量行為學(xué)和形態(tài)學(xué)檢測，對與人類疾病相關(guān)的基因突變進(jìn)行表型檢測和小分子藥物篩選。其目標(biāo)是在斑馬魚中篩選到人類疾病相關(guān)基因的突變體和基因表達(dá)調(diào)控相關(guān)的元件，為建立疾病模型和篩選先導(dǎo)藥物提供基礎(chǔ)。該計(jì)劃預(yù)期篩選1000種與人類疾病相關(guān)的斑馬魚突變品系。

2011年，國際斑馬魚蛋白誘捕協(xié)會(huì)(International Zebrafish Protein Trap Consortium)的多家實(shí)驗(yàn)室共同合作, 利用Tol2、睡美人等轉(zhuǎn)座子插入突變技術(shù)構(gòu)建了zfishbook 插入突變數(shù)據(jù)庫(http://www.zfishbook.org/)[56]。目前，該計(jì)劃已公布了736個(gè)插入突變品系。

2013年，我國的近40家實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合啟動(dòng)了斑馬魚1號染色體全基因敲除項(xiàng)目(http://www.zfish.cn/TargetList.aspx)。該項(xiàng)目使用CRISPR/Cas9技術(shù)，對斑馬魚1號染色體上的1333個(gè)基因進(jìn)行系統(tǒng)敲除。基因敲除后產(chǎn)生的斑馬魚突變品系，將被提交到CZRC進(jìn)行整理和保藏，并向全球?qū)W術(shù)界公開。預(yù)計(jì)在項(xiàng)目完成后，CZRC將儲備斑馬魚1號染色體上80%以上的基因突變品系。

3 斑馬魚資源的保藏

3.1 世界范圍內(nèi)斑馬魚研究資源的保藏

鑒于斑馬魚作為模式動(dòng)物的重要作用和獨(dú)特地位，在全球范圍內(nèi)，美國、歐洲、日本、澳大利亞、我國臺灣等國家和地區(qū)也已設(shè)立有其斑馬魚資源中心。目前，這些中心保藏的大量斑馬魚品系、cDNA、工具載體、抗體等方面的資源，通過收取服務(wù)費(fèi)的方式提供給研究同行。

斑馬魚作為重要模式動(dòng)物的一大優(yōu)勢是可體外受精，精子可凍存保藏。斑馬魚精子凍存技術(shù)始于1982年，Harvey等以甲醇作為抗凍劑，冷凍保存斑馬魚精液，獲得57%的受精率[57]。斑馬魚精子的超低溫保藏，現(xiàn)在已有較成熟的技術(shù)操作規(guī)范[58]。保藏的精子在穩(wěn)定的液氮環(huán)境下可保持活性10年以上，復(fù)蘇后的平均受精率依然可達(dá)30%以上[59]。這為低成本、規(guī)模化、長期地保藏斑馬魚品系資源提供了條件。

現(xiàn)在全球最具影響力的斑馬魚資源中心，是位于美國俄勒岡州的國際斑馬魚資源中心(International Zebrafish Resource Center，http://www.zebrafish.org，以下簡稱ZIRC)。ZIRC成立于1999年，現(xiàn)在保藏有全球斑馬魚研究者提供的將近2萬個(gè)野生型、基因突變和轉(zhuǎn)基因魚品系。同時(shí)ZIRC還提供斑馬魚cDNA、抗體資源，以及養(yǎng)殖、疾病等方面的咨詢服務(wù)。繼ZIRC之后，歐洲、澳洲、日本、臺灣等國家和地區(qū)都相繼成立了提供斑馬魚資源保藏和服務(wù)的資源庫，但規(guī)模都遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于ZIRC。

3.2 我國斑馬魚研究資源保藏情況

在我國，自上世紀(jì)90年代開始有研究者采用斑馬魚為模式動(dòng)物開展有關(guān)研究工作。研究方向涉及遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、腫瘤學(xué)、再生與干細(xì)胞、疾病模型和藥物研發(fā)、水產(chǎn)性狀改良、環(huán)境水質(zhì)監(jiān)測、毒理學(xué)等方面。2014年10月，由中國科學(xué)院水生生物所主辦，在武漢召開的第二屆全國斑馬魚PI大會(huì)上，有來自全國各地各研究方向的150多位學(xué)者與會(huì)。粗略估算，中國現(xiàn)在以斑馬魚為工具進(jìn)行研究的各種實(shí)驗(yàn)室超過300家。中國斑馬魚實(shí)驗(yàn)室不僅在數(shù)量上增加迅速，其研究方向的發(fā)展也和國際同步，涉及斑馬魚研究的方方面面。

據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，目前散布在我國各個(gè)實(shí)驗(yàn)室的各類斑馬魚突變或轉(zhuǎn)基因穩(wěn)定遺傳品系已有500余種。中國迫切需要建設(shè)國家級的斑馬魚資源中心，以更加高效整合、收集、創(chuàng)制、保藏、分享斑馬魚研究資源。在朱作言、孟安明、彭金榮等學(xué)者的大力推動(dòng)下，國家斑馬魚資源中心(CZRC)于2012 年10 月在中國科學(xué)院水生生物研究所正式掛牌成立。CZRC現(xiàn)在擁有近600平米的建設(shè)空間，已建設(shè)了總面積達(dá)300平米的主魚房，總?cè)萘砍^1萬缸。并裝備了設(shè)備間、顯微操作間、外部隔離魚房、育苗室、顯微鏡間、細(xì)胞培養(yǎng)間、超低溫保藏間、和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室等條件。CZRC完全建設(shè)完成后，可容納數(shù)千個(gè)活體保藏品系和數(shù)以萬計(jì)的精子凍存品系。

2012年10月，國家斑馬魚資源中心第一屆理事會(huì)在中科院水生所成立，制定了CZRC章程。該章程規(guī)范了CZRC主要任務(wù)，具體如下：1)負(fù)責(zé)我國斑馬魚研究資源的收集、創(chuàng)制、整理、鑒定和保存，建立斑馬魚研究資源的國家級安全保存體系；2)在簽訂相關(guān)協(xié)議的基礎(chǔ)上，負(fù)責(zé)與國際上其他斑馬魚研究資源庫進(jìn)行資源的引進(jìn)與交流；3)負(fù)責(zé)國家斑馬魚資源中心數(shù)據(jù)庫和網(wǎng)站(http://www.zfish.cn)的建設(shè)和維護(hù)，整合國內(nèi)斑馬魚研究和資源信息；4)在保護(hù)生物安全和尊重知識產(chǎn)權(quán)的前提下，向我國各科研機(jī)構(gòu)、大專院校和科普基地等提供可利用的斑馬魚資源材料及相關(guān)信息； 5)開展斑馬魚研究資源保護(hù)和開發(fā)的基礎(chǔ)理論與技術(shù)方法的研究；6)向國內(nèi)研究者提供斑馬魚研究相關(guān)的技術(shù)培訓(xùn)和技術(shù)服務(wù)。

CZRC成立2年以來，已建立了成熟的斑馬魚養(yǎng)殖規(guī)范、精子凍存技術(shù)、基于TALEN和CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基因敲除技術(shù)，和基于原始生殖細(xì)胞操作的轉(zhuǎn)基因和基因敲入技術(shù)。截止2014年底，中心活體保藏有300多個(gè)斑馬魚轉(zhuǎn)基因和基因突變品系。2年來，共向國內(nèi)外斑馬魚研究人員提供了1000多人次資源和技術(shù)服務(wù)。自斑馬魚1號染色體全基因敲除計(jì)劃啟動(dòng)以來，CZRC獨(dú)立承擔(dān)了50多個(gè)基因的敲除品系構(gòu)建，和全部品系的整理、保藏和公布的工作。預(yù)期到2015年底，CZRC所保藏的各類斑馬魚品系將超過2000個(gè)，成為亞洲最大的斑馬魚資源中心。CZRC還將繼續(xù)開發(fā)更多具有自主知識產(chǎn)權(quán)的斑馬魚品系。

同時(shí)，因應(yīng)中國斑馬魚科研領(lǐng)域快速發(fā)展的需求，CZRC將每年舉辦斑馬魚養(yǎng)殖、品系構(gòu)建、超低溫保藏、常規(guī)遺傳和發(fā)育操作、常見魚病鑒定和處理、常規(guī)分子生物學(xué)和影像學(xué)等方面的技術(shù)培訓(xùn)。CZRC期望為中國的斑馬魚研究的發(fā)展提供全面的資源與技術(shù)服務(wù)。

4 總結(jié)

與其他經(jīng)典的模式動(dòng)物相比，斑馬魚的應(yīng)用歷史并不長，但斑馬魚研究領(lǐng)域的發(fā)展最為迅速[6]，前景非常廣闊。在全球范圍內(nèi)，開發(fā)和利用斑馬魚資源往往成為新興的科研熱點(diǎn)。我國的斑馬魚研究在最近10年間已有長足的發(fā)展。對斑馬魚研究資源的開發(fā)、保藏和利用進(jìn)行大規(guī)模的投入，將對我國相關(guān)領(lǐng)域的科研工作起到極大的推動(dòng)作用。隨著我國國家斑馬魚資源中心資源保有量、技術(shù)和服務(wù)水平的提升，我們相信我國利用斑馬魚為模式動(dòng)物的科研工作將會(huì)得到更快和更好的發(fā)展，我們也期待更多精彩的研究成果在斑馬魚研究領(lǐng)域不斷涌現(xiàn)。

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