董尚文 綜述 張鵬 審校

近年來腫瘤發(fā)病率逐年增高,嚴(yán)重威脅到人們的健康及社會(huì)發(fā)展,因此受到人們的廣泛關(guān)注.現(xiàn)代腫瘤學(xué)理論觀點(diǎn)認(rèn)為,腫瘤的生物活性,不僅與經(jīng)典的遺傳機(jī)制(DNA核苷酸序列的改變)相關(guān),還與表觀遺傳學(xué)(epigenetics)機(jī)制密切相關(guān).

表觀遺傳學(xué)是研究DNA序列未發(fā)生改變而基因表達(dá)發(fā)生改變的科學(xué),即通過對(duì)核小體上DNA和組蛋白的結(jié)構(gòu)修飾及其之后的染色質(zhì)重塑、非編碼RNA調(diào)節(jié)等,從而在局部或整體上調(diào)節(jié)基因表達(dá).腫瘤分子生物學(xué)研究表明,表觀遺傳學(xué)的紊亂與基因的變異一起參與了腫瘤發(fā)生發(fā)展的整個(gè)過程,其中包括腫瘤細(xì)胞增殖與分化、細(xì)胞周期的調(diào)控、腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移以及腫瘤細(xì)胞逃避宿主免疫監(jiān)視等.基因的表觀遺傳修飾主要包括DNA甲基化和組蛋白修飾[1].其中組蛋白修飾,即核小體核心組蛋白在相關(guān)酶的作用下,其尾部常常發(fā)生翻譯后修飾,包括甲基化、磷酸化、乙?；?、泛素化、腺苷酸化和ADP核糖基化等.這些修飾可以影響組蛋白與DNA雙鏈的親和力而改變?nèi)旧|(zhì)的狀態(tài),使其疏松或者凝集,也可以影響轉(zhuǎn)錄因子與結(jié)構(gòu)基因DNA的啟動(dòng)子序列的結(jié)合,對(duì)基因表達(dá)調(diào)控具有類似DNA遺傳密碼的作用,故被稱為"組蛋白密碼"[2-4].組蛋白氨基末端的修飾具有多面性、復(fù)雜性和特異性.近幾年由于更多的組蛋白甲基化抗體的發(fā)現(xiàn),針對(duì)組蛋白甲基化的研究日益增多.

組蛋白的甲基化修飾是指發(fā)生在H3和H4組蛋白N端精氨酸或者賴氨酸殘基不同位點(diǎn)上的不同程度的甲基化,由含有SET結(jié)構(gòu)域的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)催化完成.組蛋白甲基化的功能主要體現(xiàn)在異染色質(zhì)形成、基因印記、X染色體失活和轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面.目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)和證實(shí)有大概700多種含SET[Su(var)3-9, Enhancer-of-zeste,Trithorax]結(jié)構(gòu)域的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶,其中人源的就有100多種,它們參與了異染色質(zhì)形成、基因印記、X染色體失活、染色體重塑、免疫生物學(xué)效應(yīng)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控等多種生理功能[5].組蛋白甲基化酶的異常與多種人類疾病如肝癌等腫瘤、風(fēng)濕等炎性疾病、喉軟骨軟化病等特殊疾病的發(fā)生密切相關(guān)[6].SMYD3(SET and MYND domain containing 3)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種具有組蛋白甲基化功能的蛋白.它能夠使染色體組蛋白(H3K4等)發(fā)生二甲基化或三甲基化,作為RNA多聚酶復(fù)合物的一個(gè)成員,在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中具有重要作用.它能夠影響下游癌基因、細(xì)胞周期調(diào)控基因、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因、細(xì)胞核激素受體、粘附相關(guān)基因等,能夠抑制腫瘤細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖及侵襲、擴(kuò)散[7].多項(xiàng)研究[7-9]證實(shí)SMYD3在肝癌、結(jié)腸癌、乳腺癌等癌細(xì)胞中高表達(dá),而在相應(yīng)正常組織中表達(dá)量較低甚至檢測(cè)不到.基于SMYD3對(duì)于組蛋白甲基化水平的影響與腫瘤的預(yù)后存在明顯關(guān)聯(lián),另外SMYD3基因沉默的實(shí)驗(yàn)觀察到明顯的腫瘤細(xì)胞生長抑制、凋亡增加.可見,SMYD3與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后有密切關(guān)系,它能夠通過不同的信號(hào)通路調(diào)控癌基因等許多與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)基因的表達(dá),并增強(qiáng)細(xì)胞的增殖和遷移能力.抑制SMYD3的表達(dá)可以阻礙腫瘤細(xì)胞生長、遷移并誘導(dǎo)凋亡,改善腫瘤預(yù)后,因此SMYD3日益成為人們關(guān)注的焦點(diǎn).

1 SMYD3的結(jié)構(gòu)和功能

活性.SMYD3的甲基化作用可能是通過對(duì)其N端功能域的剪切去除或者與HSP90A發(fā)生相互作用而實(shí)現(xiàn)的.最近研究[13,14]表明SMYD3同樣可以作用于H4K20、H4K5.SMYD3也許可以通過其他作用位點(diǎn)促進(jìn)腫瘤發(fā)生,新的作用位點(diǎn)有待進(jìn)一步研究.

2 SMYD3與下游基因的關(guān)系

2004年,Hamamoto等[7]通過cDNA芯片和半定量RT-PCR技術(shù),在人類肝細(xì)胞癌和結(jié)腸癌細(xì)胞中首次發(fā)現(xiàn)了組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶SMYD3[10].SMYD3基因位于人類染色體1q44,由16個(gè)外顯子組成,DNA(GenBank登錄號(hào):NM_64754)由1,477個(gè)堿基對(duì)組成,其外顯子可編碼428個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì).SMYD3基因所編碼的蛋白為兩葉結(jié)構(gòu),折疊成5個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域:SET domain、MYND、SET-I、post-SET、C-terminal domain(CTD).其中重要的兩個(gè)功能結(jié)構(gòu)域?yàn)?SET domain和MYND結(jié)構(gòu)域.SET domain由兩部分組成:S序列(S-sequence)與核心SET結(jié)構(gòu)域(core SET domain),兩部分被MYND和SET-I分開.然而,盡管在初級(jí)序列兩部分是分隔的,但是在空間結(jié)構(gòu)上兩部分組合在一起折疊形成保守的SET結(jié)構(gòu)域.SET結(jié)構(gòu)域大約含有130個(gè)氨基酸,具有甲基化轉(zhuǎn)移酶功能,可以特異性地使染色體組蛋白H3K4形成二甲基化或三甲基化,從而導(dǎo)致染色體空間結(jié)構(gòu)成為松散開放的狀態(tài)[7].N端第1-28位氨基酸的MYND(myeloid translocation protein 8, Nervy,DEAF1)鋅指功能結(jié)構(gòu)域,能夠特定地與相關(guān)基因啟動(dòng)子區(qū)域的基因序列5c-CCCTCC-3c或5c-GGAGGG-3c相結(jié)合,使SET結(jié)構(gòu)域的甲基化功能發(fā)揮,影響基因轉(zhuǎn)錄;其表面帶有大量的正電荷,通過一個(gè)富含脯氨酸的序列介導(dǎo)蛋白-蛋白相互作用及DNA與之結(jié)合,從而增強(qiáng)SMYD3的組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶活性.另外兩個(gè)參與SMYD3活性位點(diǎn)形成的區(qū)域,一個(gè)是SET結(jié)構(gòu)域后一個(gè)富含半胱氨酸的三級(jí)結(jié)構(gòu)post-SET,能夠結(jié)合鋅離子;另一個(gè)是C端區(qū)域包含的一個(gè)三四重復(fù)氨基端序列(tetratrico-peptide repeat, TPR)結(jié)構(gòu).二者同SET結(jié)構(gòu)域一起共同組成了一個(gè)深而窄的底物結(jié)合口袋,而第239位酪氨酸的羥基則是SMYD3發(fā)揮酶活性必要條件[11].

SMYD3可以接受S-腺苷甲硫氨酸提供的甲基,使相關(guān)組蛋白H3賴氨酸4(H3K4)發(fā)生甲基化,造成染色質(zhì)空間結(jié)構(gòu)變化,從而改變轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的緊湊程度和開放程度,從而對(duì)基因轉(zhuǎn)錄發(fā)揮調(diào)控作用.Sliva等[12]認(rèn)為SMYD3 N端的SET-N區(qū)域可以抑制其甲基化轉(zhuǎn)移酶的

有研究通過cDNA芯片分析,發(fā)現(xiàn)SMYD3可以明顯改變80個(gè)候選基因的表達(dá),其中61個(gè)上調(diào)、19個(gè)下調(diào).在這些相關(guān)的下游基因中,包括癌基因、抑癌基因、細(xì)胞周期調(diào)控基因、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)一系列基因等與腫瘤發(fā)生發(fā)展過程密切相關(guān)的基因[15-17],如c-Met、雄激素受體(androgen receptor, AR)[18-20]、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMP)-9、Myc[21]、CrkL、Wnt10b[8]、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白結(jié)合鋅指結(jié)構(gòu)基因(retinoblastoma protein-interacting zinc finger gene,RIZ)[22]、E2F轉(zhuǎn)錄因子1(E2F transcription factor 1,E2F1)、NK2同源序列8(Nkx2.8)、端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase, hTERT)[15];控制細(xì)胞周期的基因如細(xì)胞周期蛋白G1、細(xì)胞周期素依賴激酶(cyclin-dependent kinase 2, CDK2);控制信號(hào)傳導(dǎo)的基因如信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子(signal transducer and activator of transcription 1, STAT1)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAP3K)、磷脂酰肌醇激酶(phosphoinositide 3-kinases, PIK3CB);細(xì)胞核激素受體如孕激素受體亞型( progesterone receptor, PR-A)[23-25];轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor, TGF)家族如肌生成抑制蛋白;血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體1(vascular endothelial growth factor receptor 1, VEGFR1);粘附相關(guān)基因如CD31、整合素α5.相關(guān)研究[26]表明,SMYD3可通過激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶/絲裂原活化蛋白激酶(extracellular signal regulated kinase/mitogen activated protein kinase, ERK/MAPK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和上調(diào)細(xì)胞周期相關(guān)基因細(xì)胞周期素D1(CyclinD1)和細(xì)胞周期素依賴激酶(cyclin-dependent kinase 4, CDK4)的水平提高腫瘤細(xì)胞的增殖能力.此外,c-myc基因是作為一個(gè)十分重要的原癌基因,在多種腫瘤組織中表達(dá)明顯增加,c-myc激活能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖,抑制凋亡.SMYD3通過直接或間接途徑激活c-myc,從而發(fā)揮促進(jìn)成瘤作用[21].與SMYD3相關(guān)的另一個(gè)抑制癌基因RIZ1,它具有H3-K9組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性,通過這一甲基化作用抑制相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá).在對(duì)包括肝癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌等多種癌組織的檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)RIZ1低表達(dá)或者缺乏活性,研究表明這種情況可能與其啟動(dòng)子區(qū)域過甲基化有關(guān).一個(gè)有趣的現(xiàn)象是在肝癌細(xì)胞中抑制SMYD3表達(dá)可能使過甲基化的RIZ1啟動(dòng)子區(qū)域去甲基化,進(jìn)而RIZ1轉(zhuǎn)錄活性、甲基化活性都得以恢復(fù),相反地,在RIZ1活性正常的細(xì)胞中轉(zhuǎn)染SMYD3能夠觀察到RIZ1過甲基化的結(jié)果[22].除此之外,VEGFR1作為SMYD3的作用靶點(diǎn),也被相關(guān)研究[17]證實(shí).新研究[8]發(fā)現(xiàn),在乳腺癌的發(fā)生中SMYD3可能通過激活原癌基因WNT10B而發(fā)揮其致癌作用.同樣在乳腺癌細(xì)胞中,SMYD3作為雌激素受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄輔助激活因子,使位于目標(biāo)基因啟動(dòng)子區(qū)域的雌激素反應(yīng)元件的H3K4甲基化.SMYD3表達(dá)下調(diào)可使H3K4甲基化減少,雌激素受體目標(biāo)基因表達(dá)受到抑制[8,23,27].MMP家族成員使細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)成分減少,同時(shí)激活生長因子.SMYD3表達(dá)沉默使MMP-9基因的啟動(dòng)子H3K4甲基化選擇性減少,從而該基因表達(dá)減少.SMYD3過度表達(dá)導(dǎo)致MMP-9在白細(xì)胞轉(zhuǎn)化、纖維肉瘤細(xì)胞、乳腺癌等表達(dá).過氧化物酶15-LOX-1表達(dá)下調(diào)與許多惡性腫瘤的發(fā)病機(jī)理相關(guān),這些腫瘤包括:霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma,HL)、前列腺癌[28]、結(jié)直腸癌.SMYD3過度表達(dá)可誘導(dǎo)15-LOX-1啟動(dòng)子激活[29].通過siRNA抑制SMYD3基因表達(dá)可以減少結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116和霍奇金淋巴瘤細(xì)胞L1236的染色體H3K4三甲基化,并且減弱轉(zhuǎn)錄因子c-myc和SP1與hTERT基因啟動(dòng)子結(jié)合.由此可以看出,SMYD3在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮其活躍生物學(xué)功能,其更多的作用靶點(diǎn)、確切的作用機(jī)制尚待進(jìn)一步闡明.

3 SMYD3與細(xì)胞生物學(xué)活性

細(xì)胞周期主要分4個(gè)時(shí)期:G1期(DNA合成前期)、S期(DNA合成期)、G2期(DNA合成后期)和M期(有絲分裂期).細(xì)胞增殖調(diào)控包括兩部分:環(huán)境中控制細(xì)胞增殖的因素及細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞增殖有關(guān)的基因及其產(chǎn)物相互作用,即生長因子/生長因子受體如c-Met、細(xì)胞周期有關(guān)基因及其產(chǎn)物如CyclinD1、周期蛋白cyclinA、周期蛋白激酶CDK1等方面調(diào)控.染色體組蛋白修飾狀態(tài)的改變可以影響細(xì)胞周期進(jìn)程.Liu等[18,29]研究認(rèn)為SMYD3可以加快S期,促進(jìn)細(xì)胞從S期向G2期過渡.但Zhao等[30]發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素可以使SMYD3降低,引起骨髓瘤U266細(xì)胞G2/M期停滯.這可能與SMYD3的高度表達(dá)導(dǎo)致CDK2(cyclin dependent kinase 2)和DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶IIβ等表達(dá)上調(diào)有關(guān)[7],另外,hTERT編碼端粒酶復(fù)合物的催化亞基,這是細(xì)胞永生化的先決條件.在hTERT基因啟動(dòng)子區(qū)域有5個(gè)SMYD3結(jié)合位點(diǎn).SMYD3直接與端粒酶(hTERT)編碼基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合,上調(diào)hTERT mRNA表達(dá),并增加端粒酶活性,直接介導(dǎo)細(xì)胞永生化,發(fā)揮促瘤效應(yīng)[15].

4 SMYD3與腫瘤之間的關(guān)系

國內(nèi)外學(xué)者研究表明,SMYD3與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切,能夠影響腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移及粘附等生物學(xué)行為.SMYD3與許多腫瘤相關(guān)如:結(jié)直腸癌、肝細(xì)胞癌[7]、胰腺癌、前列腺癌[31,32]、多發(fā)性骨髓瘤、肺癌、乳腺癌、腦瘤[33]、食管鱗癌[34]等.有研究[22]發(fā)現(xiàn),SMYD3在大多數(shù)肝細(xì)胞癌異常高表達(dá),而在正常組織中不表達(dá)或表達(dá)很弱.采用siRNA技術(shù)使SMYD3表達(dá)沉默后,肝癌細(xì)胞凋亡有所增加,細(xì)胞的增殖也受到一定程度的抑制.Guo等[9]發(fā)現(xiàn)丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)可以通過調(diào)節(jié)SMYD3和組蛋白甲基化使抑癌基因RASSF1A(ras association domain family 1A)啟動(dòng)子的甲基化水平上調(diào).Zeng等[35]發(fā)現(xiàn)miR-124可抑制SMYD3表達(dá),HCVc可以通過DNMT1使miR-124表達(dá)水平減低,SMYD3表達(dá)增高,可以促進(jìn)膽管癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲.Yang等[36]研究發(fā)現(xiàn)在乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)(+)的細(xì)胞或組織中,SMYD3與HBX呈正相關(guān);隨著HBV沉默,SMYD3表達(dá)減少.Josse等[37]通過比較在PHH和HepaRG細(xì)胞中經(jīng)黃曲霉毒素誘導(dǎo)的基因表達(dá)改變,發(fā)現(xiàn)在肝細(xì)胞中許多基因發(fā)生改變,特別是與p53和SMYD3相關(guān)的基因發(fā)生改變.Hamamoto等[7]發(fā)現(xiàn)SMYD3在結(jié)腸癌中表達(dá)的研究也提示明顯增高,抑制其表達(dá)后結(jié)腸癌細(xì)胞生長和遷移明顯受抑,凋亡增加.在乳腺癌的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)在大多數(shù)乳腺癌組織中SMYD3表達(dá)較正常組織明顯增高,而利用siRNA技術(shù)抑制SMYD3的表達(dá)后可以改變?nèi)橄侔┘?xì)胞的細(xì)胞行為學(xué)特征,癌細(xì)胞出現(xiàn)生長受抑、凋亡增加等[38].Luo等[39]發(fā)現(xiàn)SMYD3可作用于RhoA/MRTF-A(myocardin-related transcription factor-A)信號(hào)通路,SMYD3過度表達(dá)可促進(jìn)MRTF-A介導(dǎo)上調(diào)肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈9(MYL9)及MCF-7乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移.當(dāng)內(nèi)源性MRTF-A和SMYD3經(jīng)特定的siRNAs抑制時(shí),可觀察到與之相反的結(jié)果.Wang等[40]研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)SMYD3基因的表達(dá)后,宮頸癌細(xì)胞HeLa的增殖、遷移能力明顯受限、集落形成減少、同時(shí)細(xì)胞凋亡有所增加.Liu等[18]發(fā)現(xiàn)SMYD3可促進(jìn)前列腺癌發(fā)生,并且通過表觀遺傳學(xué)上調(diào)雄激素受體(androgen receptor, AR)表達(dá).SMYD3缺失使SMYD3和/或AR的目標(biāo)基因Bcl-xL、MMP-9、hTERT等表達(dá)下調(diào)有助于誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡.另外,Nakamura等[41]通過實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),SMYD3在高轉(zhuǎn)移性的胰腺癌中較正常組織表達(dá)有所升高,但作用機(jī)制尚需探討.此外有研究稱:在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人SMYD3基因后,小鼠成纖維細(xì)胞NIH3T3的生長和集落形成明顯加快,細(xì)胞周期S期縮短,遷移和粘附能力增加,細(xì)胞的耐藥性增強(qiáng)[42].另外,SMYD3基因啟動(dòng)子區(qū)域的序列重復(fù)多態(tài)性是否和組蛋白甲基化狀態(tài)、進(jìn)而和腫瘤發(fā)生之間存在密切關(guān)系,目前存在爭議.一項(xiàng)基于前列腺癌的研究認(rèn)為:組蛋白H3的甲基化狀態(tài)和前列腺癌患者的生存率以及腫瘤的生物學(xué)行為明顯相關(guān),并且這種甲基化狀態(tài)的改變可能出現(xiàn)在染色質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)變化之前,可能是腫瘤生物學(xué)行為的基礎(chǔ)[43].在結(jié)直腸癌、乳腺癌、肝癌細(xì)胞的相關(guān)研究表明SMYD3基因啟動(dòng)子區(qū)域的序列重復(fù)多態(tài)性是腫瘤發(fā)生的一個(gè)危險(xiǎn)因素.Bernd等[44]發(fā)現(xiàn),在家族聚集性乳腺癌患者中,SMYD3基因啟動(dòng)子去的序列重復(fù)多態(tài)性發(fā)生的概率更高.Mazur等[45]運(yùn)用蛋白質(zhì)芯片技術(shù)證實(shí)MAP3K2激酶是SMYD3的一個(gè)作用位點(diǎn).SMYD3可使MAP3K2甲基化,激活MAP激酶信號(hào)通路,經(jīng)Ras信號(hào)通路促瘤形成.運(yùn)用胰腺導(dǎo)管癌和肺腺癌小鼠模型研究發(fā)現(xiàn),降低SMYD3的催化活性可以抑制Ras引起的腫瘤發(fā)展.在腫瘤細(xì)胞系中,SMYD3介導(dǎo)MAP3K2的260賴氨酸甲基化,從而加強(qiáng)Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路活性.SMYD3缺失可以與MEK抑制劑協(xié)調(diào)作用,共同抑制Ras導(dǎo)致的腫瘤發(fā)展.作為MAP激酶通路的關(guān)鍵的負(fù)調(diào)節(jié)因子,PP2A磷酸酶復(fù)合物可以與MAP3K2結(jié)合,而甲基化阻斷了它們的相互作用.研究結(jié)果證實(shí)賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶在細(xì)胞質(zhì)激酶信號(hào)通路的新作用,并發(fā)現(xiàn)SMYD3在調(diào)節(jié)Ras致瘤信號(hào)通路中具有重要作用.

5 未來研究空間

綜上所述,相關(guān)癌組織或癌細(xì)胞中高表達(dá)的SMYD3基因是研究腫瘤增殖、侵襲,以及對(duì)下游基因作用的研究焦點(diǎn).目前的研究傾向于認(rèn)為SMYD3可能在腫瘤形成過程中起重要作用,大量和SMYD3存在密切聯(lián)系、又在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用的蛋白或核酸分子被相繼發(fā)現(xiàn),但是SMYD3與下游因子的作用機(jī)制還沒有得到確切的證據(jù).因此,更廣泛地研究SMYD3在腫瘤中的表達(dá)和作用,以及更深入地探討SMYD3的作用機(jī)制是科學(xué)工作者進(jìn)一步努力的方向.