高紅林 劉鑒峰 宋娜玲

隨著城市環(huán)境及人們生活規(guī)律的改變,我國肺癌發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì).肺癌因其惡性程度高,療效差,不易早期診斷等被認(rèn)為是所有癌癥中的頭號(hào)殺手,它可分為小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)兩大類,其中后者大約占85%[1].大部分的肺癌患者不易早期發(fā)現(xiàn),在晚期確診時(shí)常規(guī)的化療效果不明顯,化療藥物的毒副作用及患者產(chǎn)生耐藥性往往是肺癌治療失敗的主要原因.近些年興起小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)的靶向遞送可以提高腫瘤對(duì)藥物的敏感性降低耐藥作用,增強(qiáng)治療效果,某些siRNA單獨(dú)投放便可抑制腫瘤的生長及遷移[2].靶向肽因其具有與腫瘤表面受體特異性結(jié)合的功能,若將靶向肽siRNA聯(lián)合應(yīng)用,將明顯提高siRNA治療效果,這也成為越來越多研究者關(guān)注的熱點(diǎn)[3].本文重點(diǎn)總結(jié)了靶向肽在遞送siRNA進(jìn)行肺癌治療研究中的應(yīng)用.

1 siRNA及靶向肽概述

1.1 siRNA siRNA是含有5個(gè)-21個(gè)核苷酸的小RNA分子,在RNA干涉(RNA interfering, RNAi)中起中心作用,對(duì)特定mRNA進(jìn)行降解.RNAi的原理是利用具有同源性的雙鏈RNA誘導(dǎo)序列特異的目標(biāo)基因的沉默,迅速阻斷基因活性.根據(jù)RNAi原理,利用短的雙鏈RNA沉默與其同源的特異基因,這種基因沉默的方法已成為抗癌治療的新趨勢(shì).這些短的雙鏈RNA有幾種類型,包括siRNA、microRNA(miRNA)、小的非編碼RNA(tiny non-coding RNA, tncRNA)和短發(fā)卡RNA(short hairpin RNA, shRNA),其中siRNA運(yùn)用最為廣泛.利用siRNA基因沉默進(jìn)行抗癌治療的研究在近些年興起,例如Yang[4]運(yùn)用陽離子脂質(zhì)體來遞送血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)siRNA以達(dá)到抗腦膠質(zhì)瘤的效果,Bagheri[5]通過siRNA介導(dǎo)的DNA斷裂因子45(DNA fragmentation factor 45, DFF45)沉默來增強(qiáng)阿霉素抗乳腺癌細(xì)胞的效果,Pietschke[6]研究表明siRNA可以作為治療前列腺癌的有效方法,Shi[7]利用siRNA沉默人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase, hTERT)在體內(nèi)外均抑制宮頸癌細(xì)胞的生長和遷移.類似的siRNA研究還有很多,其限制性在于缺乏有效的遞送載體將核酸投遞給腫瘤細(xì)胞[8],鑒于這一點(diǎn),越來越多的遞送載體被發(fā)現(xiàn)和研究,其中靶向肽因其良好的靶向作用逐漸被廣泛研究.

1.2 靶向肽 靶向肽(target peptide)是特異性結(jié)合腫瘤表面標(biāo)志物的一類小分子多肽,包含的氨基酸數(shù)量一般少于50個(gè)[9].1985年,Smith[10]第一次將外源基因插入絲狀噬菌體f1的基因III,使目的基因編碼的多肽以融合蛋白的形式展示在噬菌體表面,從而創(chuàng)建了噬菌體展示技術(shù),自此開啟了靶向肽研究的新篇章.獲取靶向肽的方式有多種,可以改進(jìn)已知多肽,構(gòu)建多肽受體的分子結(jié)構(gòu),或者搜索結(jié)合肽文庫,結(jié)合肽文庫包括噬菌體展示文庫、細(xì)菌展示文庫、一珠一化(one-bead one-compound, OBOC)和定位掃描合成肽庫(Positional Scanning-Synthetic Peptide Combinatorial Libraries, PSSPCLs)[3].靶向肽有很多優(yōu)點(diǎn),它在納摩爾濃度就可顯露對(duì)靶標(biāo)的高特異性,并且本身低毒,對(duì)腫瘤周邊的正常組織無明顯損害作用,在非靶點(diǎn)位置能快速被清除,同時(shí)它容易合成并優(yōu)化以更好結(jié)合靶標(biāo),也可以調(diào)整結(jié)構(gòu)增加對(duì)蛋白酶降解的穩(wěn)定性、延長在血液循環(huán)中的半衰期和增強(qiáng)毛細(xì)血管通透性[9].目前靶向肽已廣泛運(yùn)用于腫瘤影像和治療的研究中,本文著重關(guān)注其在遞送siRNA抗肺癌的研究.

2 靶向肽在遞送siRNA進(jìn)行肺癌治療研究中的應(yīng)用

肺癌的發(fā)生及發(fā)展需要經(jīng)歷一系列復(fù)雜的過程,多信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制參與其中,有些多肽可以抑制某些蛋白過基因表達(dá)來阻斷某一信號(hào)通路而發(fā)揮抑癌作用,這類多肽同時(shí)可以作為靶向肽在遞送siRNA過程中發(fā)揮靶向作用.此外,肺癌細(xì)胞表面存在許多類細(xì)胞表面分子,可以作為多肽的靶點(diǎn),一些多肽利用這些靶點(diǎn)發(fā)揮靶向作用.有些多肽自身即可作為遞送siRNA的載體并發(fā)揮靶向作用.本文從靶向肽發(fā)揮靶向作用及其作為載體在遞送siRNA兩方面來綜述siRNA遞送治療肺癌的新進(jìn)展.

2.1 靶向肽作為靶向劑遞送siRNA

2.1.1 靶向肽拮抗劑G 拮抗劑G(antagonist G)是神經(jīng)遞質(zhì)P物質(zhì)6-11序列的六肽類似物,通過人工合成,其序列是RWFWLM,其中W均為D-構(gòu)型,功能是阻斷神經(jīng)肽生長因子.SCLC是轉(zhuǎn)移性神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤,受自分泌和旁分泌的調(diào)節(jié),拮抗劑G可以阻斷神經(jīng)肽生長因子結(jié)合到腫瘤細(xì)胞受體上而發(fā)揮抑癌作用,研究[11]表明它通過生成過氧化物誘導(dǎo)SCLC的凋亡.此多肽曾與包裹阿霉素的脂質(zhì)體融合實(shí)現(xiàn)阿霉素對(duì)SCLC的靶向抑制作用[12].Santos等[8]設(shè)計(jì)脂質(zhì)體包裹siRNA后再與拮抗劑G共價(jià)結(jié)合形成穩(wěn)定的顆粒,輸送到SCLC中發(fā)揮作用,這個(gè)系統(tǒng)可以作為日后輸送siRNA治療SCLC的參考.

2.1.2 靶向肽Disruptin 表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)發(fā)生突變是肺癌發(fā)生的一種方式,抑制其表達(dá)及活化可以達(dá)到抑制肺癌生長發(fā)展的效果.EGFR通過配體誘導(dǎo)形成二聚體而活化,激活下游信號(hào)傳導(dǎo)途徑.Ahsan等[13]新合成一種稱作Disruptin的19個(gè)氨基酸多肽,結(jié)構(gòu)中包含EGFR的SVDNPHVC部分,可以阻斷熱休克蛋白90結(jié)合EGFR,并且抑制EGFR二聚化從而引起其降解,這一多肽引起EGFR突變陽性的腫瘤細(xì)胞如UMSCC1和肺癌NCI-H1975細(xì)胞表面EGFR降解,因此癌細(xì)胞生長受到抑制.

2.1.3 cRGD 整合素過表達(dá)在許多癌癥如肺癌細(xì)胞表面,可以作為研究的靶點(diǎn).cRGD(cycle Arg-Gly-Asp)是從噬菌體展示庫篩選得到可特異性結(jié)合整合素的靶向肽,cRGD在遞送siRNA至肺癌細(xì)胞過程中發(fā)揮靶向作用那個(gè)在許多研究中體現(xiàn).在Khatri等[14]的實(shí)驗(yàn)中,siRNA可滲透通過脂質(zhì)體雙分子層,與脂質(zhì)體內(nèi)部的鈣磷酸鹽絡(luò)合在一起,包裹siRNA的脂質(zhì)體再與cRGD結(jié)合以獲得對(duì)A549肺癌細(xì)胞的靶向性.研究結(jié)果發(fā)現(xiàn) ,連接cRGD的siRNA脂質(zhì)體的A549細(xì)胞活力明顯比單純siRNA脂質(zhì)體高,且細(xì)胞熒光強(qiáng)度高,表明肺癌細(xì)胞對(duì)具有靶向肽的siRNA吸收多.

如果遞送的siRNA針對(duì)腫瘤生長及遷移的功能基因mRNA,其發(fā)揮的抑癌作用也會(huì)更大.Khatri[15]設(shè)計(jì)的siRNA納米結(jié)構(gòu)和cRGD接合物應(yīng)用于NSCLC治療中能夠明顯提高肺癌對(duì)吉他西濱鹽酸鹽的敏感性.該siRNA作用核糖核苷酸還原酶亞單位1(ribonucleotide reductase M1, RRM1)mRNA,RRM1基因編碼RRM1的調(diào)節(jié)亞基,該酶是生物體內(nèi)唯一催化4種核糖核苷酸還原生成相應(yīng)的脫氧核糖核苷酸的酶,對(duì)細(xì)胞的增殖和分化起著調(diào)控作用.cRGD靶向NSCLC細(xì)胞表面的ανβ3整合素,RRM1 siRNA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)抑制RRM1的表達(dá),肺癌細(xì)胞的生長活力降低,對(duì)吉西他濱鹽酸鹽的半數(shù)抑制濃度(50%inhibitory concentraton, IC50)值明顯降低,表明siRNA增強(qiáng)肺癌細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性.

2.1.4 YSA EphA2是一個(gè)跨膜酪氨酸激酶受體,屬于酪氨酸激酶受體(recetptor tyrosine kinases, RTKs)超家族成員之一,研究[16]發(fā)現(xiàn)其在肺癌細(xì)胞表面高表達(dá).Ishikawa等[17]運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)有良好病癥的患者病理I期NSCLC表面高表達(dá)EphA2.12氨基酸多肽(YSAYPDSVPMMS or YSA)通過噬菌體展示技術(shù)獲得,靶向腫瘤細(xì)胞表面EphA2受體[18].Dickerson等[19]將包裹針對(duì)EGFR基因的siRNA的納米顆粒通過N,N-雙丙烯酰胺與YSA連在一起制成結(jié)合物,然后將結(jié)合物分別添加到EphA2陰性的Hey和EphA2陽性的SK-OV-3細(xì)胞中,其中YSA介導(dǎo)EGFR siRNA內(nèi)吞進(jìn)肺癌細(xì)胞.免疫印跡法確認(rèn)兩者EGFR量的變化,其后給予多西他賽,比較腫瘤對(duì)藥物的敏感性.研究表明,經(jīng)過siRNA的靶向遞送,與Hey相比,Eph2陽性的SK-OV-3細(xì)胞EGFR表達(dá)明顯降低,且癌細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性明顯增強(qiáng),正常組織損傷較小.

2.2 靶向肽自身作為載體遞送siRNA 脂質(zhì)體和納米顆粒等作為siRNA的遞送載體在抗癌研究中廣泛應(yīng)用,但是材料的生物相容性是基礎(chǔ)研究走上臨床必須要考慮的因素,不斷有研究者發(fā)現(xiàn)了生物相容性好的新的多肽載體,不僅可以發(fā)揮其靶向性,還可以自身作為載體遞送siRNA,使得siRNA在腫瘤靶點(diǎn)聚集,增強(qiáng)抗癌效果.細(xì)胞穿膜肽(cell-penetrating peptides, CPPs)作為一類新型的遞送藥物分子和siRNA等的載體,目前已有很多中CPP被設(shè)計(jì)出并應(yīng)用于研究中.

2.2.1 C6 Jafari等[20]介紹了一種18聚體的兩親氨基酸配對(duì)肽C6作為siRNA的遞送載體,研究表明與脂質(zhì)體2000相比,C6具有低毒性和細(xì)胞內(nèi)吸收siRNA的高效性.C6是人工設(shè)計(jì)合成的CPP,帶正電,通過與腫瘤細(xì)胞膜負(fù)電部分結(jié)合而透過細(xì)胞膜.C6M1是對(duì)C6的優(yōu)化,其溶解度、二級(jí)結(jié)構(gòu)和細(xì)胞內(nèi)吸收等特性均有明顯改善,使之成為更好遞送siRNA的載體[21].在Jafari[22]實(shí)驗(yàn)中,C6M1與siRNA在一定比例下形成穩(wěn)定的復(fù)合物,表現(xiàn)出對(duì)血清RNase的穩(wěn)定性,相比于裸RNA,該復(fù)合物在腫瘤細(xì)胞內(nèi)siRNA的吸收也明顯增加.

2.2.2 hCT分支衍生物 Hoyer[23]設(shè)計(jì)合成了截短型人降鈣素(human calcitonin, hCT)的分支衍生物,將其與siRNA非共價(jià)結(jié)合形成穩(wěn)定復(fù)合物,該siRNA靶向人神經(jīng)肽Y1受體(human NPY Y1 receptor, NPY1R),其中NPY1R是G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors,GPCR)家族成員之一.研究過程中這個(gè)多肽不僅可以作為siRNA的載體,也可以與NPY1R特異性結(jié)合,使siRNA靶向腫瘤位點(diǎn),發(fā)揮更強(qiáng)的沉默作用,實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明,相對(duì)于對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組NPY1R mRNA降低兩倍多.

2.2.3 TAT-A1 TAT是第一個(gè)發(fā)現(xiàn)的穿膜肽,通過噬菌體展示技術(shù)獲得,被廣泛研究和應(yīng)用在核酸遞送研究中.TAT-A1是中國農(nóng)業(yè)大學(xué)Fang[24]新設(shè)計(jì)出的具有腫瘤靶向且可以遞送siRNA的CPP,其中A1是特異性結(jié)合血管內(nèi)皮生長因子受體1(vascular endothelial growth factor receptor-1, VEGFR1)的六肽, VEGFR1過表達(dá)在腫瘤如肺癌細(xì)胞表面,研究結(jié)果顯示,VEGFR1過表達(dá)的腫瘤細(xì)胞內(nèi),TAT-A1復(fù)合物siRNA的細(xì)胞吸收和腫瘤位點(diǎn)聚集能力均優(yōu)于TAT,因此可以作為siRNA治療肺癌的一種方法.

2.2.4 PR39 抗菌肽(antimicrobial peptides, AMPs)是一種小分子多肽,有些對(duì)腫瘤有抑制作用.PR39豬抗菌肽從細(xì)菌展示庫中獲得,作為一種穿膜肽,可以通過結(jié)合腫瘤細(xì)胞的負(fù)電部分而透過細(xì)胞膜.Tian等[25]將PR39作為針對(duì)STAT3的siRNA的載體遞送siRNA,相對(duì)于裸siRNA,此系統(tǒng)能明顯抑制乳腺癌細(xì)胞的侵入和遷移,其中PR39與siRNA的比例為90:1時(shí)STAT基因沉默效果最大.在Kim等[26]的研究中,能特異性結(jié)合STAT3的多肽APT可以通過阻斷STAT信號(hào)通路而抑制肺癌細(xì)胞生長及遷移,其中APT由噬菌體展示技術(shù)獲得,因此抗菌肽PR39遞送STAT3 siRNA的設(shè)計(jì)未來可以有效應(yīng)用于肺癌治療研究.

3 結(jié)語

利用siRNA沉默目的基因的方式治療肺癌是近年來研究的熱點(diǎn),siRNA自身可以發(fā)揮明顯的抑癌作用,也可以增加肺癌對(duì)抗癌藥物的敏感性,減少耐藥發(fā)生,但因其在體內(nèi)極不穩(wěn)定,缺乏有效地遞送系統(tǒng)和靶向性,單純siRNA治療的效率通常不高.靶向肽在遞送siRNA的應(yīng)用中可以顯著增加siRNA在腫瘤靶點(diǎn)的集聚能力,使其更好地發(fā)揮其作用,盡管靶向肽應(yīng)用于肺癌治療研究具有廣闊的應(yīng)用前景,但目前尚存在許多問題待解決,包括如何獲得肺癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移相關(guān)靶基因的siRNA;如何篩選出肺癌細(xì)胞特異性更好的靶向肽以及如何提高靶向效率;siRNA如何包裹在載體中,在血液循環(huán)過程中保持穩(wěn)定,而進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后可以迅速釋放;如何選擇合適的載體使其在體內(nèi)不易被排出且對(duì)正常組織無損害等.為解決這些問題,我們應(yīng)該深入研究肺癌發(fā)生及發(fā)展的相關(guān)機(jī)制,篩選并設(shè)計(jì)出肺癌特異性高和容易實(shí)施的多肽,尋找安全無毒且易操作的載體,更好地實(shí)現(xiàn)與siRNA和靶向肽結(jié)合,最終使肺癌患者能夠受益.