杜恒 車國衛(wèi)

腫瘤的生長與腫瘤細(xì)胞所處的內(nèi)外環(huán)境有著密切關(guān)系,其中腫瘤微環(huán)境發(fā)揮了重要作用.腫瘤微環(huán)境指腫瘤細(xì)胞周圍的免疫細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子等與腫瘤細(xì)胞相互作用而構(gòu)成的局部內(nèi)環(huán)境.腫瘤微環(huán)境中的主要細(xì)胞成分包括癌相關(guān)成纖維細(xì)胞(cancerassociated fibroblasts, CAFs)、癌相關(guān)巨噬細(xì)胞、腫瘤微血管及淋巴管、炎癥細(xì)胞及免疫細(xì)胞等.CAFs作為腫瘤微環(huán)境中的主要部分,不僅通過分泌多種細(xì)胞因子與癌細(xì)胞之間存在產(chǎn)生廣泛的交互對話(cross-talk),而且在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、移動和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,維持腫瘤微環(huán)境慢性炎癥狀態(tài)易化癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移,腫瘤微血管形成等方面也扮演十分重要的角色[1-3].腫瘤細(xì)胞的快速增殖與生長是以大量的物質(zhì)和能量代謝為基礎(chǔ),癌細(xì)胞及其"微環(huán)境"的物質(zhì)供應(yīng)和能量代謝必然以不同于正常細(xì)胞的代謝方式來進(jìn)行,以此適應(yīng)癌細(xì)胞不受調(diào)控的快速生長及侵襲轉(zhuǎn)移[4,5].經(jīng)典的瓦伯格效應(yīng)(Warburg effect)認(rèn)為癌細(xì)胞即使在氧供充足的情況下仍以糖酵解生成乳酸的方式進(jìn)行物質(zhì)能量代謝[6].近來也有研究[7-10]發(fā)現(xiàn)CAFs具有獨特的代謝方式,即CAFs通過糖酵解方式將攝取的葡萄糖轉(zhuǎn)化為乳酸,供給其周圍的癌細(xì)胞,而癌細(xì)胞則直接用乳酸進(jìn)行三羧酸循環(huán)(tricarboxylic acid cycle, TCA).由癌細(xì)胞誘導(dǎo)、氧化應(yīng)激造成的CAFs"線粒體自噬"(mitophagy)是CAFs代謝方式改變的基礎(chǔ).癌細(xì)胞與微環(huán)境中CAFs物質(zhì)與能量代謝方式轉(zhuǎn)換的相互適應(yīng),使癌細(xì)胞的營養(yǎng)物質(zhì)及能量來源主要直接依賴于CAFs而不依賴于腫瘤微血管.癌細(xì)胞能量來源的變化可能是目前針對"種子"(腫瘤細(xì)胞)治療效果差(如化療藥物耐藥)及抗血管藥物(血管內(nèi)皮生長因子抑制劑,如貝伐珠單抗)短期有效而長期耐藥的主要原因[11,12].研究CAFs代謝方式轉(zhuǎn)換的分子機(jī)制,有助于我們更好地了解腫瘤的生長環(huán)境,并有望成為腫瘤治療的新策略.

1 CAFs的特性及代謝特點

CAFs是癌組織基質(zhì)中呈激活狀態(tài)的成纖維細(xì)胞[13,14].相比于正常的成纖維細(xì)胞(normal fibroblasts, NFs),CAFs具有如下幾個方面的不同:①CAFs細(xì)胞的形態(tài)呈大小不均勻的紡錘形,排列無方向性,胞質(zhì)內(nèi)含肌絲,而NFs一般為大小一致,排列整齊的星形,其胞質(zhì)內(nèi)不含肌絲但有豐富的高爾基體;②CAFs的分子標(biāo)志表現(xiàn)為高表達(dá)α-平滑肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、成纖維細(xì)胞活化蛋白(fibroblast activation protein, FAP)、波形蛋白(Vimentin),而上皮性鈣粘附因子(E-cadherin)、細(xì)胞角蛋白-19(cytokeratin-19,CK-19)、CD31等上皮性標(biāo)志低表達(dá)甚至不表達(dá)[1,13,15];③CAFs能通過不同的途徑促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移.與NFs抑制癌細(xì)胞的作用相反,CAFs則能通過Ark和Erk途徑、或分泌IL-6、IL-8等炎性因子促非小細(xì)胞肺癌(nonsmall cell lung cancer, NSCLC)增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[16,17].除了IL-6、IL-8,CAFs還與多種炎癥因子相關(guān)[18],CAFs介導(dǎo)的腫瘤微環(huán)境慢性炎癥狀態(tài)能易化癌細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[19].除了上述細(xì)胞因子途徑,CAFs還可通過SDF-1/CXCL-12、IL-6、及P16INK4A等不同途徑促進(jìn)癌微環(huán)境中血管形成而間接發(fā)揮促進(jìn)癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的作用[3,20,21].此外,有研究[1]發(fā)現(xiàn)單獨注射CAFs于免疫缺陷的小鼠不會形成腫瘤,這表明CAFs自身并無成瘤能力.另一些研究[21-23]表明,肺腺癌對靶向治療藥物(目前主要是吉非替尼)產(chǎn)生耐藥性被認(rèn)為可能與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換(epithelial- mesenchymal transition, EMT)及通過該過程形成的CAFs有關(guān).

較之正常的成纖維細(xì)胞,CAFs的代謝方式也具有特殊性.有研究[8,24]認(rèn)為CAFs與癌細(xì)胞的代謝偶聯(lián)方式更符合于 "反瓦伯格效應(yīng)",具體表現(xiàn)為:在周圍癌細(xì)胞的氧化應(yīng)激的作用下,CAFs的線粒體破壞并被溶酶體清除,迫使CAFs使用糖酵解的方式進(jìn)行代謝,產(chǎn)生的乳酸鹽被癌細(xì)胞膜高表達(dá)的MCT1(一種將乳酸轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)的膜蛋白)攝取,攝入的乳酸鹽進(jìn)入癌細(xì)胞線粒體內(nèi)參與TCA,為癌細(xì)胞的生長提供能量[8].其中CAFs產(chǎn)生的乳酸鹽還能刺激癌細(xì)胞的線粒體發(fā)生和氧化磷酸化反應(yīng).因此,氧化應(yīng)激導(dǎo)致的CAFs線粒體破壞(線粒體自噬)是其代謝方式改變的原因[25],免疫組化染色的結(jié)果[11]也證實癌組織基質(zhì)內(nèi)Bnip3L、ATG16L、Cathepsink A和D等線粒體損傷標(biāo)志物呈現(xiàn)強(qiáng)陽性表達(dá).

CAFs的代謝方式的改變還具有"場效應(yīng)"(field effect)的特點,即CAFs能將其自身代謝方式的改變傳播給周圍正常的成纖維細(xì)胞.有關(guān)"場效應(yīng)"的機(jī)制目前還不清楚,可能是通過癌組織中廣泛存在的癌相關(guān)炎癥反應(yīng)的微環(huán)境產(chǎn)生上述作用[9].

2 CAFs代謝的研究現(xiàn)狀

自20世紀(jì)30年代Warburg提出癌細(xì)胞代謝的"瓦伯格效應(yīng)"以來,大量研究主要集中在針對癌細(xì)胞代謝方式上.在PubMed中以"Warburg effect [Title]"檢索,最早的文獻(xiàn)為1969年.以"(cancer cells [Title]) AND metabolism[Title]"為檢索式,截至2014年3月31日,共命中272篇文獻(xiàn).而以"(cancer associated fibroblasts[Title])AND metabolism[Title]"檢索,僅命中3篇文獻(xiàn).為避免檢索式設(shè)計造成的文獻(xiàn)檢索遺漏,對上述3篇文獻(xiàn)所列出的參考文獻(xiàn)進(jìn)行復(fù)習(xí),并根據(jù)相關(guān)參考文獻(xiàn)的作者信息等進(jìn)行手工檢索,共得到與CAFs代謝相關(guān)的文獻(xiàn)36篇,最早的文獻(xiàn)發(fā)表于2006年.說明CAFs的代謝特點近幾年才逐漸被認(rèn)識到.針對CAFs代謝機(jī)制的研究則主要集中于乳腺癌,而其他腫瘤(如肺癌、肝癌、結(jié)直腸癌等)則研究相對較少.目前研究的共識可概括為"反瓦伯格效應(yīng)"即癌細(xì)胞和周圍CAFs存在的共同演化(co-evolving)和代謝偶聯(lián)(metabolic coupling)現(xiàn)象.

3 CAFs代謝方式轉(zhuǎn)變可能的分子機(jī)制

3.1 轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor β, TGF-β)信號途徑 TGF-β廣泛參與到炎癥、肺纖維化、肺癌等多種疾病當(dāng)中并對疾病的發(fā)生發(fā)展起到十分重要的作用[26,27].研究發(fā)現(xiàn)TGF-β在癌的發(fā)生演進(jìn)中扮演"雙刃劍"的角色,即在腫瘤起始時抑制腫瘤細(xì)胞的生成,隨后則促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移.Zavadil等[28]研究表明,TGF-β通過促進(jìn)EMT過程,進(jìn)而促進(jìn)癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移.此外,有研究[11,29]發(fā)現(xiàn):配體依賴的(ligand dependent)或細(xì)胞分泌的TGF-β能改變CAFs的代謝方式,上調(diào)CAFs中低氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)的表達(dá).HIF-1α[30]是一種轉(zhuǎn)錄因子,能介導(dǎo)細(xì)胞對低氧和氧化應(yīng)激的應(yīng)答.由于CAFs中氧化應(yīng)激增強(qiáng)、線粒體功能受損(表現(xiàn)為OXPHOS表達(dá)上調(diào)),線粒體自噬增強(qiáng)(表現(xiàn)為Bnip3L表達(dá)增強(qiáng))、糖酵解生成增加產(chǎn)生大量乳酸鹽,同時還由于TGF-β誘導(dǎo)上調(diào)的CAFs膜蛋白MCT4,從而使胞內(nèi)的乳酸鹽排出增多,為癌細(xì)胞的生長提供"燃料".有研究表明TGF-β的作用還具有細(xì)胞特異性即來源于CAFs自分泌或癌細(xì)胞旁分泌的TGF-β必須作用于CAFs細(xì)胞才能發(fā)揮作用,單獨激活癌細(xì)胞膜上的TGF-β受體對癌細(xì)胞的生長不產(chǎn)生影響.

3.2 小窩蛋白(Caveolin-1, Cav-1)信號途徑 Cav-1一直被認(rèn)為具有抑制癌癥的作用[31],其低表達(dá)是乳腺癌預(yù)后差的獨立危險因素,與腫瘤的早期復(fù)發(fā)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及他莫昔芬耐藥等均有關(guān).多項研究[7,32]均表明Cav-1的低表達(dá)與CAFs的代謝方式的改變具有密切的關(guān)系.引起Cav-1下調(diào)的因素有很多,H-Ras突變、p53突變、cMyc高表達(dá)均可導(dǎo)致其表達(dá)下調(diào).而CAFs中的Cav-1下調(diào)的根本原因是氧化應(yīng)激.

癌細(xì)胞介導(dǎo)周圍的CAFs產(chǎn)生氧化應(yīng)激,激活后者的HIF-1α途徑和核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear factor κB, NF-κB)途徑,通過溶酶體自噬作用使得Cav-1下調(diào).使用小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)干擾Cav-1的表達(dá)發(fā)現(xiàn)Cav-1的急性下調(diào)導(dǎo)致CAFs中的線粒體損傷和線粒體自噬作用增強(qiáng),結(jié)果是CAFs糖酵解增加,產(chǎn)生乳酸鹽增加,從而支持癌細(xì)胞的無限生長.Martinez-Outschoorn將癌細(xì)胞和CAFs共培養(yǎng)后,發(fā)現(xiàn)兩者的過氧化物還原酶-1(peroxiredoxin-1)的活性均增加,這可能是兩者在氧化應(yīng)激環(huán)境下的自身保護(hù)機(jī)制之一.然而活性氧(reactive oxygen species, ROS)的明顯增多使得CAFs中DNA雙鏈損傷(免疫組化表現(xiàn)為γ-H2AX染色強(qiáng)陽性),但在CAFs中并未表現(xiàn)出明顯的凋亡跡象.因此推測兩者除了peroxiredoxin-1外,還有其他的抗凋亡的機(jī)制.此外有研究[33]顯示通過激活癌細(xì)胞中的HIF-1α途徑,也可以增強(qiáng)癌細(xì)胞的自噬作用,使癌細(xì)胞的生長受到明顯抑制.

4 CAFs代謝方式轉(zhuǎn)變與肺癌演進(jìn)的關(guān)系

CAFs代謝方式的改變在腫瘤細(xì)胞的生長、移動、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮十分重要的作用.肺癌細(xì)胞產(chǎn)生的氧化應(yīng)激通過上述途徑造成周圍的CAFs發(fā)生自噬和線粒體自噬(autophagy/mitophagy)[9].CAFs的自噬產(chǎn)生了氨基酸、脂肪酸核苷酸等產(chǎn)物,這些產(chǎn)物均可以提供給周圍的癌細(xì)胞使用.其次,由CAFs的線粒體自噬后的糖酵解反應(yīng)所產(chǎn)生的大量乳酸源源不斷地輸送給癌細(xì)胞,相較于使用葡萄糖,肺癌細(xì)胞直接利用呼吸鏈中的半成品--乳酸進(jìn)行TCA從而更快捷地獲取養(yǎng)料和能量[34,35].乳酸還能刺激癌細(xì)胞中的線粒體活性,使之?dāng)?shù)量增加、誘導(dǎo)產(chǎn)生氧化應(yīng)激的能力增強(qiáng),CAFs接受氧化應(yīng)激后又重復(fù)自噬,由此產(chǎn)生惡性循環(huán)[36].CAFs代謝方式的改變除了為癌細(xì)胞的生長提供能量直接促進(jìn)癌細(xì)胞生長外,還能抑制癌細(xì)胞的凋亡.CAFs能通過促進(jìn)周圍癌細(xì)胞中p53介導(dǎo)的糖酵解和凋亡控制因子(Tp53-induced glycolysis and apoptosis regulator,TIGAR)高表達(dá),而使癌細(xì)胞免除自身受到氧化應(yīng)激損傷,同時也使其逃脫凋亡[37,38].CAFs還介導(dǎo)癌細(xì)胞中的基因不穩(wěn)定性,通過"bystander"效應(yīng)增加癌細(xì)胞的攻擊性[7].肺癌中以糖酵解為代謝方式的CAFs產(chǎn)生的乳酸和羥丁酸具有直接刺激癌細(xì)胞移動的能力,Bonuccelli等[39]的實驗證明乳酸和羥丁酸能使癌細(xì)胞的移動速度增加2倍.

CAFs中Cav-1的下調(diào)導(dǎo)致肺癌基質(zhì)的重塑,加之乳酸的堆積使得肺癌基質(zhì)呈現(xiàn)弱酸性,在介導(dǎo)周圍正常細(xì)胞凋亡的同時也使得基質(zhì)水解,以有利于肺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[40].CAFs代謝改變相關(guān)的HIF-1α、NF-κB信號能促使尿激酶型纖溶酶原激活物(urokinase-type plasminogen activator, uPA)與相應(yīng)受體結(jié)合,導(dǎo)致纖溶酶原激活為纖溶酶,繼而激活基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP),后者降解胞外基質(zhì)蛋白,易化癌細(xì)胞的遷移[41].研究[42]也顯示了MMPs高表達(dá)與肺癌預(yù)后呈負(fù)相關(guān).NF-κB是一個多效的信號通路,其在炎癥中也發(fā)揮關(guān)鍵的作用.NF-κB能使得腫瘤微環(huán)境維持在慢性炎癥狀態(tài),而微環(huán)境中的慢性炎癥狀態(tài)是促使癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移的另一重要原因[14,19].

5 CAFs代謝方式的轉(zhuǎn)變與肺癌治療和預(yù)后的關(guān)系

過去認(rèn)為肺癌細(xì)胞的生長伴隨著癌中血管的發(fā)生.然而抑制血管生成的化療藥物僅短期內(nèi)有效且很容易引起肺癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移,CAFs的自噬現(xiàn)象則能夠解釋該現(xiàn)象[43].其原因:一是癌細(xì)胞的能量來源于CAFs而不依賴新生血管;其次,血管內(nèi)皮生長因子抑制劑由于抑制了腫瘤新生血管的生成,加重了腫瘤微環(huán)境的低氧狀態(tài)[44],更進(jìn)一步刺激CAFs的氧化應(yīng)激和糖酵解,從而產(chǎn)生更多的乳酸鹽,促進(jìn)癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移.

癌細(xì)胞"馴化"的CAFs中產(chǎn)生的一系列反應(yīng)最終造成癌細(xì)胞和周圍基質(zhì)中的能量不平衡--"燃料"通過CAFs被源源不斷地輸送給癌細(xì)胞,基質(zhì)的分解代謝成為癌細(xì)胞合成代謝的基石.上述過程中,腫瘤微環(huán)境中的"自噬"起到了十分重要的作用.如果將這種"自噬"放大至整個人體,則表現(xiàn)為癌相關(guān)的惡病質(zhì)[32,45].癌組織通過增強(qiáng)機(jī)體的分解代謝進(jìn)而為自己的生長和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移供能.肺癌患者晚期表現(xiàn)出的嚴(yán)重惡病質(zhì)原因正基于此.因此,CAFs代謝方式改變造成的癌細(xì)胞擴(kuò)散和惡病質(zhì)給肺癌患者以雙重致命打擊.在肺癌預(yù)后的研究方面,發(fā)現(xiàn)CAFs的Cav-1下調(diào)預(yù)示著癌細(xì)胞的侵潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,與肺癌患者的預(yù)后成負(fù)相關(guān)[46].

6 問題與展望

CAFs代謝方式改變的始動因素是氧化應(yīng)激的產(chǎn)生和線粒體自噬.在實驗研究過程中如果加入自噬抑制劑氯喹或者抗氧化劑,均可以使得CAFs中的Cav-1的表達(dá)升高,受損的線粒體功能恢復(fù),CAFs的惡性表型被逆轉(zhuǎn)[11].另外,抗氧化劑對癌細(xì)胞的抑制作用也為腫瘤的藥物治療提供了新的策略.

目前關(guān)于CAFs代謝方式機(jī)制的研究主要集中于Cav-1通路,所用的模型也更多限于乳腺癌,針對肺癌的研究相對較少.現(xiàn)有文獻(xiàn)的爭議包括:①CAFs的特殊代謝方式是否涉及到遺傳學(xué)的改變;②腫瘤微環(huán)境中的慢性炎癥可能參與了CAFs惡性表型的傳播,在炎癥中是否也有相應(yīng)的細(xì)胞代謝方式的改變;③人類的良性腫瘤相較于惡性腫瘤具有生長局限,無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的特點,良性腫瘤中成纖維細(xì)胞是否仍維持正常細(xì)胞的代謝方式?④CAFs糖酵解所需的大量葡萄糖通過何種方式進(jìn)入癌組織內(nèi)從而被CAFs利用,是否也不依賴于腫瘤微血管.上述的問題有待于未來更多的研究來解答.