李培 康曉征 陳克能

肺癌為臨床常見惡性腫瘤，2014年肺癌約占所有惡性腫瘤死亡率的1/4，約占所有新發(fā)腫瘤的14%[1]，其中非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）約80%[2]。目前臨床對NSCLC廣泛采納以解剖為基礎(chǔ)的TNM（tumor-node-metastasis）分期及組織病理學(xué)作為治療及預(yù)后判斷的標(biāo)準(zhǔn)，但近年來出現(xiàn)許多指導(dǎo)NSCLC治療策略的新觀念，典型例子是表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）突變與EGFR-酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine-kinase inhibitor, TKI）治療，ALK基因重排與克唑替尼治療的故事等。此外生物標(biāo)志物對肺癌的經(jīng)典治療——化療療效的預(yù)測研究也不斷被報道，如目前認(rèn)為核苷酸切除修復(fù)交叉互補組（excision repair cross-complementing 1, ERCC1）、核苷酸還原酶M1（ribonucleotide reductase subunit 1, RRM1）、胸苷酸合成酶（thymidylate synthase, TS）表達水平與NSCLC治療與預(yù)后密切相關(guān)，其中ERCC1與肺癌鉑類治療耐藥及預(yù)后相關(guān)，RRM1與吉西他濱治療耐藥及預(yù)后相關(guān)，TS與培美曲塞耐藥及預(yù)后相關(guān)。2009年美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（National Comprehensive Cancer Network, NCCN）推薦ERCC1和RRM1蛋白表達與EGFR基因突變一起，作為評估肺癌化療后預(yù)后與預(yù)測治療的標(biāo)記物。本文就ERCC1、RRM1及TS在NSCLC中的意義尤其是生存意義做一簡要綜述。

1 ERCC1

1.1 概況 ERCC1是體內(nèi)重要的 DNA修復(fù)酶的編碼基因，其編碼的蛋白是核酸切除修復(fù)途徑（nucleotide excision repair, NER）的限速酶，而NER是DNA切除修復(fù)的主要途徑[3]，ERCC1基因位于染色體19q13.2-q13.3，基因全長15 kb，含10個外顯子，編碼297個氨基酸的蛋白，與著色性干皮病基因F（xeroderma pigmentosum pomp lementary group F, XPF）形成異二聚體ERCC1-XPF，在DNA單鏈?zhǔn)軗p處的5’端進行識別和剪切而發(fā)揮功能[4]，因此，ERCC1在腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后中發(fā)揮著巨大的效用。臨床常用免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry, IHC）或?qū)崟r定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）檢測ERCC1表達，IHC較qRT-PCR使用率高，一方面由于IHC方法簡易、性價比高；另一方面IHC更能直接顯示腫瘤細胞中ERCC1蛋白表達的百分?jǐn)?shù)和強度，而qRT-PCR僅顯示腫瘤及周邊非腫瘤組織混合表達的整體情況。IHC檢測ERCC1表達的蛋白的水平，qRT-PCR檢測mRNA水平。IHC檢測ERCC1蛋白陽性者鏡下顯示細胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒。

1.2 ERCC1作用機制 ERCC1是NER的限速酶，負責(zé)對DNA的損傷進行識別和剪切，避免復(fù)制錯誤。而NER是DNA切除修復(fù)的主要途徑[3]，修復(fù)機制是通過切除吸煙、大氣污染、電離輻射等理化因素損傷的DNA，而形成的DNA加合物，以互補鏈為模板復(fù)制并修復(fù)損傷DNA來維護基因組的完整。因此，ERCC1通過控制NER而最終控制DNA的復(fù)制。

1.3 ERCC1對NSCLC預(yù)后及療效的預(yù)測

1.3.1 ERCC1在含鉑方案中的作用 近年來研究[5]報道ERCC1的表達與肺癌預(yù)后及鉑類化療耐藥有關(guān)。鉑類作為NSCLC聯(lián)合化療應(yīng)用最廣泛的藥物，以鉑類藥物為基礎(chǔ)的雙藥聯(lián)合方案目前仍然是NSCLC尤其是晚期NSCLC的一線化療方案，但晚期NSCLC有效率僅為30%-40%，中位生存期8個月-12個月[6]。順鉑引起的損傷主要由細胞內(nèi)NER進行切除修復(fù)[7]，其作用機制是ERCC1與腫瘤細胞的DNA進行交聯(lián)致DNA的損傷及斷裂，從而抑制腫瘤細胞的不斷增殖。

1.3.2 ERCC1在可手術(shù)切除的NSCLC治療與預(yù)后 Simon等[8]對51例可手術(shù)切除的NSCLC術(shù)后組織中ERCC1 mRNA水平采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription-PCR,RT-PCR）檢測，發(fā)現(xiàn)ERCC1表達水平與患者預(yù)后呈正相關(guān)，即高表達組的中位生存期明顯優(yōu)于低表達組，中位生存期分別為94.6個月與34.5個月（P=0.01）。為明確ERCC1能否預(yù)測鉑類聯(lián)合方案在NSCLC術(shù)后輔助化療的療效，Olaussen等[9]采用IHC方法檢測國際肺癌臨床試驗（International Adjuvant Lung Trial, IALT）入組的761例NSCLC患者手術(shù)切除腫瘤組織中的ERCC1的表達情況。發(fā)現(xiàn)ERCC1陰性NSCLC患者能從鉑類聯(lián)合輔助化療中受益（HR=0.65; 95%CI: 0.50-0.86; P=0.002），而ERCC1陽性卻不能獲益（HR=1.14; 95%CI: 0.84-1.55; P=0.4）。對于單純手術(shù)的患者，ERCC1陰性患者的預(yù)后差。

1.3.3 ERCC1在晚期NSCLC治療與預(yù)后 Lord等[10]通過RTPCR技術(shù)回顧性分析了56例晚期（IIIb期/IV期）NSCLC患者ERCC1 mRNA的表達與化療療效（吉西他濱聯(lián)合順鉑）關(guān)系，表明ERCC1的表達程度與化療療效明顯相關(guān)，晚期NSCLC腫瘤中的ERCC1 mRNA低表達組中位生存期優(yōu)于高表達組，分別為61.6周 vs 20.4周（P=0.009）。Cobo等[11]根據(jù)ERCC1 mRNA表達水平進行了一項選擇性應(yīng)用鉑類藥物的多中心、隨機III期對照試驗，共入組444例的IV期NSCLC患者，該研究顯示依據(jù)ERCC1 mRNA表達水平，對鉑類進行選擇性用藥組優(yōu)于非選擇含鉑雙藥聯(lián)合方案的傳統(tǒng)治療模式，客觀緩解率分別為59.7%與39.3%（P=0.02）。高志強、韓寶惠等[12]為驗證ERCC1表達水平與鉑類藥物治療和預(yù)后關(guān)系，入組222例晚期（IIIb期/IV期）NSCLC患者。采用IHC方法檢測ERCC1蛋白在肺癌組織的表達。按2:1的比例隨機分為個體化治療組（n=147）及標(biāo)準(zhǔn)治療組（n=75）。標(biāo)準(zhǔn)治療組采用含鉑化療方案。個體化治療組中ERCC1蛋白高表達的患者采用不含鉑類藥物的化療方案，ERCC1蛋白低表達的患者采用含鉑化療方案。結(jié)果顯示個體化治療組的中位生存期優(yōu)于對照組（13.3個月 vs 10.2個月，P=0.041）。

2 RRM1

2.1 RRM1概況 RRM1基因通過編碼合成核糖核苷酸還原酶的亞基M1[13]。其編碼的蛋白RRM1是DNA合成通路中的限速酶，在DNA合成中起到限速、調(diào)節(jié)作用，RRM1基因位于染色體11p15.5，包含19個外顯子，編碼792氨基酸蛋白質(zhì)[14]。臨床工作中常用IHC和qRT-PCR檢測RRM1，蛋白表達水平的檢測常用IHC技術(shù)，IHC檢測RRM1蛋白陽性染色定位于細胞質(zhì)，鏡下顯示為胞質(zhì)中出現(xiàn)的大小不一的棕黃色染色顆粒。近期研究[15]顯示，使用精確定量分析（accurate quantitative analysis, AQUA）檢測RRM1蛋白評分方法明顯優(yōu)于IHC的H-評分，因此，AQUA檢測RRM1蛋白的方法在未來將可能會廣泛地取代IHC和qRTPCR方法。

2.2 RRM1作用機制 RRM1是核苷酸結(jié)合位點之一，它與RRM2共同構(gòu)成核糖核苷酸還原酶（ribonucleotide reductase, RR），RR是DNA合成的限速酶，該酶作用是使二磷酸核苷酸（ribonucleoside diphosphates, rNDP）轉(zhuǎn)化為二磷酸脫氧核苷酸（deoxyribonucleoside diphosphates,dNDP），dNDP是DNA合成和修復(fù)必需原料的前體，因此，RRM1通過控制DNA的合成從而控制細胞的增殖。

2.3 RRM1預(yù)后及療效預(yù)測

2.3.1 RRM1在含吉西他濱化療方案中的運用 吉西他濱是嘧啶類抗代謝藥物，吉西他濱進入細胞內(nèi)后經(jīng)過核苷激酶的作用轉(zhuǎn)化成具有活性的二磷酸核苷（5-diphosphate,dFdCDP）及三磷酸核苷（5-triphosphate, dFdCTP），通過抑制DNA合成而發(fā)揮細胞毒作用[16]，首先，dFdCDP抑制RR的活性，使合成DNA必需的三磷酸脫氧核苷產(chǎn)生減少，尤其使dCTP（deoxycytidine 5-triphosphate）產(chǎn)生減少，dCTP是DNA合成的原料，使DNA合成減少。其次，dFdCTP與dCTP競爭摻入至DNA鏈中，DNA聚合酶不能去除摻入的吉西他濱及修復(fù)延長的DNA鏈，從而引起DNA鏈斷裂最終導(dǎo)致細胞凋亡。

2.3.2 RRM1在可手術(shù)切除的NSCLC治療與預(yù)后 Bepler等[17]應(yīng)用qRT-PCR方法對77例早期NSCLC術(shù)后標(biāo)本中RRM1表達情況進行了前瞻性研究，結(jié)果提示RRM1是決定預(yù)后的獨立危險因素，顯示在多變量分析中，RRM1獨立于腫瘤的分期、一般狀況、體重丟失等，可作為手術(shù)切除的NSCLC術(shù)后獨立的預(yù)后因子（HR=0.452, 95%CI:0.203-1.006），其高表達組較低表達組擁有更長的生存，更低的復(fù)發(fā)率。Zheng等[5]報道187例未接受任何輔助化療患者，通過根治性切除腫瘤標(biāo)本進行RRM1蛋白水平的預(yù)后價值研究，顯示RRM1蛋白高表達組總生存時間優(yōu)于RRM1蛋白低表達組（120個月 vs 60.2個月；P=0.02）。

2.3.3 RRM1在晚期NSCLC治療與預(yù)后 晚期NSCLC患者中，RRM1的預(yù)后價值，主要通過以吉西他濱為基礎(chǔ)聯(lián)合鉑類治療方案來進行研究[18]，Rosell等[19]通過一組吉西他濱聯(lián)合順鉑治療的患者的RRM1 mRNA水平對預(yù)后生存的潛在預(yù)測價值分析，顯示RRM1 mRNA低表達水平組中位生存期明顯優(yōu)于RRM1 mRNA高表達組（13.7個月 vs 3.6個月，P=0.009）。Lee等[20]通過IHC檢測40例采用吉西他濱治療的晚期NSCLC患者的RRM1蛋白表達水平，顯示RRMl陽性患者在生存期（5.1個月 vs 12.9個月，P=0.022）和疾病控制率（23% vs 56%, P=0.053）方面均較RRM1陰性差。Rosell和Lee的研究中，均顯示晚期的NSCLC中RRM1表達與疾病的預(yù)后呈負相關(guān)。

3 TS

3.1 TS概況 TS是一種葉酸依賴性酶，由兩個相同的亞基構(gòu)成，是DNA合成的關(guān)鍵酶，也是培美曲塞、5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil, 5-FU）為基礎(chǔ)化療的靶向酶[21]。TS是培美曲塞等葉酸抑制劑的的重要作用靶點，其基因定位于人18號染色體短臂18p11.32，長約16×103bp[22]。臨床中常用IHC和qRT-PCR兩種方法檢測TS，qRT-PCR檢測TS敏感性高，但需要足量的新鮮腫瘤組織標(biāo)本，且檢測費用昂貴。IHC檢測TS更常用，因為方法相對簡單，此外，既往研究中的IHC采用H-評分法可以得到一致的結(jié)果，IHC檢測TS表達陽性的腫瘤細胞的細胞質(zhì)被染成棕褐色。

3.2 TS作用機制 TS是體內(nèi)調(diào)節(jié)四種核苷酸數(shù)量平衡的關(guān)鍵酶，TS通過甲基化脫氧尿嘧啶核苷酸（deoxyuridine monophosphate, dUMP）形成脫氧胸嘧啶核苷酸（deoxythymidine monophosphate, dTMP），dTMP進一步在細胞內(nèi)代謝為三磷酸胸嘧啶，三磷酸胸嘧啶為DNA合成和修復(fù)的基本原料，因此，TS是dTMP從頭合成的限速酶，在DNA合成與修復(fù)、細胞增殖與分化中起非常重要的作用[23]。并且TS是葉酸代謝關(guān)鍵酶，葉酸是核苷酸和DNA合成及甲基化的重要前體物質(zhì)。低葉酸水平是引起DNA鏈斷裂，導(dǎo)致遺傳物質(zhì)不穩(wěn)定和癌癥風(fēng)險增加的關(guān)鍵決定因素[24]。

3.3 TS預(yù)后及療效預(yù)測

3.3.1 TS在含培美曲塞化療方案中的作用 NCCN指南已將培美曲塞（pemetrexed）推薦為晚期NSCLC中腺癌的標(biāo)準(zhǔn)治療方案之一。TS參與DNA復(fù)制和修復(fù)，是主要的葉酸依賴酶，培美曲塞作為TS的新一代的多靶點抗葉酸制劑，它在體內(nèi)產(chǎn)生的多聚谷胺酸代謝物來抑制包括TS、二氫葉酸還原酶（dihydrofolate reductase）和甘氨酰胺核苷甲酰轉(zhuǎn)移酶（glycinamide ribonucleotide formyltransferase），而被抑制的這幾種酶是參與嘌呤和嘧啶合成的關(guān)鍵酶[25]。根據(jù)Liu等[26]納入8項研究的薈萃分析顯示TS低表達的患者可從培美曲塞化療中明顯獲益（PFS: HR=0.63, 95%CI: 0.52-0.76; OS: HR=0.74, 95%CI:0.63-0.88），TS表達水平的增加可能是培美曲塞耐藥原因。

3.3.2 TS與組織學(xué)的關(guān)系及預(yù)后 Nakagawa等[27]通過IHC測定109例I期根治性手術(shù)切除NSCLC腫瘤組織中TS活性，研究其與腫瘤增殖程度的關(guān)系，結(jié)果顯示腫瘤組織中TS高表達組腫瘤增殖率明顯高于TS低表達組，分別為48.2%和34.4%。提示腫瘤組織TS水平越高，癌細胞的增殖活性越高（P=0.020）。郭惠琴等[28]通過IHC檢測111例NSCLC患者的腫瘤標(biāo)本TS表達情況，表明鱗癌患者的腫瘤組織中TS表達水平較其他組織學(xué)類型高（P=0.031）。既往III期臨床試驗[29]證實，培美曲塞治療肺腺癌的療效好于肺鱗癌。TS在鱗癌患者的腫瘤組織中表達水平較其他組織學(xué)類型高。Ceppi等[30]在56例NSCLC標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)TS mRNA水平明顯高于腺癌（2.17 vs 1.16, P＜0.000,1）。Peterson等[31]對培美曲賽和多西他賽二線治療NSCLC頭對頭的III期隨機研究進行的回顧性分析發(fā)現(xiàn)，在對鱗癌的患者中多西他賽療效好于培美曲賽；在對非鱗癌的患者，培美曲賽療效好于多西他賽。同樣的Sun等[32]通過IHC檢測使用培美曲塞為基礎(chǔ)的化療方案的285例非鱗癌的NSCLC的TS蛋白，在多變量分析中，以培美曲塞為基礎(chǔ)的化療TS陰性組對比陽性組有更長的無進展生存期（HR=0.7, 95%CI:0.51-0.97）。

4 小結(jié)

綜上所述，ERCC1、RRM1及TS均是保證DNA不斷復(fù)制的關(guān)鍵酶，雖然目前的研究顯示的數(shù)據(jù)表明生物標(biāo)記物表達水平不同，將直接影響到相關(guān)藥物的療效，根據(jù)基因表達的效果而選擇對應(yīng)的藥物，從而達到更佳的治療目的，但是，大多數(shù)均為回顧性的研究，少數(shù)為前瞻性研究。就目前的研究結(jié)果并不能作為臨床常規(guī)診療的標(biāo)準(zhǔn)，因此大家更廣泛的接受以病理類型、臨床分期決定患者的治療方案?；熡质荖SCLC的主要治療方式之一，特別是晚期NSCLC患者，不同的個體對化療的敏感性存在較大差異，這種差異使得醫(yī)生在面對不同的患者而選擇不同的方法，個體化的治療越來越凸顯，因此，針對分子標(biāo)志物表達的不同及耐藥的關(guān)系而選擇個體化治療，從而避免過度治療或治療不夠，將仍然是NSCLC研究的重要內(nèi)容之一。