李亞楠 王洪武

肺癌是當今世界嚴重威脅人類健康和生命的惡性腫瘤，也是世界范圍內(nèi)最常見的人類惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢，是發(fā)病率和死亡率最高的腫瘤之一。其中非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）約占肺癌總數(shù)的80%-85%[1,2]，主要為鱗癌和腺癌兩種亞型。雖然NSCLC在放療、化療、手術(shù)治療方面取得了一定進展[3,4]，但整體預后較差，5年生存率不足15%[5]。NSCLC發(fā)生、演變及預后過程是多個癌基因和抑癌基因共同參與的多步驟、多階段、多基因改變并且有序的過程，在肺癌的發(fā)生、發(fā)展中起至關(guān)重要作用的有癌基因的激活和抑癌基因的失活、DNA修復基因的突變、生長因子信號轉(zhuǎn)導通路和細胞周期調(diào)節(jié)的異常[6]。近年來，隨著對腫瘤發(fā)病機制等各方面研究的不斷深入以及分子生物學的飛速發(fā)展，目前人類已發(fā)現(xiàn)了多種原癌基因和抑癌基因，磷酸酶及張力蛋白同源基因（phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten, PTEN）是繼p53后新發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑癌基因，對PTEN研究不僅在于對其分子結(jié)構(gòu)、功能、檢測方法、抑癌機制等方面有重大意義，而且在對探索PTEN與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系方面也有非常重要作用。本文就其相關(guān)研究新進展綜述如下。

1 PTEN基因的發(fā)現(xiàn)、鑒定及命名

早在1997年由美國Li等[7]三個研究小組等先后運用不同方法從人類第10q23.3染色體位點上分離、克隆、研究得到了同一種抑癌基因，從不同角度對其進行命名，分別命名第10號染色體缺失的PTEN、多種進展期癌中發(fā)生突變的基因1（mutated inmultiple advanced cancer 1, MMAC1）、TGF-β調(diào)節(jié)的上皮細胞富含的磷酸酶（TGF-β regulated and epitheliat cell-enriched phosphatase, TEP1），PTEN/MMAC1/TEP1基因均定位為第10q23.3染色體，且編碼的蛋白質(zhì)也為同一種蛋白質(zhì)，表明3個基因為同一種基因，故PTEN亦可稱MMAC1或TEP1，現(xiàn)該基因統(tǒng)稱為PTEN。

2 PTEN的分子結(jié)構(gòu)特點

PTEN基因定位于染色體10q23.3區(qū)，全長200 kb，由9個外顯子和8個內(nèi)含子組成，mRNA全長5.5 kb，其cDNA含有1,209個核苷酸組成的開放閱讀框架，編碼著由403個氨基酸組成、分子量為47,000的蛋白質(zhì)。PTEN蛋白中與抑癌功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)由氨基端（N端）磷酸酯酶結(jié)構(gòu)域、脂質(zhì)結(jié)合的C2結(jié)構(gòu)域和有50個氨基酸殘基組成的羧基端（C端）結(jié)構(gòu)域這3個區(qū)域共同組成[8]。在PTEN蛋白的氨基酸序列中，N端與細胞骨架蛋白張力蛋白（tensin）、神經(jīng)觸突泡轉(zhuǎn)運相關(guān)輔助蛋白（auxilin）具有高度同源性，并含有一個蛋白酪氨酸磷酸酶（prote in tyrosine phosphatase, PTP）的催化結(jié)構(gòu)域。其中輔助蛋白與神經(jīng)突觸小泡的運輸密切相關(guān)，張力蛋白參與細胞的聚集與粘附，在腫瘤細胞的浸潤、新生血管生成及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮一定作用。PTEN蛋白具有雙特異性磷酸酶活性，磷酸酶催化結(jié)構(gòu)域具有催化D3位脫磷酸的作用；Myers等[9]研究發(fā)現(xiàn)對絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸的磷酸基起脫磷酸作用，是PTEN發(fā)揮腫瘤抑制活性的主要功能區(qū)域。脂質(zhì)結(jié)合C2結(jié)構(gòu)域與PTEN的磷酸酶結(jié)構(gòu)域緊密相連，且C2區(qū)具有結(jié)合膜磷酯作用，能以Ca2+非依賴性方式使PTEN與細胞膜磷脂結(jié)合，參與PTEN催化結(jié)構(gòu)域在細胞膜的正確有效定位和體內(nèi)細胞的信號轉(zhuǎn)導[10]。羧基端結(jié)構(gòu)域包括兩個PEST（350-375,379-396）序列和尾去的一個PDZ結(jié)構(gòu)域[11]，PTEN羧基端無磷酸酶，但PTEN蛋白羧基端尾部PEST序列酪氨酸、絲氨酸/蘇氨酸殘基磷酸化和PDZ結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)之間的蛋白-蛋白的作用對調(diào)節(jié)其自身的穩(wěn)定性和自身酶活性有重要作用，并且能改變PTEN對蛋白激酶B（protein kinase B, PKB）的調(diào)控，從而抑制細胞增殖、粘附、遷移[12]。

3 PTEN的抑癌作用機制和功能

PTEN作為第一個同時具有脂質(zhì)和蛋白雙重特異性磷酸酶活性的腫瘤抑癌基因，可參與細胞周期的調(diào)節(jié)和抑制腫瘤細胞的增殖、粘附、轉(zhuǎn)移、血管生成及促進細胞的凋亡、分化、衰老等多種生理和病理活動。PTEN抑癌的作用機制主要包括3條途徑：PI3K途徑、FAK途徑以及MAPK途徑[13]。

3.1 PI3K途徑 普遍認為PTEN抑制腫瘤發(fā)生的主要功能是依靠脂質(zhì)磷酸酶活性，脂質(zhì)磷酸酶能使磷酸肌醇通路的脂質(zhì)脫磷酸，干擾磷脂酰肌醇-3-激酶/絲蘇蛋白激酶（phosphatidylinositol 3-kinase/serine-threonine kinase,PI3K/Akt）/PKB信號轉(zhuǎn)導[14]。PTEN作為脂質(zhì)磷酸酶可以催化磷酯酰肌醇3,4,5-三磷酸（phosphatidylinositol 3,4,5-triphosphate, PIP3）去磷酸化為磷酯酰肌醇4,5-二磷酸（phosphatidylinositol 3,4,5-triphosphate, PIP2），阻斷PI3KAkt/PKB信號轉(zhuǎn)導途徑，使細胞周期阻滯在G1期或促使細胞凋亡。PI3K是Akt/PKB信號轉(zhuǎn)導上游的調(diào)節(jié)激酶，當刺激信號通過細胞表面生長因子受體酪氨酸激酶傳遞，使PI3K活化時，PI3K通過其3位羥基磷酸化，使PIP2生成PIP3，PIP3在體內(nèi)積聚。PIP3作為某些生長因子如胰島素、表皮生長因子等細胞內(nèi)的第二信使，可吸引含有PH結(jié)構(gòu)功能域的磷酸肌醇依賴性蛋白激酶I和Akt/PKB使之激活，促進細胞生長，抑制其凋亡[10,15]。

3.2 FAK途徑 局灶粘附激酶（focal adhosion kinase, FAK）是整合素介導的信號轉(zhuǎn)導途徑中一個至關(guān)重要的分子，介導細胞與細胞外基質(zhì)的粘附，整合素通過與細胞外基質(zhì)作用而被活化，導致FAK酪氨酸磷酸化水平增高，并增加了其磷酸激酶的活性。PTEN基因N端序列與整合蛋白轉(zhuǎn)導復合體中的細胞骨架蛋白有較高同源性，張力蛋白參與細胞的聚集與粘附，其突變失活常與部分腫瘤的惡性進展有關(guān)，提示PTEN可能參與調(diào)節(jié)細胞的粘連、新血管生成、遷移。PTEN可通過幾種不同的途徑對FAK進行調(diào)節(jié)，通過與FAK直接作用，使FAK/P130的酪氨酸水平降低。PTEN脂質(zhì)磷酸酶活性具有調(diào)節(jié)FAK和Shc的磷酸化，使FAK去磷酸化而失活，抑制Shc磷酸化來調(diào)節(jié)細胞與細胞外基質(zhì)的相互作用，從而影響細胞的遷移、粘連、侵蝕和血管形成能力的各個方面[16]。

3.3 MAPK途徑 PTEN蛋白對絲裂原激活的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）途徑上游中的細胞外信號轉(zhuǎn)導激酶（extracellular signal-regulated kinase,ERK）、Ras的活化進行抑制還可抑制接頭蛋白Shc的磷酸化水平和Ras的活動，亦還能對ERK/通過下調(diào)Ras介導的MAPK信號途徑進行負調(diào)節(jié)，通過抑制介導MAPK有絲分裂信號向胞核傳導，從而負調(diào)控細胞生長[8]。另外，PTEN蛋白的N端與張力蛋白高度同源，其過度表達可抑制腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移，PTEN可阻止細胞周期素D1（cell cycleperiodin D1, cyclin D1）聚集，使其下調(diào)，抑制細胞周期進展。PTEN基因還能通過抑制胰島素受體底物-1（insulin recepter subtrate-1, IRS-1）的磷酸化從而抑制胰島素生長因子-1（insulin-like growth facter-1, IGF-1）對MAPK的激活，使細胞生長周期阻滯于G1期，抑制PIP3去磷酸化，從而阻止細胞生長及促進細胞凋亡[12,16]。MAPK途徑在細胞轉(zhuǎn)化和細胞周期調(diào)控中都起著重要的作用。

4 PTEN基因檢測常用方法

4.1 PTEN基因突變檢測常用技術(shù) 近年來隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，基因突變檢測方法多種多樣，這些方法各有優(yōu)劣?，F(xiàn)將常用的檢測方法簡述如下。

4.1.1 直接測序法 直接測序法是最直接的、可檢測已知和未知突變的而且也是目前被廣泛應用于基因突變檢測的一種方法[17]，王笑影[18]應用直接測序法和ARMS法同時檢測168例NSCLC患者EGFR基因的突變，檢測結(jié)果顯示突變患者61例，直接測序法檢測出32例，敏感性為52.5%，ARMS法檢測出57例，敏感性為93.4%（P＜0.001）。直接測序法靈敏度相對較低，且較易出現(xiàn)交叉污染。

4.1.2 基于即時PCR基礎(chǔ)上的方法（如ARMS法）[19]該法實現(xiàn)擴增時閉管操作，操作簡單，無需產(chǎn)物的后處理，極大程度地避免了擴增產(chǎn)物的污染且檢測靈敏度明顯高于直接測序法[18]，可檢測樣品中含量低至1.0%的突變基因，但只能檢測已知突變。

4.1.3 聚合酶鏈反應-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（PCR-SSCP）法該法簡單快速，因而被廣泛用于未知基因突變的檢測[20]，同時該法也是檢測抑癌基因PTEN突變最常應用的方法，但認為該法只能做為一種檢測突變的方法，Guo等[21]要測定突變的準確突變位點和類型，還需進一步測序，且該法還可能會存在1%的假陽性率[22,23]。

4.2 P T E N蛋白表達的檢測方法 免疫組織化學（immunohistochemistry, IHC）中鏈霉菌性生物素蛋白-過氧化物酶連接（streptavidin-perosidase, SP）法是最常用的檢測PTEN蛋白表達的方法，同時因其價格低廉、特異性高、操作簡便、工作量較小而被廣泛應用于臨床和科研工作中，IHC（SP法）的最大優(yōu)勢是能檢測到腫瘤特異性抗原，而且不會破壞細胞和組織的結(jié)構(gòu)特征，但該方法敏感性低。據(jù)大量文獻報道，SP法廣泛用于檢測多種腫瘤的PTEN蛋白的表達情況，舒紅等[24]用SP法對肺癌組織中PTEN蛋白的表達情況進行檢測、呂汕群等[25]用免疫組化SP檢測宮頸癌組織中PTEN蛋白的表達。

隨著腫瘤發(fā)病率的不斷增長，現(xiàn)在越來越多的標本進行PTEN基因的檢測，但到目前為止仍無敏感特異的方法。尋找有效可行的方法準確檢測PTEN基因是未來的發(fā)展方向。

5 PTEN在NSCLC中的表達及其臨床病理意義

5.1 PTEN蛋白在NSCLC組織中的表達結(jié)果 PTEN基因失活可表現(xiàn)為突變、缺失及PTEN mRNA或蛋白的低表達、失表達、甚至不表達，人類多種腫瘤中存在PTEN的失活，PTEN的失活導致其抑癌作用喪失，提示PTEN基因的失活在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預后中具有重要的作用。腦膠質(zhì)母細胞瘤、卵巢癌、前列腺癌、甲狀腺癌、肺癌等不同類型腫瘤PTEN的突變率和突變方式、多形性及PTEN蛋白失表達的機制可不同，可表現(xiàn)為雜合性缺失（loss of heterozygosity, LOH）、純合子缺失、表達缺失、甲基化、基因沉默等，而目前多數(shù)研究表明，PTEN發(fā)生異常的主要形式為LOH或純合子缺失。在不同腫瘤中PTEN基因缺失發(fā)生的早晚也不相同，大多數(shù)發(fā)生在腫瘤的后期。Shu等[24]研究報道在肺癌中，PTEN蛋白表達完全失活多發(fā)生在腫瘤的晚期，此時抑癌作用消失，腫瘤更具有浸潤性和遠處轉(zhuǎn)移能力，提示PTEN蛋白表達缺失對肺癌的進展具有一定的促進作用。張蕾等[26]應用聚合酶鏈反應及雜合性丟失分析法檢測PTEN的雜合性丟失，結(jié)果顯示肺癌中存在PTEN雜合性丟失。Kohon等[27]應用免疫組化方法研究40株肺癌細胞系，15株小細胞癌中6株P(guān)TEN基因純合性缺失，2株有錯義突變和無意義突變，25株NSCLC中2株純合性缺失，也顯示小細胞癌中的PTEN基因失表達高于NSCLC。Soria等[28]研究報道125例早期NSCLC患者中有30例（24%）PTEN陰性，其中20例PTEN陰性的標本有7例（35%）發(fā)生甲基化。盡管NSCLC中發(fā)生PTEN基因突變是少見的，但PTEN蛋白表達缺失或下降是相對較為普遍的[27]。大量研究結(jié)果認為PTEN蛋白表達發(fā)生異常主要為LOH，但Whang等[29]研究了10例晚期前列腺癌，僅1例純合性丟失，其余9例中有5例顯示不表達或表達降低，經(jīng)用甲基化試劑處理，使無表達細胞恢復了表達，故認為造成PTEN蛋白表達缺失部分是源于該基因的甲基化。關(guān)于PTEN表達異常的主要方式及其他表達方式或成分在肺癌發(fā)生、發(fā)展中是否存在異常，還需進一步研究。

5.2 PTEN蛋白的表達與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系 由于國內(nèi)外有關(guān)PTEN與NSCLC的研究不多，結(jié)果也不完全一致。到目前為止，大量研究發(fā)現(xiàn)，PTEN蛋白低水平表達與NSCLC的分化程度、臨床病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、生存率及預后密切相關(guān)，而與患者的年齡、性別、腫瘤大小、部位、組織學類型、吸煙指數(shù)、身體狀況及體重減輕無關(guān)。

5.2.1 PTEN表達與NSCLC分化程度及病理分期、分級的關(guān)系 PTEN蛋白表達隨NSCLC組織分化程度的降低、臨床分期的升高而降低，表明PTEN蛋白表達水平低的肺癌惡性程度相對增高。張紅蕊等[30]觀察到，PTEN蛋白表達與非小細胞肺癌TNM分期相關(guān)，在I期-II期比III期-IV期陽性表達率明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義。Goncharuk等[31]也觀察到PTEN的表達與腫瘤分期、分化程度明顯相關(guān)。在高中分化組、I期-II期組的陽性表達率比低分化組、III期-IV期陽性表達率明顯增高，預示著在腫瘤進展過程中伴隨著PTEN的下調(diào)，PTEN的下調(diào)與生存期的縮短明顯相關(guān)，可作為判斷患者病情預后不良的重要指標，說明PTEN蛋白表達缺失或下降在NSCLC發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用。

5.2.2 PTEN表達與NSCLC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系 PTEN表達下調(diào)與肺癌的浸潤、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，PTEN蛋白低表達或表達陰性的肺癌患者更容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，與張建海等[32]研究的結(jié)論基本一致。其原因可能是因為PTEN可使FAK去磷酸化，失去對FAK介導的細胞浸潤、轉(zhuǎn)移和生長的抑制作用[24]，從而使得癌組織更容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

5.2.3 PTEN表達與NSCLC患者預后的關(guān)系 眾多研究表明，PTEN的蛋白表達缺失對NSCLC的發(fā)展有促進作用是NSCLC發(fā)生發(fā)展過程中的晚期事件之一。隨肺癌惡性程度的增高及遠處轉(zhuǎn)移的出現(xiàn)PTEN陽性表達率明顯降低。Bepler等[33]觀察到，PTEN表達率高的NSCLC患者比表達率低的患者生存期長、疾病復發(fā)轉(zhuǎn)移較晚。張建海等[33]報道PTEN蛋白表達陽性患者平均生存時間較陰性患者明顯延長，其5年生存率明顯高于PTEN蛋白表達陰性患者，說明PTEN蛋白表達陽性率高的肺癌患者往往預后較好。因此大量資料證實NSCLC分化程度、臨床分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等均是影響NSCLC患者病情嚴重程度及預后的重要因素，而PTEN蛋白表達高低卻是判斷NSCLC病情嚴重程度及預后的一個獨立預測因子[34]。

6 小結(jié)及展望

PTEN被稱為繼p53時代后突變率最高的“腫瘤抑制基因”，作為到目前為止被發(fā)現(xiàn)的第一個具有雙重特異性磷酸酶活性的抑癌基因，PTEN通過誘導細胞分化、凋亡、阻滯細胞周期進程、調(diào)節(jié)細胞增殖、抑制腫瘤血管生長及細胞的粘附等多種途徑發(fā)揮其抑制肺癌發(fā)生發(fā)展的進程，成為肺癌研究的新焦點。PTEN基因失活與NSCLC發(fā)生發(fā)展、組織分化、臨床病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及生存期等生物學過程有著極其重要關(guān)聯(lián)，并可成為判斷NSCLC患者病情嚴重程度及預后不良的指標之一。因此深入研究PTEN與NSCLC的內(nèi)在聯(lián)系將對NSCLC的早期診斷、有效治療和預后判斷起重要的指導作用。同時，隨著人們對PTEN研究的逐步加深，PTEN的抑癌機制、PTEN與其他癌基因、抑癌基因之間的相互作用，及其與細胞凋亡和凋亡相關(guān)基因之間的相互關(guān)系會進一步明朗，這將為臨床監(jiān)測、預后評估、藥物療效、開發(fā)新的抗腫瘤藥物及指導臨床治療提供新思路，也為腫瘤細胞耐化療藥的研究、肺癌PTEN基因的靶向藥物治療提供新途徑。