姜晨晨，彭宗根

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所，北京 100050)

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV) 屬于黃病毒科，肝炎病毒屬，為有包膜的單股正鏈RNA病毒，全長約9.6 kb[1]。它是引發(fā)肝臟疾病的主要病因之一，極易發(fā)展為慢性肝炎、肝纖維化、肝硬化、甚至肝癌[2, 3]。全世界約有1.7億慢性感染人群，每年死亡人數(shù)超過35萬[4]。到目前為止尚無預(yù)防HCV感染的疫苗，而現(xiàn)有的干擾素與利巴韋林聯(lián)合的標(biāo)準(zhǔn)治療方案治療效果有限[5]。近來研制的直接抗病毒藥物(DAAs)顯著提高了抗病毒療效，但也不同程度地會誘導(dǎo)耐藥的產(chǎn)生。因此，HCV的感染仍然嚴(yán)重威脅著人們的健康，發(fā)現(xiàn)新型治療方案和研發(fā)新型藥物迫在眉睫[6-8]。然而，HCV研究和相關(guān)藥物研發(fā)嚴(yán)重滯后，其主要原因為缺乏理想的研究模型，特別是動物模型[9]。目前，黑猩猩是用于HCV自然感染研究的重要模型動物[10-11]，然而由于其有諸多限制，發(fā)展新型實驗動物模型迫在眉睫。近年來，以嚙齒類等動物為替代模型取得了不少進展，應(yīng)用轉(zhuǎn)基因等實驗技術(shù)使替代動物感染了HCV，并成功應(yīng)用于多個學(xué)科領(lǐng)域的研究。本文分析了 HCV自然感染的實驗動物、自然感染和非自然感染的替代實驗動物在致病機制研究、藥物評價和疫苗研發(fā)應(yīng)用中的優(yōu)缺點及未來研究趨勢。

1 HCV自然感染的動物模型

眾所周知，在體內(nèi)系統(tǒng)中，HCV復(fù)制相關(guān)的研究比較困難，這就嚴(yán)重阻礙了更為有效的新型治療方法的進展[12]。到目前為止，HCV僅能感染除人類之外的極少數(shù)物種，如黑猩猩以及非嚙齒類的小型哺乳動物樹鼩等[10, 13]。

1.1 黑猩猩

黑猩猩與HCV的發(fā)現(xiàn)史密切相關(guān)[14]，是研究病毒與宿主抗病毒免疫反應(yīng)的關(guān)系、免疫發(fā)病機制及預(yù)防性疫苗評價的最佳模型動物[15]。但人和黑猩猩感染HCV后的臨床癥狀有所不同[16]，如HCV慢性感染在人身上的發(fā)病率高達80%，而在黑猩猩上卻只有30%～40%[17]；并且HCV慢性感染后的黑猩猩并不會發(fā)展為肝纖維化及肝硬化，而是一些相對較溫和的癥狀[18]。盡管如此，相關(guān)研究也極大地提高了我們對HCV感染過程中機體免疫應(yīng)答的認(rèn)識[19]。在黑猩猩體內(nèi)記憶T細胞、NK細胞以及I型/Ⅱ型干擾素可阻止HCV的再次感染[20]；此外，中和抗體雖能預(yù)防動物感染HCV，但在人體內(nèi)的預(yù)防效果卻不理想[21]。雖然有此不足之處，黑猩猩仍然是用于HCV研究的重要模型動物，是其他動物模型的一個金標(biāo)準(zhǔn)。然而黑猩猩作為瀕臨滅絕的物種且價格昂貴，并受到倫理上的爭議，使得其在生物醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用受到了極大的限制[22]。因此，發(fā)展合適的替代動物模型用于HCV相關(guān)的研究迫在眉睫。

1.2 樹鼩

樹鼩是一種非嚙齒類小型哺乳動物，能自然感染HCV，可用于HCV感染研究[23]。人或小鼠細胞表達來源于樹鼩的HCV進入因子CD81、SR-B1、CLDN1和OCLN能夠促進HCV假病毒顆?；蛘逪CVcc進入，樹鼩的原代肝細胞可感染HCVcc并能產(chǎn)生具有感染性的子代病毒[24]。但樹鼩對HCV的感染率較低，且病毒血癥很弱并極少能夠保持下去[23]，即使能夠在HCV感染的動物中檢測到肝損傷及HCV core蛋白的表達，但在血清中卻檢測不到HCV RNA以及抗HCV的抗體。盡管樹鼩在獲取方面比黑猩猩要簡單得多，然而也受到了飼養(yǎng)的費用高以及所用試劑的特殊性的限制[11]。

1.3 自然感染的替代動物模型

1.3.1 狨猴和小娟猴

狨猴和小娟猴是一種小型靈長類動物，易感GB病毒B型(GBV-B)，這是一種與HCV同源性較近的且能誘發(fā)其病毒性肝炎的黃病毒科病毒，這使得狨猴與小娟猴有可能成為HCV自然感染的替代模型[25]。但GBV-B與HCV間存在一定的差異[26]，GBV-B與HCV的多聚蛋白同源性很低(25%～30%)，而在5’及3’非編碼區(qū)的同源性則更少，使得GBV-B用于抗HCV藥物研發(fā)上存在局限性。為克服這些不足之處，將HCV結(jié)構(gòu)蛋白基因(CE1E2p7)或是完整的包膜蛋白基因(E1E2p7)替代GBV-B上對應(yīng)的基因，構(gòu)建了兩種HCV/GBV-B嵌合體，其可在肝細胞內(nèi)復(fù)制及表達并能釋放到外周血中。研究結(jié)果顯示，在所有HCV嵌合體感染的狨猴體內(nèi)可被刺激產(chǎn)生特異性的免疫反應(yīng)[27]，提供了檢驗抗HCV療法的新模型。但此模型存在一定的使用限制，因為這些病毒并不能夠完全模仿HCV的復(fù)制周期，以及嵌入到GBV-B序列中的HCV部分不能精確的反應(yīng)其在HCV基因組中所起的作用。雖然如此，也為我們提供了一個新型的用于研究病毒宿主相互作用、研發(fā)疫苗及抗HCV藥物的替代黑猩猩的小型動物模型。

1.3.2 犬科/非靈長類丙型肝炎病毒

犬科丙型肝炎病毒(CHV)是從狗的呼吸道中分離出來的，是演化中與HCV最為相近的病毒[13]，其自然感染的宿主范圍更廣，實驗驗證CHV可引發(fā)病毒性肝炎。與之非常相近的非靈長類丙肝病毒(NPHV)也已在馬體內(nèi)得到了鑒定[28]。這些新型肝炎病毒的遺傳學(xué)及生物學(xué)特征將會增進人們對人類感染HCV起源的認(rèn)識，也因此可能發(fā)展為新型替代動物模型。

2 非自然感染的嚙齒類替代動物模型

小鼠和大鼠能夠自然抵抗HCV的感染，其肝細胞不支持HCV的進入和復(fù)制[29]。在鼠科動物細胞內(nèi)，HCV不能完成其復(fù)制循環(huán)，其感染程度也因物種而異[30]。值得注意的是，相比于HCV復(fù)制的早期階段，在小鼠肝細胞中HCV的組裝與釋放并不受到限制[31, 32]。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的出現(xiàn)，逐漸出現(xiàn)了用于HCV感染的多種小鼠模型。攜帶HCV不同基因片段的轉(zhuǎn)基因小鼠成為第一個可用來研究HCV與宿主相互關(guān)系的模型[11, 33]。這些小鼠可呈現(xiàn)出模仿人類疾病的肝臟病理學(xué)，主要為脂肪肝及早期肝癌。因此，研究工作將進一步集中于通過異種移植人類細胞或轉(zhuǎn)基因等手段人源化小鼠或者大鼠，發(fā)展能夠支持HCV感染的嚙齒類動物模型。

2.1 uPA-SCID小鼠模型

uPA-SCID小鼠由于其肝臟內(nèi)過量表達尿激酶型纖溶酶原激活劑(uPA)而能夠有效地移植人源肝細胞繼而易感染HCV。這種人肝臟嵌合小鼠對HCV易感， 感染后病毒滴度高達107IU/mL，且可持續(xù)10個月之久[34, 35]。因此這種小鼠模型可用于評價HCV感染的預(yù)防或治療。

首先是用于評價預(yù)防HCV的感染[36]。HCV的進入是病毒感染中極為重要的一步，其可被結(jié)合到病毒顆粒上的中和抗體或者以宿主進入因子為靶標(biāo)的單克隆抗體阻止。在uPA-SCID小鼠模型中這些抗體結(jié)合到包膜糖蛋白E2并能阻止多種HCV基因型的感染。針對HCV進入因子如CD81及SRBI的單克隆抗體已成功在嵌合的uPA-SCID小鼠中得到了檢驗，它能夠有效抑制不同基因型的HCV的感染。此外，HCV感染3 d的肝臟嵌合小鼠，若每天注射400μg的抗SR-BI的單克隆抗體，連續(xù)5 d便可治愈[37]。uPA-SCID小鼠模型也已成功用于評價小分子及其他以宿主進入因子為靶點的藥物[38，39]，此即uPA-SCID小鼠模型與其他小鼠模型相比的優(yōu)勢所在。

uPA-SCID小鼠模型也成功用于評價以病毒復(fù)制酶為靶標(biāo)的直接抗病毒藥物。蛋白酶抑制劑BILN2061就是通過這個模型篩選而來的，用藥4 d后病毒載量明顯降低，但導(dǎo)致心肌細胞惡化，同樣在恒河猴中也得到了驗證，后來因其心臟毒性而停止臨床研究[40]。近來，臨床上認(rèn)可的NS3-4A蛋白酶抑制劑特拉匹韋(Telaprevir)單獨使用或與NS5B抑制劑MK-0608聯(lián)用同樣通過這個模型進行藥效學(xué)評價[41]。此外，Shi等[42]利用這個小鼠模型，將NS3蛋白酶抑制劑BMS-605339、NS5A抑制劑BMS-788329和NS5B非核苷類似物抑制劑BMS-821095聯(lián)用以評價其抗病毒活性，結(jié)果顯示藥物聯(lián)用能有效抑制HCV基因1b型卻不能抑制2a和2b型。

盡管uPA-SCID小鼠已被證明其有效性，對臨床前藥物評價也具有重要意義，但是其應(yīng)用仍具有限制性。首先是uPA-SCID小鼠的死亡率很高，且移植需要在其生下來的兩周內(nèi)進行，因其生來就是肝細胞致死性的表型[34]。其次，部分小鼠uPA轉(zhuǎn)基因也容易丟失，出現(xiàn)一定程度的免疫功能恢復(fù)，此為SCID小鼠滲漏現(xiàn)象，但不遺傳，只與小鼠年齡、品系、飼養(yǎng)環(huán)境有關(guān)。再次，這個動物模型缺乏功能性的適應(yīng)性免疫，不能產(chǎn)生功能性的T細胞和B細胞，因此不能將其用于適應(yīng)性免疫反應(yīng)的研究。

2.2 MUP-uPA/SCID/Bg轉(zhuǎn)基因小鼠

MUP-uPA基因結(jié)構(gòu)包含MUP增強子/啟動子及全部的小鼠uPA基因編碼序列，而SCID/Bg轉(zhuǎn)基因小鼠能表達分泌型人uPA，將MUP-uPA小鼠與SCID/Bg背景的BALB/c小鼠雜交[43]，不僅新生鼠的死亡率低，人類肝細胞移植過程中其死亡率也很低，且該轉(zhuǎn)基因小鼠對HCV感染的敏感程度與黑猩猩相近[44]，因此可以取代黑猩猩進行一系列的研究工作。在HCV基因1a型感染的小鼠體內(nèi)可檢測到病毒滴度為103～4/mL，且2個月內(nèi)都可檢測到，感染HCV其他基因型的小鼠體內(nèi)同樣也可檢測到病毒。

MUP-uPA/SCID/Bg小鼠模型彌補了Alb-uPA小鼠的一些缺陷[11]，這些轉(zhuǎn)基因小鼠即使不移植人肝細胞也能健康的存活至少一年，這就使得人類肝細胞的移植、HCV病毒的感染等操作可在其4～12月時進行，由于移植時已為成年鼠，使得手術(shù)程序變得簡單及實驗死亡率也大大降低。這種小鼠模型將會在HCV感染引起的免疫反應(yīng)、免疫發(fā)病機制及疫苗研發(fā)中發(fā)揮極大的作用。

2.3 Fah-/-Rag2-/-γ-c-/-(FRG)小鼠模型

FRG小鼠免疫缺陷現(xiàn)象更為嚴(yán)重，由于它們?nèi)鄙賀ag2重組酶、白細胞介素的γ鏈以及酪氨酸分解代謝酶(Fah)，若停用肝臟保護藥物NTBC，則導(dǎo)致小鼠在停藥4～8周后死亡，這可能是由于DNA修復(fù)缺陷造成的?；谶@種機制，F(xiàn)RG小鼠可有效地移植人肝細胞獲得肝臟的再生[45]。FRG小鼠模型在多個方面優(yōu)于uPA小鼠模型，首先，肝臟壞死的程度及選擇壓力可通過控制NTBC是否使用來實現(xiàn)。其次，F(xiàn)ah-缺陷突變是一種去除型突變，因此不能因轉(zhuǎn)基因的失活而回復(fù)突變成野生型。因此，人類肝細胞在這類小鼠體內(nèi)的移植時間相對于uPA-SCID小鼠來說更加方便，可在其成年鼠的任一階段進行以及連續(xù)移植也是可行的。Bissig 等應(yīng)用這種模型成功地感染了HCV基因2a型JFH-1株和HCV基因1a型臨床分離株及基因1a/2a和1b/2a嵌合株。但這種小鼠模型存在一個明顯的缺陷，由于Rag2及γ-c的缺失，小鼠沒有T細胞、B細胞和NK細胞，不能用于HCV感染的適應(yīng)性免疫研究，因此不適于HCV的免疫致病機理的研究以及疫苗的研發(fā)與評價。

2.4 AFC8-huHSC/Hep小鼠

為克服uPA-SCID及FRG小鼠模型內(nèi)在免疫缺失的不足，AFC8-huHSC/Hep小鼠模型應(yīng)運而生。這種小鼠模型基于免疫缺陷的Balb/c Rag2-/-γ-c-/-(BRG)小鼠，能在肝臟中過表達FKPB和AFC8融合蛋白[46]。注射AP20187可誘導(dǎo)caspase-8活性域的二聚化以激發(fā)這個酶的自噬活性及小鼠肝細胞的死亡[47]，這種誘導(dǎo)性的肝臟缺陷有利于人肝細胞的移植。因此，這些轉(zhuǎn)基因小鼠適于在5 d鼠齡時移植源于嬰兒肝臟的且與其組織相容性抗原(HLA)匹配的人肝細胞及CD34+造血干細胞。約有50% AFC8-huHSC/Hep小鼠可感染從丙肝病人血清中分離的基因1a型HCV，但HCV RNA只能在這些動物的肝臟中檢測到，而在血液中卻檢測不到。盡管其缺乏病毒血癥，但是HCV陽性小鼠肝臟中存在人免疫細胞滲透及HCV特異的CD4、CD8 T細胞反應(yīng)。且半數(shù)HCV陽性小鼠會發(fā)展為肝纖維化，這是HCV首次在小型動物模型感染上呈現(xiàn)了HCV特異性的適應(yīng)性免疫以及首次誘導(dǎo)了免疫致病機制。

從改革開放以來中國社會發(fā)展與進步的歷程來看，城鄉(xiāng)基層治理一直是中國社會治理改革的實驗基地，因此任何對中國治理體系的研究都繞不開對農(nóng)村和城市基層治理的關(guān)注，從政治學(xué)視角研讀新漢學(xué)，更是繞不開基層治理這樣一個突破口。

盡管這種小鼠在研究HCV感染的具有完全免疫活性小鼠模型上具有重大突破，但不足的是無血清HCV和缺失功能性B細胞，然而這卻是評價潛在抗病毒藥物及疫苗的重要因素之一。此外，雖然對來源于人HSC的免疫系統(tǒng)已在鼠科主要組織相容性復(fù)合物上進行了研究，但是人免疫細胞在小鼠上是否能夠識別HCV感染的HLA表達的人肝細胞仍不清楚[48]。

2.5 Rosa26-Fluc HCV進入因子人源化小鼠

暨AFC8-huHSC/Hep小鼠模型之后，另一種對HCV易感且具有免疫活性的小鼠模型隨之產(chǎn)生，與之前的模型相比較，此模型具有完整的免疫系統(tǒng)及肝臟。為了克服病毒進入的種屬特異性及實現(xiàn)小鼠肝臟對于HCV的易感性，Dorner等在小鼠體內(nèi)肝細胞中轉(zhuǎn)染腺病毒載體來表達產(chǎn)生HCV的進入因子CD81、SR-BI、CLDN1和OCLN[29]，約有5%的小鼠肝細胞能完全表達這四種進入因子，且能檢測到病毒入侵。鑒于HCV在小鼠體內(nèi)并不能高效復(fù)制，Dorner等重新設(shè)計病毒使之進入小鼠肝臟后能夠表達HCV-Core蛋白，表達后將會導(dǎo)致loxP-flanked熒光素酶報告基因在Rosa26-Fluc小鼠中表達，其表達強度反應(yīng)了病毒入侵肝細胞的復(fù)制能力[49]。這個動物模型首次用于研究不同基因型的HCV嵌合體在生物體內(nèi)入侵肝細胞，并成功地評估了抗CD81、E2抗體的抗HCV復(fù)制作用。這是第一例報道的用于研究HCV感染的具有完全免疫活性的小動物模型，且到目前為止，這個模型也是唯一有效的與免疫相關(guān)的小鼠模型，同時它也是免疫系統(tǒng)與感染的肝細胞間的主要組織相容性復(fù)合體有較好的匹配度的小鼠模型，使我們能更好的認(rèn)識由病毒誘導(dǎo)的全部免疫反應(yīng)。

但是該小鼠模型也存在其局限性[50]。首先，由于這些細胞內(nèi)病毒復(fù)制效率較低，導(dǎo)致感染小鼠肝細胞中檢測不到病毒產(chǎn)物，這使得這種模型并不適于直接抗病毒藥物(DAAs)或以病毒周期中組裝及釋放為靶點的抗病毒藥物的篩選。其次，通過腺病毒載體引入人源的進入因子會引起小鼠對這些載體的免疫排異反應(yīng)。因此，此模型不適于研究HCV誘導(dǎo)的免疫學(xué)發(fā)病機制。盡管如此，利用人進入因子的轉(zhuǎn)基因小鼠的后續(xù)研究，具有深入探索HCV的發(fā)病機制的潛在價值。

2.6 免疫活性大鼠模型

不排異人肝細胞且易感HCV的大鼠可作為具有免疫活性的小動物模型[51]。胎鼠在妊娠15～17天時腹腔注射人Huh7細胞以誘導(dǎo)對這些細胞的免疫耐受，因而在新生鼠24 h內(nèi)可通過腹腔注射移植Huh7細胞。這些大鼠在移植一周后接種從血清中分離的基因1型HCV，能夠出現(xiàn)一過性的病毒血癥，且在12周的時候HCV病毒載量可達2×104/mL[52]。

不幸的是，這個模型由于腹膜注射存在危險性而使其建立具有一定的困難。此外，由于移植的細胞是肝癌細胞系而非人原始的肝細胞，使得這個模型受到了使用限制。而且，與HCV感染的患者或是人肝臟細胞嵌合的小鼠相比，此模型中移植外源細胞的數(shù)量低且病毒血癥很弱，約在2×104/mL左右。盡管這個模型具有免疫活性且可被HCV感染，但是人HLA與大鼠MHC不匹配阻止了其在感染的肝癌細胞中開展適應(yīng)性免疫的研究。

3 HCV感染動物模型的未來發(fā)展方向

過去幾年內(nèi)，在發(fā)展新型動物模型以研究HCV-宿主相互作用方面取得了不少進展。但是，這些小型動物模型仍存在如下諸多缺陷：①適應(yīng)性免疫缺乏或是功能不全；②病毒復(fù)制水平較低及缺乏病毒血癥；③不出現(xiàn)或極少出現(xiàn)肝纖維化以及沒有肝硬化現(xiàn)象的發(fā)生。因此，發(fā)展更為合適的HCV感染模型同時用于多領(lǐng)域的研究仍拭目以待。目前有如下幾條研究途徑：①改造病毒使之能夠適應(yīng)小鼠，使其可在肝細胞內(nèi)完成整個生命周期；②進一步人源化小鼠使之對HCV更易感；③上兩種方案的組合。

3.1 HCV適應(yīng)的具有免疫活性的小鼠模型

由于小鼠的肝細胞對HCV感染具有抵抗性，通過基因工程的手段改造病毒以克服病毒感染中物種特異性的限制，使病毒在普通的小鼠肝細胞內(nèi)可以完成它的整個生命周期，包括進入、轉(zhuǎn)錄、復(fù)制和釋放等環(huán)節(jié)。Bitzegeio等[53]將源于HCV基因2a亞型的病毒株HCV Jc1改造，以適應(yīng)鼠科的進入因子CD81。與野生型的Jc1相比，變種可進入表達鼠源CD81的肝細胞。盡管如此，它并不能在小鼠肝細胞內(nèi)進行復(fù)制，說明宿主因子限制了病毒進入細胞后下游的持續(xù)感染[53]。證據(jù)表明這可能是固有免疫干擾了HCV的復(fù)制，因而在小鼠細胞內(nèi)感染效率很低[11, 32, 54]。為更精確的模仿人體的免疫反應(yīng)，人們嘗試應(yīng)用 HLA表達小鼠[55]，然而這個方案的主要缺陷是難于模仿人體內(nèi)HLA組合的可變性。因此，今后應(yīng)進一步明確HLA轉(zhuǎn)基因的組合。然而，我們?nèi)圆荒艽_定小鼠對病毒的免疫反應(yīng)與人體內(nèi)的是否具有可比性。因此，下一步的計劃應(yīng)致力于發(fā)展具有人免疫系統(tǒng)及人源化肝臟的且具有完全免疫活性的小鼠模型，以用于研究HCV感染。

3.2 人免疫系統(tǒng)-人肝細胞嵌合小鼠模型

評價免疫系統(tǒng)在HCV侵染時所起的作用，及探索在與人體內(nèi)環(huán)境相似的情況下病毒誘導(dǎo)的免疫發(fā)病機制的最佳動物模型，將會落在與人免疫細胞及肝細胞不發(fā)生排異反應(yīng)的轉(zhuǎn)基因小鼠上。然而，人免疫細胞是在鼠科MHC上而非在HLA分子上進行選擇，這將會阻止有效的T細胞及B細胞反應(yīng)的產(chǎn)生。

但不幸的是，來源于小鼠體內(nèi)的hHSC并不能非常有效的發(fā)揮作用，原因是一些小鼠的細胞因子不能有效的刺激人的細胞[56]。為改善來自于hHSC的免疫重建，嘗試了通過注射外源重組的細胞因子，或是構(gòu)造轉(zhuǎn)基因或基因敲除小鼠等途徑[57]。具有不同遺傳背景的多種小鼠都會排斥移植的人類細胞，這是因為人CD47與表達于巨噬細胞上的小鼠信號調(diào)節(jié)蛋白α(SIRPα)相互作用的效率低下，而這將會導(dǎo)致巨噬細胞的吞噬作用的激活。實驗證明，表達小鼠CD47的人源細胞可有效移植到BRG小鼠體內(nèi)，使淋巴器官中T細胞及NK細胞處于穩(wěn)態(tài)[58]。同樣的，它能更有效的允許hHSC的移植，以用來構(gòu)建人SIRPα轉(zhuǎn)基因小鼠[59]。另外，移植細胞基因上的操作與選擇過程，會導(dǎo)致移植時數(shù)量上的限制。為了克服這種限制，通過對比其他基因背景的小鼠在接受其他外源移植上的效率問題，發(fā)現(xiàn)NOD小鼠最適于hHSC移植，由于其編碼SIRPα基因的多態(tài)性，使結(jié)合到人CD47上的效率更高[60]。因此，NOD小鼠可能是最適于引入無需基因修飾的外源細胞，并使之嵌合程度更高的小鼠模型。

人免疫系統(tǒng)-人肝細胞嵌合小鼠模型有以下幾點優(yōu)勢[61]：①可評估抗HCV免疫反應(yīng)；②慢性感染中深入破譯免疫發(fā)病機制的發(fā)展；③探究急性感染中HCV-宿主相互作用關(guān)系；④解決病毒殺死的機制；⑤研發(fā)疫苗及其他抗病毒療法。

3.3 基因人源化小鼠模型

為研發(fā)具有免疫活性的小鼠模型，另一途徑有賴于將病毒生命周期所需的人源特異性因子引入基因改造的小鼠體內(nèi)。Dorner等[29]的研究表明，腺病毒在小鼠肝臟中表達人的病毒進入因子使病毒能夠進入鼠肝細胞，鑒于此，HCV RNA的復(fù)制成為接下來及最終在小鼠細胞中需要解決的關(guān)鍵步驟。然而，病毒RNA可在小鼠細胞內(nèi)翻譯卻不能有效復(fù)制[29]。一些研究表明HCV復(fù)制子可在鼠細胞系內(nèi)復(fù)制[62]，提示目前仍沒有針對HCV在小鼠細胞中復(fù)制低的抑制因子，以及解決鼠直系同源的宿主因子的限制性等問題。小鼠固有免疫反應(yīng)的激活與其細胞內(nèi)有限的HCV的復(fù)制相關(guān)[54]。事實上，固有免疫中涉及的幾種抗病毒分子的失活可促進小鼠細胞內(nèi)HCV的復(fù)制[32, 63]。基因人緣化小鼠可表達人肝細胞的免疫反應(yīng)，為未來構(gòu)建更適于HCV免疫發(fā)病機制研究的新型動物模型打下了基礎(chǔ)。

4 其他替代動物模型

斑馬魚基因與人類基因的同源性達到87%，這意味著在其身上做藥物實驗所得到的結(jié)果在多數(shù)情況下也有可能適用于人體，因此它受到生物學(xué)家的重視。因為斑馬魚的胚胎是透明的，所以生物學(xué)家很容易觀察到藥物對其體內(nèi)器官的影響。此外，雌性斑馬魚可產(chǎn)卵200枚，胚胎在24 h內(nèi)就可發(fā)育成形，這使得生物學(xué)家可以在同一代魚身上進行不同的實驗，進而研究病理演化過程并找到病因。

有研究[64]表明HCV的亞復(fù)制子被設(shè)計為帶有兩個載體，其中之一為HCV NS5b及紅色熒光蛋白基因，另外一個包括HCV 5′-UTR、Core蛋白、3′-UTR和綠色熒光蛋白。含有亞復(fù)制子的載體被注入到斑馬魚的受精卵中，高表達HCV RNA及核心蛋白，但并不引起斑馬魚生長發(fā)育過程中的不良反應(yīng)，且能夠引發(fā)同人類肝細胞相近的基因表達。兩個已知的抗HCV的藥物：利巴韋林和氧化苦參堿，能夠通過降低HCV RNA及核心蛋白的量來抑制亞復(fù)制子的表達。由于這個模型在技術(shù)方面具有較好的再現(xiàn)性且易于操作，因此，斑馬魚有可能成為HCV感染宿主的新的模式生物，并且斑馬魚/HCV(亞復(fù)制子)系統(tǒng)有可能成為抗HCV藥物篩選與評價的替代動物模型之一。

5 結(jié)論與展望

自第一個HCV感染替代小動物模型(uPA-SCID小鼠模型)出現(xiàn)后，產(chǎn)生了多種更為復(fù)雜的HCV感染替代動物模型。盡管這些模型可用于病毒致病機制研究和不同種類抗病毒藥物和疫苗的臨床前評價，但卻沒有任何一個模型可以在病毒感染過程中(如：病毒生命周期、免疫反應(yīng)、免疫學(xué)發(fā)病機制、疫苗的研發(fā)等)具有完全的優(yōu)勢。鑒于HCV感染的自然史，需要多年甚至幾十年才有可能發(fā)展為肝癌，因此像這種平均壽命只有兩年的嚙齒類動物，怎樣使其受HCV感染并誘導(dǎo)產(chǎn)生肝纖維化、肝硬化及肝癌是一個極大的挑戰(zhàn)。盡管如此，這些模型仍極大地增進了我們對HCV感染和HCV-宿主相互作用關(guān)系的認(rèn)識，為日后將這些模型不同的特點及優(yōu)勢結(jié)合以構(gòu)建新型動物模型打下了基礎(chǔ)，結(jié)合多種現(xiàn)代實驗技術(shù)，最終會促進更適于HCV免疫發(fā)病機制研究及藥物和疫苗評價的新型動物模型的發(fā)展。

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