陳愉生，林小芬，李鴻茹，林獻(xiàn)，林明，許能鑾

(福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)院，福州 35001)

肺癌是世界上發(fā)生率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，轉(zhuǎn)移是肺癌死亡的主要原因，所以肺癌轉(zhuǎn)移的研究意義重大。利用免疫缺陷動(dòng)物建立腫瘤動(dòng)物模型，是研究腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制的重要工具，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)在這方面做了大量的探索[1，2]，理想的轉(zhuǎn)移模型卻并不多。本研究以人肺腺癌細(xì)胞A549為研究細(xì)胞，以BABL/c裸鼠為宿主動(dòng)物，經(jīng)尾靜脈注入人肺腺癌細(xì)胞，建立人肺腺癌實(shí)驗(yàn)性轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型，為下一步的肺腺癌轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

人肺腺癌A549細(xì)胞株來(lái)源于中科院上海細(xì)胞研究所。SPF級(jí)BALB/c裸鼠11只，4～6周齡，體重(16±2) g，雌雄各半，購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SCXK(滬)2012-002】，飼養(yǎng)于福建醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)動(dòng)物室【SYXK(閩)2012-0001】，所用的飼料、水、墊料都經(jīng)過(guò)嚴(yán)格滅菌處理，并按動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.1.2 主要試劑與設(shè)備

RPMI 1640培養(yǎng)基、0.25%胰酶2-EDTA(Hyclone公司，美國(guó))、胎牛血清(杭州四季青公司，中國(guó))、生物安全柜和CO2培養(yǎng)箱(日本三洋公司，日本)、倒置顯微鏡(奧林巴斯公司，日本)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，將A549細(xì)胞培養(yǎng)于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞, 經(jīng)胰酶消化制備細(xì)胞懸液，以1000 r/min離心5 min，棄去上清液。加入無(wú)血清的1640培養(yǎng)基，再經(jīng)吹打、離心。以無(wú)血清培養(yǎng)基重懸制備單細(xì)胞懸液。

1.2.2 細(xì)胞計(jì)數(shù)

吹打混勻細(xì)胞, 取4滴細(xì)胞懸液、4滴臺(tái)盼藍(lán)染液混于離心管中，活細(xì)胞不被染。將混勻的細(xì)胞懸液滴入細(xì)胞計(jì)數(shù)板中, 統(tǒng)計(jì)四大格的活細(xì)胞及死細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞量/mL=(四大方格細(xì)胞總數(shù)/ 4)× 104× 2/mL。臺(tái)盼藍(lán)染色示細(xì)胞存活率>90%(細(xì)胞存活率=活細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù) × 100%)。離心并重懸細(xì)胞至密度為1×107個(gè)/ mL。

1.2.3 細(xì)胞接種

通過(guò)剪裸鼠耳朵標(biāo)記裸鼠的左耳上下、右耳上下部位。在SPF級(jí)動(dòng)物房，將裸鼠固定在固鼠器內(nèi)，壓住鼠尾巴根部，用酒精棉球擦拭尾巴消毒并擴(kuò)張血管，用1 mL注射器吸取單細(xì)胞懸液，于尾部中外三分之一處進(jìn)針，注意控制速度防止小鼠發(fā)生栓塞。每只0.1 mL，即1×106個(gè)。

1.2.4 肺部及全身其他臟器的轉(zhuǎn)移情況

分別于接種腫瘤細(xì)胞后第4、5、6、7周，用頸椎脫臼法隨機(jī)處死2只，余3只出現(xiàn)惡液質(zhì)時(shí)處死。解剖小鼠，觀察肺、淋巴結(jié)、腦、肝、腎等臟器有無(wú)轉(zhuǎn)移灶，計(jì)算肺部轉(zhuǎn)移的結(jié)節(jié)數(shù)。

1.2.5 肺部轉(zhuǎn)移病灶的病理檢查

對(duì)肺部轉(zhuǎn)移灶行病理取材，置于4%甲醛固定, 固定24 h后, 制成石蠟切片, HE染色，鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 接種后裸鼠的一般情況

尾靜脈注射過(guò)程中，11只裸鼠均未見(jiàn)死亡，精神狀態(tài)好，反應(yīng)靈敏。未處死的3只，分別于接種后第11、13、14周出現(xiàn)惡液質(zhì)。

2.2 小鼠解剖后肺部及其他臟器轉(zhuǎn)移情況

第4周未出現(xiàn)轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)；第5周出現(xiàn)鏡下轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)；第6周出現(xiàn)肉眼轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)，平均15個(gè)；第7周轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)目明顯增多，平均30個(gè)；第11、13、14周的肺部呈彌漫性病變，肺質(zhì)地堅(jiān)韌。肺部的轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)呈半透明樣，切開(kāi)呈實(shí)性(彩圖1，見(jiàn)彩插6，圖2見(jiàn)彩插7)。其他臟器在第11周縱隔淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移灶(見(jiàn)彩圖3A,彩插7)，其余小鼠均未見(jiàn)其他臟器的轉(zhuǎn)移灶，亦未見(jiàn)胸水。

2.3 肺轉(zhuǎn)移灶的病理檢查結(jié)果

轉(zhuǎn)移灶細(xì)胞呈腺樣排列。細(xì)胞呈圓形、橢圓形或不規(guī)則形，分化差，核大，深染，核質(zhì)比大，核分裂相多見(jiàn)，符合腺癌病理特點(diǎn)(見(jiàn)彩圖3B,彩插7)。

3 討論

建立一種比較理想的肺癌轉(zhuǎn)移模型，對(duì)于進(jìn)一步研究肺癌轉(zhuǎn)移分子機(jī)制、研究肺癌轉(zhuǎn)移細(xì)胞的生物學(xué)特性、肺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的基因治療等方面意義重大。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型建立成功與否主要取決于以下幾個(gè)方面：①腫瘤細(xì)胞接種部位。②接種細(xì)胞的數(shù)量及狀態(tài)。③實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇。

目前存在的腫瘤轉(zhuǎn)移模型形式多樣，主要分為自發(fā)性轉(zhuǎn)移模型和實(shí)驗(yàn)性轉(zhuǎn)移模型，前者包括皮下接種、原位接種，后者為循環(huán)系統(tǒng)接種。

皮下接種轉(zhuǎn)移模型國(guó)內(nèi)外學(xué)者[3，4]均有報(bào)道，該模型建立周期長(zhǎng)，且不易出現(xiàn)轉(zhuǎn)移。腫瘤在小鼠體內(nèi)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移需要的周期長(zhǎng)，常于未出現(xiàn)轉(zhuǎn)移時(shí)，負(fù)荷的腫瘤出現(xiàn)破潰，或腫瘤負(fù)荷過(guò)重，小鼠出現(xiàn)惡液質(zhì)，難以達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求[5]。

原位移植建立肺癌轉(zhuǎn)移模型漸漸成為熱點(diǎn)，學(xué)者們認(rèn)為原位移植轉(zhuǎn)移模型能比較確切的模擬臨床轉(zhuǎn)移的過(guò)程。該模型成瘤率高，表現(xiàn)出較強(qiáng)的侵襲及轉(zhuǎn)移性[6]，但是原位移植存在一些不易實(shí)行的地方。小鼠的個(gè)體較小，4～6周齡，操作難度大；操作時(shí)必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌原則，裸鼠為免疫缺陷動(dòng)物，易發(fā)生術(shù)后感染甚至是死亡。此種模型安全性偏低，動(dòng)物死亡率偏高。

本研究采用經(jīng)尾靜脈注入肺腺癌細(xì)胞A549，建立肺癌實(shí)驗(yàn)性轉(zhuǎn)移模型。實(shí)驗(yàn)性轉(zhuǎn)移模型是指將瘤細(xì)胞懸液直接接種于血管腔內(nèi)或淋巴管腔內(nèi)建立的模型，這種方法的優(yōu)點(diǎn)是縮短了靶器官內(nèi)形成瘤灶的時(shí)間，轉(zhuǎn)移率高；缺點(diǎn)是該模型模擬了腫瘤復(fù)雜轉(zhuǎn)移過(guò)程的一個(gè)階段，并不能模擬轉(zhuǎn)移的全過(guò)程。本研究中注入腫瘤細(xì)胞后第5周開(kāi)始出現(xiàn)肺部轉(zhuǎn)移，肺部轉(zhuǎn)移率達(dá)11/11，與皮下注射腫瘤細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)移率高且出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的時(shí)間明顯縮短；本研究過(guò)程中未出現(xiàn)裸鼠死亡，未處死的3只裸鼠最早于注射腫瘤細(xì)胞后第11周出現(xiàn)惡液質(zhì)，與原位移植相比，裸鼠不易出現(xiàn)感染，且存活時(shí)間長(zhǎng)，有利于后續(xù)的研究。該模型特點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單、出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的時(shí)間短、轉(zhuǎn)移率高、動(dòng)物存活率高及存活時(shí)間長(zhǎng)。

種植的細(xì)胞數(shù)量及狀態(tài)會(huì)影響建模的成功與否。細(xì)胞接種過(guò)少，接種的成功率和自發(fā)轉(zhuǎn)移率都會(huì)減少；接種過(guò)多，又會(huì)引起腫瘤的失控生長(zhǎng)，不利于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。鄭井紅等[7]研究表明，接種細(xì)胞數(shù)過(guò)少未能形成肺轉(zhuǎn)移灶；接種細(xì)胞數(shù)量過(guò)大小鼠全部死亡。另外，接種的細(xì)胞一般取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，該期細(xì)胞生長(zhǎng)活力高。參考有關(guān)文獻(xiàn)，本研究采用1×106個(gè)/只接種裸鼠尾靜脈，經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色，細(xì)胞活力達(dá)90%。通過(guò)分批處死裸鼠，動(dòng)態(tài)觀察，肺部轉(zhuǎn)移率達(dá)100%，第7周轉(zhuǎn)移達(dá)到最高，符合既往文獻(xiàn)的報(bào)道[8]。

本研究選擇BABL/c裸鼠，因?yàn)樗菬o(wú)胸腺鼠，T細(xì)胞不能正常分化，所以對(duì)于異體物質(zhì)沒(méi)有明顯的排斥反應(yīng)，移植后腫瘤生長(zhǎng)良好，也能保持腫瘤細(xì)胞原有形態(tài)及生物學(xué)特性，是腫瘤研究中較為常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[9]。BALB/c裸鼠為單一T細(xì)胞缺陷，NK細(xì)胞活性較高，B細(xì)胞仍參與免疫應(yīng)答。而SCID小鼠為聯(lián)合免疫缺陷小鼠，T、B細(xì)胞聯(lián)合免疫缺陷，是人體異種移植較好的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。Bosma等[10]研究表明，SCID鼠在對(duì)人體腫瘤細(xì)胞系敏感性、成瘤率和轉(zhuǎn)移率方面都高于BALB/c 裸鼠。但是由于SCID裸鼠為聯(lián)合免疫缺陷裸鼠，價(jià)格昂貴，對(duì)于環(huán)境要求極高且不易飼養(yǎng)，死亡率較高。本研究持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，為使結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，盡量減少動(dòng)物死亡數(shù)目，故本研究選擇BALB/c裸鼠。此外，裸鼠成瘤也受年齡影響。選取4～6周齡的裸鼠最佳。裸鼠體內(nèi)T細(xì)胞會(huì)隨著年齡的增加而增加，相應(yīng)的裸鼠的免疫功能增強(qiáng), 移植成功率會(huì)受影響。綜合這幾方面的因素，本研究選擇了4～6周BALB/c裸鼠。

本研究中，接種1×106個(gè)/只到11只裸鼠尾靜脈。分別于接種后第4、5、6、7隨機(jī)處死2只，取肺部做HE染色觀察，第5周開(kāi)始出現(xiàn)鏡下肺部轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)，第6周出現(xiàn)肉眼轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)，第7周轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)增多。隨著接種周數(shù)的延長(zhǎng)，肺部轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的數(shù)目相應(yīng)增多，符合腫瘤的生長(zhǎng)規(guī)律。第11、13、14周肺部呈彌漫性病變，肺泡結(jié)構(gòu)大量破壞，第11周出現(xiàn)淋巴結(jié)浸潤(rùn)。生存時(shí)間較長(zhǎng)，有利于腫瘤機(jī)制研究。本研究動(dòng)態(tài)觀察腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，更好反映肺腺癌在體內(nèi)的轉(zhuǎn)移規(guī)律。但是，既往的文獻(xiàn)分批處死的動(dòng)物數(shù)量一般較多[11]，本研究每批處死的2只，數(shù)量偏小，易引起假陰性。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，經(jīng)尾靜脈注射其他腫瘤細(xì)胞建立肺部轉(zhuǎn)移模型，在肺部形成轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的同時(shí)，其尾部注射部位也會(huì)形成腫瘤，但是本研究未出現(xiàn)尾部成瘤。

(本文圖1見(jiàn)彩插6,圖2,3見(jiàn)彩插7。)

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