廣州市婦女兒童醫(yī)療中心，廣東 廣州 510623

分子印跡技術(shù)在中藥提取分離中的應(yīng)用

張雅雯

廣州市婦女兒童醫(yī)療中心，廣東 廣州 510623

分子印跡技術(shù)是獲得在空間和結(jié)合位點(diǎn)上與模板分子完全匹配的聚合物的制備技術(shù)。本文綜述了分子印跡技術(shù)的原理、分類、制備以及在中藥分離純化中的應(yīng)用，并對(duì)其面臨的問(wèn)題及應(yīng)用前景進(jìn)行了展望。

分子印跡技術(shù)；分子印跡聚合物；中藥；分離提取

分子印跡技術(shù)(Molecular Imprinting Technique，MIT)是獲得在空間和結(jié)合位點(diǎn)上與模板分子完全匹配的聚合物的制備技術(shù)，這種技術(shù)源于抗體-抗原專一性的認(rèn)識(shí)，利用具有分子識(shí)別能力的聚合物材料——分子印跡聚合物(Molecular Imprinting Polymer，MIP)來(lái)分離、篩選、純化化合物的一種仿生技術(shù)[1]。1949年Dickey提出了“分子印跡”概念[2]，20世紀(jì)90年代Wulff研究小組利用酶和抗體具有分子形狀、空間結(jié)構(gòu)選擇性的特點(diǎn)，發(fā)展了用于色譜手性拆分的MIP。由于MIP具有高選擇性和特異性識(shí)別能力，以及物理化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、耐酸堿、抗高壓、使用壽命長(zhǎng)等特點(diǎn)，使該技術(shù)在固相萃取劑、模擬酶催化、化學(xué)傳感器、農(nóng)殘分析、環(huán)境監(jiān)測(cè)、藥物的提取分離與控釋等方面得到廣泛的應(yīng)用?，F(xiàn)對(duì)MIT在中藥分離純化中的應(yīng)用綜述如下。

1 分子印跡技術(shù)

1.1 原理及分類 根據(jù)分子印跡聚合物與模板分子在聚合過(guò)程中相互作用的機(jī)理不同，分子印跡技術(shù)可分為預(yù)組裝法、自組裝法和結(jié)合法。

1.1.1 預(yù)組裝法 又稱共價(jià)法，該方法主要由Wulff等創(chuàng)立[3]。應(yīng)用預(yù)組裝法合成MIP過(guò)程中，模板分子通過(guò)可逆的共價(jià)鍵與功能單體結(jié)合，加入交聯(lián)劑形成聚合物后，模板分子通過(guò)破壞共價(jià)鍵的方式而被去除。這類MIP的選擇性與交聯(lián)劑的用量直接相關(guān)，但由于可逆性共價(jià)反應(yīng)的限制，能夠利用這種方式制備MIP的模板分子非常有限，因此預(yù)組裝法發(fā)展較為緩慢。

1.1.2 自組裝法 又稱非共價(jià)法，目前MIP的制備多數(shù)采用這種方法。模板分子和功能單體通過(guò)通過(guò)氫鍵、偶極作用、離子化作用、金屬配位鍵、疏水作用、靜電作用、范德華力等多種非共價(jià)鍵作用力生成分子自組裝體[4]，在加入交聯(lián)劑形成聚合物后，這種復(fù)合物被保留下來(lái)。大多數(shù)化合物都能夠通過(guò)非共價(jià)作用與功能單體結(jié)合，因此，自組裝法具有更廣闊的應(yīng)用前景。

1.1.3 結(jié)合法 又稱半共價(jià)法，是將共價(jià)鍵印跡和非共價(jià)鍵印跡相結(jié)合的一種印跡方法[5]。結(jié)合法最早是由White-Comb領(lǐng)導(dǎo)的研究小組于1995年提出[6]，在此方法的基礎(chǔ)上Wulfson領(lǐng)導(dǎo)的研究小組又提出“犧牲空間法””[7]，其實(shí)質(zhì)仍然是預(yù)組裝法和自組裝法的結(jié)合法。在MIP制備過(guò)程中，模板分子和功能單體通過(guò)共價(jià)鍵形成復(fù)合物，在去除模板分子后，目標(biāo)分子與分子印跡物通過(guò)非共價(jià)鍵的相互作用而被特異性識(shí)別。該方法制備的MIP不但具有專一性強(qiáng)的特點(diǎn)，并且在動(dòng)力學(xué)上能快速平衡，結(jié)合了共價(jià)合成法和非共價(jià)合成法的雙重優(yōu)勢(shì)。

1.2 制備方法 根據(jù)分子印跡聚合物的用途和不同性能要求，可以選擇多種MIP制備方法，主要包括本體聚合法、懸浮聚合法、沉淀聚合法、表面印跡法等方法。

1.2.1 本體聚合法 本體聚合是將模板分子、功能單體和交聯(lián)劑按一定比例混合于致孔劑中，經(jīng)聚合形成MIP，再由機(jī)械研磨成所需要尺寸的粒子。該方法制備的MIP對(duì)模板分子仍能保留良好的識(shí)別能力和選擇性，并且合成過(guò)程易于控制，不需要特別復(fù)雜的儀器設(shè)備，便于普及。朱林敏等[8]采用本體聚合法首次合成了丹酚酸A分子印跡聚合物，并優(yōu)化了最佳的聚合條件。在甲醇溶液中，利用靜態(tài)平衡吸附實(shí)驗(yàn)和Scatchard 模型評(píng)價(jià)了丹酚酸A分子印跡聚合物的吸附特性。結(jié)果表明，在所考察的濃度范圍內(nèi)，與空白聚合物相比，丹酚酸A分子印跡聚合物對(duì)丹酚酸A有較高的吸附量，且丹酚酸A分子印跡聚合物中形成了2類不同的結(jié)合位點(diǎn)。

1.2.2 懸浮聚合法 懸浮聚合一般由有機(jī)單體、乳化劑、引發(fā)劑以及水組成，具體過(guò)程是：向混合有模板分子、功能單體以及交聯(lián)劑的溶液中加入乳化劑和交聯(lián)劑后，在水中聚合形成較均一的球狀聚合物。為提高香草醛的提取和使用價(jià)值，丁俊紅等[9]以香草醛為模板分子，甲基丙烯酸為功能單體，二甲基丙烯酸乙二醇酯(EDMA)為交聯(lián)劑，采用紫外輻照引發(fā)懸浮聚合制備了香草醛MIP微球，輻照引發(fā)懸浮聚合制備的印跡聚合物具有較均勻的粒徑分布和良好的等溫吸附性能，并且表現(xiàn)出良好的特異吸附性能，MIP對(duì)于香草醛及鄰香草醛的分離因子為2。

1.2.3 沉淀聚合法 沉淀聚合是一種非均相溶液聚合，其原理是生成的MIP在溶劑中彼此分散，當(dāng)MIP在溶劑中達(dá)到飽和時(shí)，會(huì)產(chǎn)生相分離，最終獲得粒徑均一的微球聚合物。這種方法對(duì)溶劑要求嚴(yán)格，其原則是選擇粘度低、具有高流動(dòng)性的溶液，從而保證低聚物的均勻分散，避免聚集粘連。謝珍茗等[10]以冬凌草甲素為模板分子，甲基丙烯酸為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑，用本體聚合法和沉淀聚合法制備了分子印跡聚合物。結(jié)果表明在弱極性溶劑氯仿中，采用沉淀聚合法制備的MIP印跡效率相對(duì)比以四氫呋喃為致孔劑制備的MIP本體聚合物印跡效率高，且能很好地識(shí)別冬凌草甲素，展現(xiàn)了良好的應(yīng)用前景。

1.2.4 表面印跡法 表面印跡法是把印跡分子和功能單體在溶劑中形成的復(fù)合物，與表面活化過(guò)的硅膠/聚三羥甲基丙烷三丙烯酸酯粒子/玻璃等介質(zhì)反應(yīng)接枝聚合，從而制得MIP的一種方法。周進(jìn)康等[11]在硅膠表面接枝乙烯基三乙氧基硅烷得到接枝硅膠，將其與模板分子丹參素、功能單體4-乙烯基吡啶、交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯等，在偶氮二異丁腈引發(fā)作用下進(jìn)行聚合反應(yīng)，制備丹參素分子MIP。該MIP對(duì)丹參素具有較大的吸附容量、較短的吸附時(shí)間和良好的選擇性，相對(duì)于空白印跡聚合物的印跡因子可達(dá)1.93，印跡聚合物對(duì)模板分子和其結(jié)構(gòu)類似物的吸附之比達(dá)到2.19。

此外，近年來(lái)還發(fā)展了封管聚合法[12]、電聚合[13]、分散聚合[14]等新方法。新的MIP制備方法進(jìn)一步提高了印跡容量，是分子印跡技術(shù)研究領(lǐng)域的重要發(fā)展方向。

2 MIP在中藥提取分離中的應(yīng)用

高效液相色譜法、硅膠柱色譜法等常規(guī)的分離方法，溶劑消耗量大、效率低，且容易造成微量的有效成分丟失。以中藥活性物質(zhì)為模板制備的MIT，正是具有分子識(shí)別性強(qiáng)、固定相制備簡(jiǎn)便快速、操作簡(jiǎn)單、性質(zhì)比較穩(wěn)定(耐酸堿、耐高溫、高壓等)、溶劑消耗量小、模板和MIP都可以回收再利用等優(yōu)點(diǎn)，在中藥活性成分的分離、分析中具有很好的應(yīng)用前景。

2.1 活性成分的提取分離 在中草藥等天然產(chǎn)物的分離提取中，由于樣品成分復(fù)雜多樣，使用傳統(tǒng)的液液萃取及層析柱方法分離，不僅溶劑消耗量大而且對(duì)環(huán)境污染嚴(yán)重，分離技術(shù)的工業(yè)化實(shí)施受到制約。MIT作為一種新的分離技術(shù)，常用于中藥活性成分的分離純化。馮建涌等[15]以長(zhǎng)春堿為模板分子制備了長(zhǎng)春堿MIP，將制備的長(zhǎng)春堿MIP填充于固相萃取小柱中，依次用不同比例的甲醇-冰醋酸溶劑洗脫，分離長(zhǎng)春花提取物中的長(zhǎng)春堿。研究發(fā)現(xiàn)，以甲基丙烯酸酯(EDMA)為交聯(lián)劑、甲苯為致孔劑采用本體聚合的方法制備的長(zhǎng)春堿MIP，存在模本分子抽提不完全導(dǎo)致滲漏的問(wèn)題，影響了該聚合物分子識(shí)別性能的評(píng)價(jià)，通過(guò)選擇和優(yōu)化上樣、淋洗及洗脫等條件，成功分離、富集長(zhǎng)春花提取物中的長(zhǎng)春花堿。潘浪勝等[16]采用分子印跡技術(shù)，以木犀草素為模板分子，丙烯酰胺為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑，通過(guò)熱引發(fā)聚合，制備了木犀草素分子印跡聚合物，并通過(guò)裝入固相萃取柱研究了聚合物對(duì)木犀草素的選擇性能。木犀草素分子印跡固相萃取柱具有較好的穩(wěn)定性和耐用性能，使用4次后其選擇識(shí)別性能仍未降低，其研究結(jié)果對(duì)從復(fù)雜的天然產(chǎn)物中高效分離富集黃酮類活性成分木犀草素有一定的指導(dǎo)作用。向海艷等[17]采用分子印跡技術(shù)，以白藜蘆醇為模板分子，丙烯酰胺為功能單體，EDMA為交聯(lián)劑，合成了對(duì)白藜蘆醇具有較好選擇性的MIP，通過(guò)靜態(tài)平衡結(jié)合法以及Scatchard分析法研究該聚合物的結(jié)合性質(zhì)和選擇性能，用于中藥虎杖提取物中白藜蘆醇的分離，取得較好效果。朱秀芳等[18]以橙皮苷為模板分子，在甲醇中制備了橙皮苷MIP，采用平衡吸附實(shí)驗(yàn)方法研究了聚合物的吸附性能和選擇性能，探討了聚合物的印跡機(jī)理和識(shí)別機(jī)理。機(jī)理研究表明，識(shí)別位點(diǎn)來(lái)自丙烯酰胺與橙皮苷苯甲酰系統(tǒng)的氫鍵作用，吸附溶液中氫鍵競(jìng)爭(zhēng)試劑的存在對(duì)聚合物的識(shí)別性能有顯著影響，該聚合物能選擇識(shí)別復(fù)雜樣品中的橙皮苷分子，具有一定的應(yīng)用潛能。

2.2 有效組分群的分離 分子印跡的分子識(shí)別特點(diǎn)，使其很可能發(fā)展成為一種選擇性分離材料用于萃取分離中藥中具有特定藥效結(jié)構(gòu)的有效成分群。程紹玲等[19]以葛根素為模板分子，丙烯酰胺為單體，EDMA為交聯(lián)劑，制備了葛根素MIP，并用葛根素MIP對(duì)葛根素提取物進(jìn)行了分離。結(jié)果表明，該MIP對(duì)模板分子葛根素印跡效果較強(qiáng)，得葛根素回收率為83%，遠(yuǎn)高于用大孔吸附樹(shù)脂的分離效果，除分離出葛根素外，還有其它兩種異黃酮類成分。周力等[20]選用可以在極性環(huán)境中和模板分子形成氫鍵作用的丙烯酰胺作為功能單體，同時(shí)四氫呋喃的極性不足以干擾槲皮素和丙烯酰胺間存在的氫鍵作用，制備了以槲皮素為模板的MIP，有效地從沙棘粗提物中提取槲皮素和異鼠李素，提示著MIT在中藥有效成分分離中所具有的良好前景。謝建春等[21]采用非共價(jià)法，在極性溶劑中，以丙烯酰胺作功能單體，以強(qiáng)極性化合物槲皮素為模板，制備了MIP，液相色譜實(shí)驗(yàn)表明，MIP對(duì)槲皮素具有特異的親和性，將此MIP直接分離銀杏葉提取物水解液，得到的主要是槲皮素及山奈酚黃酮組分，證實(shí)了MIT用于直接分離中草藥中具有特定藥效化合物的可行性。李禮等[22]分別以黃櫨的主要成分非瑟酮為印跡分子，丙烯酰胺為功能單體，EDMA為交聯(lián)劑，通過(guò)封管聚合法合成了MIP，將其裝于自制的固相萃取柱中，研究了以不同體積比的乙醇-水溶液為溶劑時(shí)非瑟酮在柱上的保留行為。通過(guò)優(yōu)化清洗及洗脫條件，使非瑟酮與它的結(jié)構(gòu)相似物槲皮素在柱上得到了很好的分離。有研究小組以駱駝蓬種籽中抗腫瘤活性成分的結(jié)構(gòu)類似物哈爾滿為模板分子用非共價(jià)鍵法制備了MIP[23]，并作為液相色譜固定相與大氣壓電離飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用，結(jié)果表明該MIP對(duì)模板分子哈爾滿印跡效應(yīng)最強(qiáng)，其次是三個(gè)哈爾滿的結(jié)構(gòu)類似物，而對(duì)其它幾個(gè)結(jié)構(gòu)不相似的含氮雜環(huán)化合物幾乎沒(méi)有印跡。將駱駝蓬種籽甲醇提取物(主要含哈馬靈及哈爾明兩種抗腫瘤生物堿)進(jìn)樣后，MIP柱能選擇性地保留哈馬靈及哈爾明，并通過(guò)質(zhì)譜可以快速地從復(fù)雜的駱駝蓬提取液中分離鑒定出哈馬靈及哈爾明，實(shí)現(xiàn)了中藥活性成分分離鑒定的一體化。

3 存在問(wèn)題與展望

分子印跡技術(shù)以其巨大的潛力得到飛速發(fā)展，但仍然存在很多問(wèn)題。首先，如何從分子水平更好的理解分子印跡過(guò)程和識(shí)別過(guò)程，仍需努力。其次，大量的MIP局限于非極性環(huán)境中，急需尋求一些適用于水溶液的功能單體。第三，在層析中目標(biāo)分子與MIP結(jié)合位結(jié)合慢，引起峰展寬，拖尾而降低分離效率。第四，大多數(shù)功能單體只適用于小分子物質(zhì)，對(duì)于生物大分子的印跡技術(shù)尚需進(jìn)一步探索。

總之，隨著生物技術(shù)、電子技術(shù)、合成手段和現(xiàn)代分析檢測(cè)手段的迅猛發(fā)展，MIP的合成、表征方法和理論系統(tǒng)將日臻完善，MIP作為一種高選擇性的主體分子，對(duì)中藥活性物質(zhì)的特異性分離是其他分離技術(shù)所無(wú)可比擬的。將該技術(shù)應(yīng)用于中藥活性物質(zhì)的分離，不僅具有深刻的理論意義，而且必將擁有美好的應(yīng)用前景。

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張雅雯(1985-)，本科，藥師。E-mail：86558010@qq.com

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1007-8517(2014)20-0012-02

2014.08.06)