曹亞輝， 王 璇， 朱利平

中樞神經(jīng)系統(tǒng)隱球菌感染發(fā)病的分子機(jī)制

曹亞輝， 王 璇， 朱利平

隱球菌； 中樞神經(jīng)系統(tǒng)； 分子機(jī)制； 血-腦脊液屏障

中樞神經(jīng)系統(tǒng)隱球菌感染在中樞神經(jīng)系統(tǒng)真菌感染中最為常見，且病死率長(zhǎng)期以來居高不下，目前其發(fā)病機(jī)制尚不十分明確。因隱球菌主要通過血運(yùn)播散，透過血-腦脊液屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，因此如何透過血-腦脊液屏障是其致病機(jī)制的研究熱點(diǎn)。血-腦脊液屏障是介于血液和腦組織之間緊密連接的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，由腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、周細(xì)胞共同組成。這種特殊結(jié)構(gòu)允許疏水性物質(zhì)，如O2、激素、CO2等擴(kuò)散至腦內(nèi)，卻限制微生物及大分子物質(zhì)通過，以此來調(diào)節(jié)血源性物質(zhì)的通透性，維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)微環(huán)境的穩(wěn)定。近年來隨著對(duì)隱球菌透過血-腦脊液屏障機(jī)制研究的不斷深入，已初步闡明其跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制、“特洛伊木馬”機(jī)制及細(xì)胞旁擴(kuò)散轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制?，F(xiàn)就其跨越血-腦脊液屏障的分子機(jī)制作一綜述。

一、跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制

目前，對(duì)隱球菌跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的研究最為深入，體外血-腦脊液屏障模型及活體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均表明，隱球菌可通過對(duì)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附、融合，進(jìn)而穿越微血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。這一過程首先涉及隱球菌對(duì)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附。研究人員通過透射電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)，當(dāng)隱球菌和腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞在37℃恒溫孵育時(shí)，隱球菌首先黏附于微血管內(nèi)皮細(xì)胞表面，隨后進(jìn)入內(nèi)皮細(xì)胞，誘導(dǎo)其細(xì)胞骨架重組，形成微絨毛突起，該過程在隱球菌與之接觸1 h內(nèi)即可完成。隨后，隱球菌寄生在腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，一旦宿主細(xì)胞骨架重組完成，隱球菌便從內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)側(cè)表面逸出，該過程只引起輕微的細(xì)胞損傷而不會(huì)破壞其完整性［1］。另有學(xué)者應(yīng)用活體實(shí)時(shí)成像技術(shù)動(dòng)態(tài)觀察隱球菌跨越腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的全過程。他們首先對(duì)大鼠微血管系統(tǒng)注射熒光染料，使之呈現(xiàn)紅色標(biāo)記；隱球菌予以綠色熒光素標(biāo)記，并將標(biāo)記的隱球菌從尾靜脈接種于大鼠，6 h后可以看到隱球菌逐漸黏附于腦微血管管壁，進(jìn)而與之融合，并緩慢穿越血管內(nèi)皮系統(tǒng)，透過血-腦脊液屏障［2］。這一實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了該跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的存在。同時(shí)，研究人員在探討人免疫缺陷病毒（HIV）對(duì)隱球菌導(dǎo)致人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞改變的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)HIVgp41胞外域能明顯增強(qiáng)隱球菌所致人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞骨架蛋白（包括肌動(dòng)蛋白和細(xì)絲蛋白）的改變，使得這兩種蛋白的絲狀排列扭曲，紋理稀疏，且通透性增強(qiáng)，可使隱球菌與腦組織的結(jié)合力增強(qiáng)2．5倍［3］。這些均證實(shí)了隱球菌以改變腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞骨架的方式透過血-腦脊液屏障。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)隱球菌黏附、融合人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞，需要通過腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞表面表達(dá)的CD44受體介導(dǎo)［4］。有學(xué)者通過CD44基因敲除小鼠感染隱球菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)野生型小鼠（CD44+／+）在感染后38 d內(nèi)全部死亡，而CD44基因敲除小鼠感染后在觀察時(shí)間內(nèi)仍然存活。提示CD44受體參與隱球菌與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附作用。另有研究發(fā)現(xiàn)隱球菌可產(chǎn)生透明質(zhì)酸（HA），HA為CD44的配體，可與CD44特異性結(jié)合，并誘導(dǎo)其下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，引起細(xì)胞骨架重組，該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)主要由蛋白激酶A-α（PKA-α）介導(dǎo)，脂筏內(nèi)吞通道也參與其中［5］。應(yīng)用CD44抗體阻斷這一信號(hào)通路時(shí)，隱球菌的黏附能力和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的菌體載量會(huì)明顯下降，進(jìn)一步驗(yàn)證了CD44介導(dǎo)的跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)作用。近年也有研究顯示隱球菌除產(chǎn)生HA加強(qiáng)與宿主細(xì)胞的黏附外，還可以產(chǎn)生磷脂酶B1，與內(nèi)皮細(xì)胞的脂類介質(zhì)相互作用，從而使GDP-Rac1活化為GTPRac1，繼而與轉(zhuǎn)錄因子3（STAT3）通路相聯(lián)系，誘導(dǎo)細(xì)胞溶解及骨架重組，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)隱球菌的內(nèi)吞作用［6］。該黏附、融合過程還涉及到S100A10蛋白［7］，S100A10蛋白主要表達(dá)于動(dòng)物的肺、腎臟及血管內(nèi)皮細(xì)胞，依賴胞膜表面的離子通道（如鈣離子通道）和蛋白受體參與細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)交換。有研究人員在抑制S100A10蛋白的表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，微血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度明顯下降，細(xì)胞對(duì)隱球菌的內(nèi)吞作用降低，從而減少內(nèi)皮細(xì)胞與隱球菌的融合與內(nèi)吞；而當(dāng)隱球菌與正常內(nèi)皮細(xì)胞接觸及融合時(shí)，通過光譜技術(shù)可以觀察到S100A10蛋白明顯上調(diào)，成為跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的又一佐證。

除此之外，研究表明人腦內(nèi)富含的肌醇不僅參與神經(jīng)應(yīng)答和反饋，也可參與跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。一方面肌醇通過直接增加HA的產(chǎn)生，來增強(qiáng)隱球菌對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的黏附性；另一方面，其可通過劑量依賴的形式促進(jìn)隱球菌跨膜過程，即隱球菌依賴肌醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白獲取肌醇作為碳源，為自身生長(zhǎng)提供物質(zhì)條件。有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)突變菌株缺少Itr1a和Itr3c這2種主要的肌醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因時(shí)，隱球菌透過血-腦脊液屏障的效率降低70%［8］。而近期一項(xiàng)體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)莢膜本身形成的特定形態(tài)，也會(huì)增加隱球菌與宿主內(nèi)皮細(xì)胞的黏附力，從而在跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制方面起到一定的作用［9］。新型隱球菌可以衍生出直徑為100～200 nm的微囊泡（Cryptococcusneoformans-derived microvesicles，Cn MVs），這些Cn MVs可以誘導(dǎo)人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞表面脂筏成分的重新分配，促進(jìn)細(xì)胞與細(xì)胞間的融合。另外用14-3-3-GFP（綠色熒光蛋白融合劑）標(biāo)記Cn MVs，可以發(fā)現(xiàn)Cn MVs分布在新型隱球菌誘導(dǎo)的囊性病變的中心區(qū)域及周圍，并且腦實(shí)質(zhì)及腦脊液中的綠色熒光越高，小鼠腦內(nèi)的真菌載量越高，提示隱球菌衍生的微囊泡可以促進(jìn)隱球菌跨越血-腦脊液屏障并在感染的損傷部位積聚。

二、“特洛伊木馬”機(jī)制

隱球菌被吞噬細(xì)胞（如巨噬細(xì)胞或單核細(xì)胞）吞噬后可啟動(dòng)多種機(jī)制使其長(zhǎng)期在吞噬細(xì)胞中存活，并以此為載體或保護(hù)壁壘穿越血-腦脊液屏障造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染，該機(jī)制又被稱為“特洛伊木馬”機(jī)制。該機(jī)制在一些體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中得到了支持。有研究人員將隱球菌與骨源性單核細(xì)胞（BMDM）共孵化，然后注入大鼠尾靜脈，并測(cè)其感染后腦組織中的菌體載量，結(jié)果表明隱球菌在大鼠腦組織中的菌落數(shù)（CFU）是未與BMDM共孵化對(duì)照組的4倍；與此同時(shí)，當(dāng)注射氯膦酸鹽使單核吞噬細(xì)胞耗竭后，隱球菌腦膜炎的嚴(yán)重程度有所降低，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的真菌載量降低近40%［10］，這提示單核巨噬細(xì)胞在隱球菌播散和入侵中樞神經(jīng)系統(tǒng)過程中起著一個(gè)載體作用。另有研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)小鼠感染隱球菌后，肺吞噬細(xì)胞內(nèi)隱球菌的數(shù)量在8 h可出現(xiàn)高峰，但7 d后胞內(nèi)的隱球菌數(shù)量反而較胞外增多，中樞神經(jīng)系統(tǒng)菌量增加更為突出［11］，同樣也為“特洛伊木馬”機(jī)制提供了依據(jù)。

隱球菌要想通過“特洛伊木馬”機(jī)制進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，首要條件是躲避吞噬細(xì)胞的殺傷作用并在細(xì)胞內(nèi)存活繁殖。而通常巨噬細(xì)胞對(duì)外來病原微生物的殺傷作用依靠胞內(nèi)的活性氧和活性氮來完成［12］；當(dāng)機(jī)體缺乏脂多糖（LPS）和γ干擾素（IFN-γ）時(shí)，巨噬細(xì)胞停留在活化前狀態(tài)，在吞噬隱球菌后并不發(fā)揮殺傷作用，而是作為“培養(yǎng)基”促使隱球菌在其內(nèi)部復(fù)制增殖，以此逃避宿主細(xì)胞的免疫攻擊。有研究人員對(duì)隱球菌腦膜炎患者的血漿／腦脊液樣本進(jìn)行鑒定和實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，含有抗GM-CSF抗體的血漿能抑制GM-CSF誘導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄因子5（STAT5）的磷酸化，并阻止外周血單個(gè)核細(xì)胞產(chǎn)生巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1，較免疫功能正常的隱球菌腦膜炎患者產(chǎn)生炎性因子減少，巨噬細(xì)胞吞噬隱球菌后不易被清除，從而更易進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)［13］，為巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的感染機(jī)制提供了間接依據(jù)。隱球菌逃避巨噬細(xì)胞的殺傷力主要表現(xiàn)在多方面：首先，隱球菌與巨噬細(xì)胞接觸后可通過一系列未明確的酶類代謝使NO解毒，阻止巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO；有研究發(fā)現(xiàn)，隱球菌蛋白激酶同源區(qū)基因PK H2-02在實(shí)驗(yàn)中能更好地保持病原體胞壁的穩(wěn)定性，也更容易耐受活性氧和活性氮的殺傷作用［14］；其次，隱球菌野生株B3501在被巨噬細(xì)胞吞噬后，其隱球菌酚氧化酶結(jié)構(gòu)基因CNLAC1、莢膜相關(guān)基因CAP60及NMT等主要毒性因子的基因表達(dá)明顯下降，降低宿主免疫識(shí)別作用；再者，隱球菌在胞內(nèi)可加強(qiáng)莢膜的表達(dá)，積累葡萄糖醛酸木糖甘露聚糖，分泌多種蛋白參與細(xì)胞壁或莢膜多糖骨架，這些成分可以通過經(jīng)典的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)途徑向菌體外釋放膜性囊泡，這些囊泡可以被內(nèi)化，激活巨噬細(xì)胞，提高促炎因子和NO的表達(dá)，以這種膜性囊泡的抗毒性機(jī)制為誘餌，使菌體遠(yuǎn)離功能性吞噬細(xì)胞［15］。另外，與脂質(zhì)代謝有關(guān)的漆酶和磷脂酶1也有助于新型隱球菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活，宿主細(xì)胞膜磷脂經(jīng)磷脂酶B水解產(chǎn)生花生四烯酸，然后被釋放到隱球菌的脂質(zhì)池中，漆酶則將花生四烯酸生物合成為前列腺素E2，后者可激活巨噬細(xì)胞上的前列腺素類EP2受體，下調(diào)巨噬細(xì)胞的殺菌功能，促進(jìn)隱球菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活。在機(jī)體免疫力弱化時(shí)，隱球菌可以透過吞噬體膜，即肌動(dòng)蛋白在吞噬體周圍特異性短暫聚合以穩(wěn)定吞噬體使其與質(zhì)膜融合，通過肌動(dòng)蛋白閃爍方式將新型隱球菌外排出巨噬細(xì)胞，或單純依靠大量繁殖機(jī)械性破壞巨噬細(xì)胞結(jié)構(gòu)而逃逸，入侵其他未活化巨噬細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，如此循環(huán)往復(fù)，造成菌體的大量增殖，提高入侵部位的菌體載量。此種作用可在Th1細(xì)胞因子的作用下加強(qiáng)，但是在細(xì)胞因子Th2的作用下，巨噬細(xì)胞的抗隱球菌功能會(huì)受到抑制，減少病原的外排率，這種機(jī)制使有可能被細(xì)胞殺傷的隱球菌逃逸到鄰近的未感染的非殺傷細(xì)胞中，并長(zhǎng)期留存下來，等待適宜機(jī)會(huì)離開細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，從潛伏期進(jìn)入活動(dòng)期［16］。

盡管有多個(gè)實(shí)驗(yàn)支持“特洛伊木馬”機(jī)制在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染中的重要作用，但有研究人員認(rèn)為該機(jī)制或許并不是病原體跨越血-腦脊液屏障的主要機(jī)制。他們?cè)陔[球菌菌落中篩選出2種存在巨噬細(xì)胞黏附缺陷的菌株，分別為菌株12F1和菌株3C9，因?yàn)樵摲N缺陷菌株不能有效地與巨噬細(xì)胞黏附，從而不容易被血流中的巨噬細(xì)胞所攝取，因此依靠宿主細(xì)胞進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的可能性較小。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與正常菌株相比，這2種缺陷菌株的被吞噬作用存在明顯的差異，但進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的能力并未受到影響，仍可有效地跨越血-腦脊液屏障。故研究者認(rèn)為“特洛伊木馬”機(jī)制在該實(shí)驗(yàn)中可能并不是跨越血-腦脊液屏障的主要機(jī)制，然而他們并沒有排除“特洛伊木馬”機(jī)制在其他情況下存在的可能性，如酵母細(xì)胞從明確的肺部感染引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)的侵襲時(shí)有可能該機(jī)制為其感染途徑之一［8］。

三、細(xì)胞旁擴(kuò)散轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制

除以上2種機(jī)制外，研究者發(fā)現(xiàn)隱球菌還可通過腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接跨越血-腦脊液屏障引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染，該過程可作為獨(dú)立的病原入侵途徑，也可以成為跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)的旁路發(fā)揮作用。在尿素酶促進(jìn)隱球菌血運(yùn)播散的研究中發(fā)現(xiàn)該機(jī)制［17］，研究人員分別用標(biāo)準(zhǔn)新型隱球菌菌株H99、尿素酶缺失菌株（ure1）及尿素酶修復(fù)菌株（ure1+ure1-1）靜脈接種小鼠建立感染模型，隨后發(fā)現(xiàn)尿素酶缺失菌株感染的小鼠死亡率明顯下降，且該組小鼠死亡時(shí)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的隱球菌載量顯著低于標(biāo)準(zhǔn)菌株感染的小鼠，隨后的組織學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，H99感染小鼠后，隱球菌通過血運(yùn)播散至中樞神經(jīng)系統(tǒng)，除黏附、跨越腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞外，還可造成內(nèi)皮細(xì)胞間隙結(jié)構(gòu)的破壞，形成間隙水腫；而ure1感染的小鼠因尿素酶缺失，分解內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接的作用大大減弱，故使得一部分菌體滯留在內(nèi)皮細(xì)胞間隙，降低了感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)的毒力；而尿素酶修復(fù)菌株的感染作用則與標(biāo)準(zhǔn)菌株無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這一發(fā)現(xiàn)提示了細(xì)胞旁轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制存在的可能性。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，隱球菌透過血-腦脊液屏障時(shí)，可與基底膜層粘連蛋白受體識(shí)別并結(jié)合，從而破壞層粘連蛋白的組分，而該蛋白作為基底膜的主要結(jié)構(gòu)對(duì)基底膜的組裝起關(guān)鍵作用，故該蛋白的破壞會(huì)引起連鎖反應(yīng)導(dǎo)致神經(jīng)纖維網(wǎng)水腫，削弱內(nèi)皮細(xì)胞間的牽拉作用，改變內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接，促進(jìn)隱球菌通過緊密連接入侵中樞神經(jīng)系統(tǒng)［18］。近年一項(xiàng)研究顯示，將隱球菌與小鼠血漿共孵化后，血漿中富含的纖維蛋白溶酶原可結(jié)合并覆蓋在菌體表面，通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活化成纖維蛋白溶解酶，二者作用于體外微血管內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)，可分解內(nèi)皮細(xì)胞間的連接蛋白（包括糖性蛋白及蛋白多糖），使內(nèi)皮細(xì)胞間隙疏松，從而增加隱球菌旁路途徑入侵，增強(qiáng)其對(duì)血-腦脊液屏障的侵襲性［19］。

另外，研究人員應(yīng)用甲基苯丙胺（一種具有成癮作用的中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮劑）人為破壞微血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接，然后向小鼠靜脈注射隱球菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)感染后小鼠平均存活期為3 d，而對(duì)照組為7 d，兩者差異存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步病理及免疫組化分析發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組小鼠除大腦損傷的區(qū)域及中樞神經(jīng)系統(tǒng)隱球菌載量均有明顯增加外，微血管內(nèi)皮細(xì)胞間閉合蛋白的表達(dá)明顯減少，其緊密連接結(jié)構(gòu)也遭到嚴(yán)重破壞［20］，再次證實(shí)細(xì)胞旁擴(kuò)散轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的存在。另有報(bào)道隱球菌通過增強(qiáng)尿酶的活性，可以直接影響腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接的完整性，從而增加中樞神經(jīng)系統(tǒng)的隱球菌載量［21］，成為支持該機(jī)制的又一依據(jù)。

綜上所述，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)隱球菌感染的發(fā)病過程中，跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制為其最主要途徑，通過對(duì)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附、融合，以及改變內(nèi)皮細(xì)胞骨架，從而透過血-腦脊液屏障?！疤芈逡聊抉R”機(jī)制和細(xì)胞旁擴(kuò)散轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制是其旁路途徑，增強(qiáng)隱球菌透過血-腦脊液屏障的侵襲力。

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Molecular mechanisms of central nervous system cryptococcosis

CAO Yahui，WANG Xuan，ZHU Liping． （Department of Infectious Diseases，Huashan Hospital，F(xiàn)udan University，Shanghai200040，China）

R519．4

A

1009-7708（2014）04-0357-04

2013-09-03

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃資助（2013CB531600）。

復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院感染科，上海 200040。

曹亞輝（1988—），女，在讀碩士研究生，主要從事感染性疾病的臨床與基礎(chǔ)研究。

朱利平，E-mail：zhulp＠fudan．edu．cn。