賈宇臣，陳琦，李少偉，鄭源強(qiáng)，王利

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué),分子生物學(xué)研究中心,呼和浩特 010059)

研究報告

新生小鼠不同部位皮膚毛囊早期發(fā)育差異的比較

賈宇臣，陳琦，李少偉，鄭源強(qiáng)，王利

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué),分子生物學(xué)研究中心,呼和浩特 010059)

目的觀察出生后小鼠不同部位皮膚毛囊早期發(fā)育生長差異及細(xì)胞色素C的表達(dá)分布。方法對新生1～9日齡的KM小鼠背部、尾部和觸須部皮膚取材,進(jìn)行HE染色,用二步法免疫組織化學(xué)對組織進(jìn)行細(xì)胞色素C進(jìn)行表達(dá)分布檢測。結(jié)果新生小鼠不同部位皮膚毛囊發(fā)育差異很大,這種差異不僅體現(xiàn)在形態(tài)差異上,而發(fā)育時間的差異也十分明顯。小鼠出生后背部皮膚和尾部皮膚的毛囊發(fā)育都經(jīng)過了一個非線性的發(fā)育和生長期,過了非線性的發(fā)育和生長期才開始快速生長,相比較尾部發(fā)育略遲于背部。觸須部毛囊發(fā)育特征和背部尾部差異很大,一出生便可看到較成熟的觸毛,沒有經(jīng)過穩(wěn)定期便開始發(fā)育。結(jié)論通過形態(tài)學(xué)比較,結(jié)合CytC表達(dá)分布水平,發(fā)現(xiàn)新生小鼠不同部位皮膚毛囊早期發(fā)育存在形態(tài)和時間上的差異。

毛囊;細(xì)胞色素C;毛囊發(fā)育差異

哺乳動物毛發(fā)是皮膚毛囊發(fā)育生長的衍生物。毛囊是皮膚重要的附屬器官,具有獨特的結(jié)構(gòu)和周期性再生能力。毛囊因體表的不同部位而其性質(zhì)表現(xiàn)出極大差異。毛囊周期初步分為興盛期、退行期、休止期。興盛期初期劃分為8個階段,休止期分為破壞期和再生期［1.2］。正是由于毛囊這種周期的復(fù)雜性,和結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性使得人們對毛囊發(fā)育分化機(jī)制始終不是十分清楚。

細(xì)胞色素C(cytochrome C,CytC)不僅作為呼吸鏈中遞電子體,又對細(xì)胞程序性凋亡起到了關(guān)鍵性的作用。其通過改變線粒體膜的通透性將CytC釋放到細(xì)胞質(zhì)當(dāng)中。細(xì)胞質(zhì)中的細(xì)胞色素C結(jié)合Apaf-1激活 caspase-9,caspase-9又可激活其他caspases加速細(xì)胞凋亡。從某種意義上講,CytC可以反映出組織的生長代謝水平［3］。毛囊作為皮膚附屬的獨特器官,不斷進(jìn)行著自我更新,內(nèi)部各層細(xì)胞也不斷進(jìn)行著程序性凋亡,而CytC在呼吸中和尤其在凋亡中的重要作用,卻很少有人研究其在毛囊發(fā)育中的作用。

國內(nèi)外對小鼠毛囊在胚胎時期的形成和出生后的發(fā)育與周期,從形態(tài)學(xué)上做了深入研究［1.2］。而出生后小鼠不同部位皮膚組織的毛囊發(fā)育生長差異的模型鮮見報道,對不同部位毛囊發(fā)育的差異缺乏系統(tǒng)性、完整性的研究,對為什么不同部位皮膚毛囊發(fā)育存在巨大差異目前仍然不清楚。

本研究利用新生小鼠毛發(fā)發(fā)育的同步性,通過組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)合CytC的表達(dá)分布,研究新生小鼠不同部位皮膚毛發(fā)早期發(fā)育差異。為其他學(xué)者進(jìn)一步研究不同皮膚毛囊發(fā)育差異提供參考基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

6周齡SPF級性成熟KM小鼠雌雄各6只,體重25～30g,來源內(nèi)蒙古大學(xué)實驗動物中心【SCXK (蒙)2009-0001】。妊娠后雌鼠分籠單獨飼養(yǎng),從分娩當(dāng)天采集標(biāo)本,每天同一出生時間點處理三只小鼠。采集出生后1 d、2 d、3 d、5 d、7 d到9 d新生小鼠背部、觸須部、尾部皮膚,一部分-80℃凍存,一部分中性甲醛固定。

1.2 主要設(shè)備與試劑

石蠟包埋機(jī)(Leica EG1150H),石蠟切片機(jī)(Leica RM 2015),光學(xué)顯微鏡(Olympus CX41RF),圖像分析系統(tǒng)(Motic Images Advanced 3.2),搖床(北京六一WD-9405B),一抗兔多抗cytochrome C(Abcam),二步法二抗試劑盒(北京康為),DAB試劑盒(北京康為),抗體稀釋液(北京康為)。

1.3 實驗方法

1.3.1 不同日齡和不同部位皮膚組織的HE染色

將中性甲醛固定后的標(biāo)本進(jìn)行流水沖洗,采用常規(guī)脫水、透明和石蠟包埋,進(jìn)行切片,厚度7μm,進(jìn)行HE染色。

1.3.2 免疫組化二步法檢測CytC在新生小鼠不同皮膚的表達(dá)及定位

取1～9日齡小鼠背部、觸須部、尾部全層皮膚,中性多聚甲醛固定,修型后經(jīng)梯度脫水、透明、浸蠟后進(jìn)行石蠟包埋,切片厚度7μm。45℃烤片40 h,60℃化蠟10 min,二甲苯脫蠟,梯度水化至水, 3%H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶10 min,抗原微波修復(fù)10min,5%BSA封閉,一抗(兩支抗體均1∶500稀釋,4℃過夜),PBS洗3遍,辣根標(biāo)記二抗室溫2 h,PBS洗3遍,DAB顯色,PBS洗3遍,蘇木素輕度復(fù)染,迅速分化沖洗,梯度脫水透明,中性樹膠封片。

2 結(jié)果分析

2.1 新生小鼠不同天數(shù)不同皮膚組織毛囊發(fā)育形態(tài)學(xué)變化

本實驗新生小鼠不同皮膚部位早期毛囊發(fā)育形態(tài)分析采用Ralf Paus 1999標(biāo)準(zhǔn)(將生長期初期,從基板毛芽形成到毛干長出表皮層,分為9個階段, stage 0～9)進(jìn)行對比分析,對不同部位皮膚毛囊發(fā)育進(jìn)行比較性研究。

2.1.1 新生小鼠不同天數(shù)背部皮膚組織毛囊發(fā)育形態(tài)變化

新生3日齡小鼠背部皮膚組織毛囊發(fā)育緩慢,基板從表皮基底膜下移與毛乳頭細(xì)胞形成膨大的毛芽。從第5天開始,毛囊發(fā)育速度明顯加快,毛球增大,外根鞘、內(nèi)根鞘分化形成。毛囊毛球深入到皮下組織。第7天,毛乳頭變薄,徹底被毛母質(zhì)所包圍。毛管,毛干形成,毛干通過毛管長出內(nèi)根鞘。第7天后,毛囊深度更深,毛干通過毛管生長出表皮層,毛囊發(fā)育分化進(jìn)入成熟生長期(stage 9)(見圖1,彩插14)。

2.1.2 新生小鼠不同天數(shù)尾部皮膚組織毛囊發(fā)育形態(tài)變化

尾部皮膚毛囊發(fā)育規(guī)律與背部皮膚毛囊發(fā)育規(guī)律相似,但發(fā)育要略晚于背部皮膚毛囊1日齡的時間。尾部毛囊形態(tài)與背部毛囊相比,短而粗,第7天形成的毛干也比背毛要粗(見圖2,彩插14)。

2.1.3 新生小鼠不同天數(shù)觸須部皮膚組織毛囊發(fā)育形態(tài)變化

觸須部毛囊發(fā)育與背部和尾部差異很大,出生第1天便有發(fā)育成熟的竇狀毛囊,并能看到其中的觸毛毛干。觸須部其他毛囊發(fā)育速度也很快。第2天的時候就分化出了內(nèi)根鞘和外根鞘,第3天,毛管毛干形成,并有毛干長出表皮層,毛囊毛母質(zhì)包圍毛乳頭形成毛球,已經(jīng)深入到皮下組織層。第5天后,毛囊發(fā)育分化進(jìn)入成熟生長期(stage 9)(見圖3,彩插14)。

2.2 新生小鼠不同皮膚組織毛囊發(fā)育中的表達(dá)與分布

2.2.1 CytC在新生小鼠背部皮膚組織毛囊發(fā)育中的表達(dá)與分布

新生小鼠背部皮膚1～3 d時,CytC表達(dá)量在毛囊中不是很高,但信號略有增加。其次信號主要在皮膚的表皮層部分逐漸增高,說明毛囊在前3 d發(fā)育相對遲緩,皮膚角質(zhì)層的代謝活躍。3～9 d,CytC表達(dá)量逐漸升高,信號主要集中表達(dá)在毛干和內(nèi)根鞘,外根鞘的表達(dá)相對要弱一些(見圖4,彩插15)。

2.2.2 CytC在新生小鼠尾部皮膚組織毛囊發(fā)育中的表達(dá)與分布

新生小鼠尾部皮膚1～3 d時,CytC表達(dá)量在毛囊中很低,信號主要在皮膚的表皮層部分增強(qiáng),說明毛囊在前3 d發(fā)育相對遲緩,皮膚表皮層的代謝活躍。5～9 d,CytC表量達(dá)逐漸升高,信號主要集中表達(dá)在毛干和內(nèi)根鞘,外根鞘的表達(dá)相對要弱一些(見圖5,彩插15)。

2.2.3 CytC在新生小鼠觸須部皮膚組織毛囊發(fā)育中的表達(dá)與分布

新生小鼠觸須部皮膚在第1～2天時,CytC表達(dá)在毛囊中的表達(dá)量較低,信號在皮膚的表皮層部分較強(qiáng),說明觸須部毛囊在前1～2 d代謝就比較活躍,同時觸須皮膚表皮層的代謝也很活躍。第3～9天,CytC表量達(dá)迅速升高,信號主要集中強(qiáng)烈表達(dá)在毛干和內(nèi)根鞘,外根鞘的表達(dá)相對要弱(見圖6,彩插15)。

3 討論

目前國內(nèi)外對毛囊發(fā)育分化及毛囊周期已經(jīng)有了大量的研究,通過對轉(zhuǎn)基因小鼠模型的構(gòu)建,提出了毛囊發(fā)育信號通路的幾種假說［4-7］。由于毛囊器官的發(fā)育、周期和生物體的整個系統(tǒng)都有聯(lián)系,以及其結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性導(dǎo)致取材上存在很大難度,所以毛囊發(fā)育分化及周期的機(jī)理始終沒有研究清楚。Ralf Paus對毛囊發(fā)育及周期的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化做了很詳細(xì)的研究,將毛囊發(fā)育分為生長期(anagen)、退化期(catagen)、靜止性(tolegen),后又將生長期初期分為八個階段,為毛囊發(fā)育的研究提供詳細(xì)的參照。最近有學(xué)者對哺乳動物和人,以及人種族間的毛囊形態(tài)進(jìn)行了比較研究,發(fā)現(xiàn)毛囊分布、毛囊參數(shù)和特性的差異與皮膚結(jié)構(gòu)不同有很大的相關(guān)性［8］。而人的種族不同,皮膚生理功能沒有明顯差異,但毛囊形態(tài)結(jié)構(gòu)卻存在一定的差異［9］。

本實驗采用1～9日齡的新生小鼠作為實驗?zāi)Ｐ?解決了成年鼠毛囊生長發(fā)育周期不同步的問題,使得研究具有很好的可對比性。通過形態(tài)學(xué)比較,結(jié)合CytC表達(dá)分布水平,發(fā)現(xiàn)不同部位皮膚毛囊發(fā)育不僅存在形態(tài)和時間上的差異,而且還存在不同皮膚毛發(fā)生長的活躍程度不一致的差異。CytC可以反映出組織的生長代謝水平和活躍程度［10］,本人認(rèn)為CytC集中表達(dá)于新生小鼠皮膚的表皮層,說明新生小鼠皮膚表皮代謝旺盛,細(xì)胞更新快。同樣新生小鼠不同皮膚毛囊的生長過程中,CytC也主要集中表達(dá)于內(nèi)根鞘和毛干,說明內(nèi)根鞘和毛干在新生小鼠皮膚毛囊發(fā)育中一直處于活躍狀態(tài),而其表達(dá)強(qiáng)度和毛囊生長發(fā)育規(guī)律吻合。本研究看出,觸須部毛囊最先發(fā)育,一出生便快速生長,其穩(wěn)定期應(yīng)該在胚胎期就已經(jīng)完成。而背部毛囊和尾部毛囊都經(jīng)歷了一個非線性的發(fā)育期才開始快速發(fā)育,背部早期毛囊發(fā)育情況和王博研究相似［11］。不同皮膚部位毛囊發(fā)育結(jié)果和本人對BMP-2、Noggin在不同部位毛囊發(fā)育差異的研究結(jié)果一致［12］,說明BMP-2對背毛和尾毛前3 d的穩(wěn)定起到了關(guān)鍵性的作用。顯然背毛和尾毛頭幾天的非線性生長(穩(wěn)定期)對后面的毛囊的快速發(fā)育起到了充足的準(zhǔn)備作用。這種非線性生長的穩(wěn)定期的重要性在轉(zhuǎn)Noggin小鼠和敲除 BMP受體小鼠模型當(dāng)中得到證實［4.13.14］。該兩種模型均表現(xiàn)出背毛由Z字型轉(zhuǎn)變?yōu)殄F形,正是破壞了BMP信號因子導(dǎo)致毛囊的穩(wěn)態(tài)環(huán)境破壞,由于過早進(jìn)入下一周期引起次級毛囊毛發(fā)丟失。所以也看出BMP對毛囊發(fā)育的抑制,正是起到了一種讓毛囊停留在非線性生長的穩(wěn)定期的作用,為后面的發(fā)育分化做物質(zhì)準(zhǔn)備。這種不同皮膚毛囊發(fā)育差異特點,從本實驗中給予了進(jìn)一步證明。

(本文圖1～3見彩插14，圖4～6見彩插15。)

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Com parison of early developmental differences of hair follicles in different skin areas of neonatalm ice

JIA Yu-chen,CHEN Qi,LIShao-wei,ZHENG Yuan-qiang,WANG Li
(Research Center of Molecular Biology,Inner Mongolia Medical University,Hohhot010059,China)

ObjectiveThe aim of this study was to observe the growth difference and expression of cytochrome C of skin hair follicles in neonatalmice.M ethodsThemorphology of differentskin hair follicles ofneonatalmice(postnatal day 1-9)were observed by HE staining histology and cytochrome Cwas detected by immunohistochemistry.ResultsThe skin hair follicles in different parts of neonatalmice showed differences notonly inmorphology butalso in developmental periods.Hair follicle growth in the back and tail skin had a nonlinear and growing period.After the nonlinear and growing period they began to grow rapidly.The tail developmentwas slightly slower than that on the back.The hair follicles of vibrissae were very special,and started to develop without a stable period.ConclusionsThe results ofmorphological observation and cytochrome C immunohistochemistry demonstrate that differences exist in the hair folliclemorphology and developmental times in the skin of different parts of the body in neonatalmice.

Hair follicle;Cytochrome C;Hair follicle development;Neonatalmice

Q95-33,R3

A

1005-4847(2014)03-0084-04

10.3969/j.issn.1005-4847.2014.03.017

2013-12-21

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)青年創(chuàng)新基金(No.nybq2010cq);內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金(No.2013MS1122)資助。

賈宇臣(1978-),女,講師,內(nèi)蒙古人,碩士,研究方向:分子生物學(xué)。Email:springxy2003@yahoo.com.cn

王利。E-mail:wangliwork@163.com ;