李海濤，周華軍，田書梅，張曉磷，趙云云

（1.三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 宜昌市中心人民醫(yī)院 放射科，湖北 宜昌443002；2.三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 宜昌市中心人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖北宜昌443002；3.三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院宜昌市中心人民醫(yī)院手術(shù)室，湖北宜昌443002）

基于鏈接校正技術(shù)檢測細(xì)胞膜穿透肽介導(dǎo)的寡核苷酸入胞的研究進展

李海濤1，周華軍2Δ，田書梅3，張曉磷1，趙云云1

（1.三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 宜昌市中心人民醫(yī)院 放射科，湖北 宜昌443002；2.三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 宜昌市中心人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖北宜昌443002；3.三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院宜昌市中心人民醫(yī)院手術(shù)室，湖北宜昌443002）

寡核苷酸（oligonucleotides，ONs）是一類大小不超過20個堿基的短鏈核苷酸，它已用于家族遺傳病及癌癥的治療，顯示出巨大的應(yīng)用前景。但寡核苷酸入胞效率低下，嚴(yán)重影響其治療效果，成為其臨床使用的最大障礙。細(xì)胞膜穿透肽（cell-penetrating peptides，CPPs）是一種能夠以既不影響生物活性分子的活性也不會損傷細(xì)胞的方式攜帶貨物入胞的運載工具，是非常理想的ONs運載工具。但CPPs的入胞能力參差不齊，需要具體考量選擇何種CPPs作為ONs的載體。目前已有各種定性、定量評估CPPs細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)能力的策略，其中最經(jīng)典的評價手段是熒光分析法。但鑒于其容易出現(xiàn)假陽性結(jié)果的現(xiàn)實情況，特別推薦將其與鏈接校正ONs相結(jié)合進行應(yīng)用，以更準(zhǔn)確的分析CPPs-ONs入胞情況。

細(xì)胞膜穿透肽；寡核苷酸；CRE系統(tǒng)；鏈接校正

寡核苷酸（oligonucleotides，ONs）是一類包括DNA或RNA在內(nèi)的大小不超過20個堿基的短鏈核苷酸，它能高效地與其互補對鏈接，常被用作探針確定DNA或RNA的結(jié)構(gòu)，并被廣泛地應(yīng)用于基因芯片、熒光原位雜交等過程中。目前，ONs已用于治療家族遺傳疾?。?-2］及癌癥［3-4］。如Zhou L等［5］研究證實，地中海貧血兒父母的β-球蛋白前體mRNA內(nèi)含子2（intron 2）的654、705、745位點往往會出現(xiàn)剪切突變。因而，可利用RNase H的惰性反義寡核苷酸（RNase H-inactive anti-oligonucleotides）來糾正此類異常剪接位點，保證β-球蛋白的正常表達(dá)，達(dá)到干預(yù)家族遺傳病的目的。Krajewska等［6］研究發(fā)現(xiàn)，Bcl-x基因在5’端有2個剪切位點，可編碼抑制細(xì)胞凋亡的Bcl-x長鏈（Bcl-xL）和促進細(xì)胞凋亡的Bcl-x短鏈（Bcl-xS）2種功能相悖的蛋白。雖然Bcl-xL與Bcl-xS都是維持細(xì)胞正常功能的必需蛋白，但Bcl-xL往往又在多種癌癥細(xì)胞中過表達(dá)。因而可通過阻礙編碼Bcl-xL的剪切位點，提高Bcl-xL向Bcl-xS的轉(zhuǎn)變率，增強細(xì)胞凋亡信號，促進腫瘤細(xì)胞的死亡。雖然已經(jīng)看到ONs具有巨大的應(yīng)用前景，但其低下的入胞效率嚴(yán)重影響治療效果，是ONs臨床使用的最大障礙。

細(xì)胞膜穿透肽（cell-penetrating peptides，CPPs）是一類具有細(xì)胞膜穿透能力的富含陽離子的小分子多肽，它能攜帶多種生物活性物質(zhì)入胞，包括蛋白質(zhì)、核酸、納米顆粒等，既不影響貨物分子的生物活性也不會損傷細(xì)胞，是一種理想的遞送ONs入胞的生物運載工具。但CPPs種類繁多，入胞能力參差不齊，需要對不同CPPs攜帶ONs入胞效力、對ONs活性的影響等方面進行具體考查以達(dá)到優(yōu)選的目的。迄今為止，多種成熟的評估技術(shù)已見報道，其中最經(jīng)典的評價策略是熒光分析法：首先用熒光素標(biāo)記多肽分子，然后通過不同的技術(shù)手段對CPPs攜帶貨物穿膜的效率進行檢測，包括熒光顯微鏡觀察（fluorescence microscope observation），高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC），熒光激活細(xì)胞分選術(shù)（fluorescence activated cell sorting，F(xiàn)ACS）及熒光光譜測定法（spectrofluorometry）等。需要特別注意的是，熒光分析法可能會導(dǎo)致假陽性結(jié)果，如Richard等［7］研究發(fā)現(xiàn)，熒光可來自于結(jié)合在細(xì)胞膜上或被滯留在胞內(nèi)小囊泡中的CPPs；El-Andaloussi等［8］使用低濃度熒光標(biāo)記的CPPs攜帶ONs進行細(xì)胞定位時發(fā)現(xiàn)，盡管實驗結(jié)果顯示的是未入胞或入胞不明確，但仍能檢測到ONs的胞內(nèi)生物活性。

綜上可知，目前基于熒光素標(biāo)記CPPs的檢測技術(shù)雖然能提供關(guān)于CPPs-ONs細(xì)胞定位的相關(guān)信息，但在實驗操作中出現(xiàn)的問題卻嚴(yán)重影響了實際應(yīng)用，包括：①不同的熒光基團可影響不同CPPs的細(xì)胞內(nèi)分布［9］；②熒光基團會影響細(xì)胞對CPPs-ONs的攝取［10］；③熒光基團可能對CPPs具有一定的毒性［10］；④可能出現(xiàn)假陽性結(jié)果［11］等。因此，利用ONs可誘導(dǎo)活細(xì)胞底物轉(zhuǎn)化并出現(xiàn)可檢測的生物效應(yīng)這一檢測技術(shù)，可有效的彌補熒光標(biāo)記法檢測CPPs-ONs細(xì)胞定位實驗時容易出現(xiàn)假陽性結(jié)果的缺陷，常用的手段包括環(huán)化重組蛋白酶（cyclization recombinant enzyme，CRE）系統(tǒng)［12］及鏈接校正法（Kole's splice correction assay）［13］，其中后者還可配合化學(xué)試劑對CPPs-ONs復(fù)合物的內(nèi)攝途徑進行研究，是一種更具優(yōu)勢的檢測手段。本文主要就基于鏈接校正法對細(xì)胞膜穿透肽介導(dǎo)的寡核苷酸入胞的檢測手段進行綜述。

1 CRE系統(tǒng)

基于CRE系統(tǒng)的檢測技術(shù)是一種比較理想的用于判斷CPPs攜帶貨物能力的研究手段。這是一種國內(nèi)外廣泛應(yīng)用的位點特異性重組系統(tǒng)，主要包括2個部分：2個loxP（locus of crossing（x）over P1）位點及識別loxP位點的Cre重組酶，因此CRE系統(tǒng)又可被稱為Cre-loxP系統(tǒng)。Cre酶是一種不需要輔助因子便能特異性的催化2個loxP位點之間的DNA發(fā)生重組的拓?fù)洚悩?gòu)酶。CPPs-Cre重組蛋白被轉(zhuǎn)導(dǎo)到包含loxP-STOP-loxP的細(xì)胞中，Cre酶特異性識別2個loxP位點并切除STOP片段從而影響下游基因的表達(dá)，因其特異性高、毒性低，具有顯著的應(yīng)用優(yōu)勢。如Wadia等［12］運用CRE系統(tǒng)成功的檢測了經(jīng)典細(xì)胞膜穿透肽TAT運送增強型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）進入小鼠T細(xì)胞的情況。Cre-loxP系統(tǒng)雖然特異性非常強，但它首先需要構(gòu)建原核質(zhì)粒表達(dá)純化Cre-CPPs融合蛋白，相當(dāng)費時費力且很難取得足夠量的蛋白，使其無法成為篩選新CPPs的“一線”方法。此外，Cre重組酶分子量很大，會影響CPPs本身的性狀。

2 鏈接校正法

早在1998年，Kole等［13］就成功建立了利用鏈接校正寡核苷酸（splice correction oligonucleotides，SCOs）來評估生物載體遞送貨物入胞效力的方法，該策略被稱為鏈接校正技術(shù)。由于鏈接校正發(fā)生在細(xì)胞核內(nèi)，是一種細(xì)胞內(nèi)檢測技術(shù)，這種分析手段可給出CPPs-ONs復(fù)合體在胞內(nèi)的分布情況及其是否發(fā)生內(nèi)囊泡逃逸等相關(guān)信息，是一種優(yōu)于熒光分析技術(shù)的檢測手段［14］。如Shiraishi等［15］在CPP上引入一個類脂結(jié)構(gòu)域（lipid domain）后得到了新的CPP-CatLip，這種CPP可高效地從內(nèi)囊泡中逃逸出來，顯著提高攜帶的反義PNA的生物活性。此外，對CPPs而言，ONs因為大小適宜，既不會妨礙CPPs的細(xì)胞膜穿膜效力也不會影響其自身特性，是非常理想的貨物模型，因而可用于檢測CPPs攜帶ONs的入胞效力。其原理是CPPs攜帶鏈接校正ONs進入HeLa pLuc 705細(xì)胞系，互補性結(jié)合異常剪接位點，因鏈接校正ONs含有異常剪接位點的熒光素酶基因（luciferse gene），剪接完成就會產(chǎn)生功能性熒光素酶，通過檢測其表達(dá)量來評估CPPs遞送ONs入胞的能力［13］。

2.1 利用鏈接校正法評估CPPs攜帶ONs入胞效力 多個研究小組實驗表明，鏈接矯正法是一種非常可靠的檢測技術(shù)，可通過對比不同的CPPs攜帶鏈接校正ONs入胞后熒光素酶報告基因的表達(dá)量，來評估CPPs作為生物載體的潛力［16-17］。如Lehto等［18］研究發(fā)現(xiàn)，硬脂酰（stearyl）改造的細(xì)胞膜穿透肽（RxR）（4）［stearyl-（RxR）（4）］攜帶質(zhì)粒入胞的能力是未改造的（RxR）（4）的10倍，且毒性更低；stearyl-（RxR）（4）可高效攜帶2′-O-甲基（2′-O-methyl，2′-OMe）RNA入胞進行鏈接校正，而stearyl-Arg 9卻不能；此外，雖然（RxR）（4）-PMO同stearyl-（RxR）（4）一樣，可引導(dǎo)鏈接校正ONs入胞，但在相同效率下，其濃度是stearyl-（RxR）（4）的10倍。Saleh等［19］研究發(fā)現(xiàn)，可利用鏈接校正法比較（R-Ahx-R）4-肽核酸（peptide nucleic acid，PNA）復(fù)合物的線性形式與非線性形式的入胞能力，結(jié)果顯示線性（RAhx-R）4-PNA顯示出更高的入胞效力。Arukuusk等［20］設(shè)計出了新型CPPs，即硬脂酰改造的TP10類似物（stearylated TP10 analogs）NickFects，其可高效攜帶鏈接校正ONs進入懸浮細(xì)胞，甚至在極難轉(zhuǎn)染的原代細(xì)胞中發(fā)揮鏈接校正作用，其轉(zhuǎn)染效率不僅顯著高于LipofectamineTM2000且完全沒有細(xì)胞毒性。Du等［21］研究證實，富含精氨酸的CPP-（RXRRBR）（2）XB可遞送反義嗎啉代環(huán)寡核苷酸（antisense morpholino oligonucleotides，AMOs）入胞，高效校正毛細(xì)血管擴張突變（ataxia-telangiectasia mutated，ATM）基因。Ezzat等［22］證實，新型CPP-PepFect14（PF14）能高效遞送鏈接校正ONs進入杜氏肌肉萎縮癥（Duchenne'smuscular dystrophy，DMD）小鼠肌小管發(fā)揮相應(yīng)生理功能。此外，若通過熒光標(biāo)記ONs，不僅能測量熒光素酶活性，還能同時定量測定細(xì)胞裂解液中熒光強度，從而對CPPs-ONs的入胞情況進行更全面的評估［23］。如Rytk?nen等［24］利用介孔硅（mesoporou silicon，PSi）與CPP連接形成的納米載體遞送鏈接校正ONs入胞，共聚焦顯微鏡及熒光素酶報告基因顯示，其可在5 min內(nèi)將攜帶的ONs 100%遞送入細(xì)胞內(nèi)，且不會影響其生物活性。

2.2 利用鏈接校正法評估CPPs攜帶ONs入胞機制 大量研究表明，各種內(nèi)吞作用抑制劑能選擇性地阻斷特定的內(nèi)吞途徑，因此可用來評估CPPs的入胞機制［23-25］。迄今為止，CPPs的入胞途徑可能包括：①網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用（clathrinmediated endocytosis，CME）［26］；②脂筏／小窩介導(dǎo)的內(nèi)吞作用（lipid raft／caveolae-mediated endocytosis）［27］；③巨胞飲（macropinocytosis）［12］；④它們的組合攝取方式［28］。造成這種差異性的原因可能是不同CPPs的入胞機制不同，此外，CPPs攜帶的貨物的不同及抑制劑處理濃度的差異可能對結(jié)果也有一定的影響。

可選取經(jīng)典的內(nèi)吞作用抑制劑來特異性鑒定這3種不同的入胞途徑［25］：①使用渥曼青霉素（wortmannin）來同時抑制網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑和巨胞飲；②利用細(xì)胞松弛素（cytochalasin D）抑制巨胞飲；③利用氯丙嗪（chlorpromazine）抑制網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用［7］；④氯喹（chloroquine）能夠延緩溶酶體途徑中內(nèi)涵體的形成，并且有利于CPPs-ONs從潛在的內(nèi)含體中逃逸［29］，因此氯喹可評估內(nèi)含體途徑。此外，為了鑒定細(xì)胞外結(jié)構(gòu)對CPPs攝取機制的影響，應(yīng)當(dāng)使用肝素酶III（heparinase III），或?qū)⒓?xì)胞培養(yǎng)在過量的肝素中來裂解胞外蛋白聚糖，或選用硫酸乙酰肝素（heparan sulfate）缺陷型細(xì)胞株。需要注意的是，這些內(nèi)吞作用抑制劑很少能產(chǎn)生100%的抑制作用或?qū)е翪PPs-ONs徹底從內(nèi)涵體釋放，這可能是幾種途徑共同參與CPPs-ONs入胞的結(jié)果。Hassane等［30］研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞膜穿透肽PF6攜帶鏈接校正ONs入胞的途徑是網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用。Saleh等［19］研究發(fā)現(xiàn)，（R-Ahx-R）4-PNA復(fù)合物的線性形式與非線性形式都是能量依賴的入胞方式，主要是網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，偶可見小窩介導(dǎo)的內(nèi)吞作用。

3 結(jié)語

迄今為止，ONs不僅被廣泛應(yīng)用于基因芯片、熒光原位雜交等過程中，還被用于家族遺傳疾病及癌癥的臨床治療中。雖然ONs擁有巨大應(yīng)用前景，但其入胞效率的低下嚴(yán)重影響其治療效果，成為其臨床推廣使用的最大障礙。CPPs是一種理想的攜帶ONs入胞的運載工具，但CPPs的入胞能力參差不齊，需要具體考量選擇何種CPP作為ONs的生物載體?；阪溄有Ｕ▽?xì)胞膜穿透肽介導(dǎo)的寡核苷酸入胞進行檢測，不僅可彌補經(jīng)典熒光分析技術(shù)的缺陷，還可對CPPs-ONs復(fù)合物的內(nèi)攝途徑進行考察，是一種更具優(yōu)勢的檢測技術(shù)。但需要注意的是，由于鏈接校正技術(shù)需要特殊的細(xì)胞系HeLa pLuc 705，且該檢測依賴于熒光素酶底物的發(fā)光，不是十分經(jīng)濟。未來應(yīng)當(dāng)致力于進一步對此技術(shù)進行改良，為臨床的推廣應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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（編校：吳茜）

Characterization of cellular internalization pathways for cell-penetrating peptides-mediated oligonucleotide delivery based on splice correction assay

LIHai-tao1，ZHOU Hua-jun2Δ，TIAN Shu-mei3，ZHANG Xiao-lin1，ZHAO Yun-yun1

（1.Department of Radiology，The First Clinical Medical College of China Three Gorges University，Yichang Central People's Hospital，Yichang 443002，China；2.Department of Neurology，The First Clinical Medical College of China Three Gorges University，Yichang Central People's Hospital，Yichang 443002，China；3.Operation Room，The First Clinical Medical College of China Three Gorges University，Yichang Central People's Hospital，Yichang 443002，China）

Oligonucleotides（ONs）are a class of short-chain nucleotides with the size of no more than 20，it has been used to treat hereditary diseases and cancerwhich shows a great prospect considering.The inefficient transduction of oligonucleotides seriously affects its therapeutic effect，which becomes the biggest obstacle to its clinicaluse.Cell-penetrating peptides（CPPs）are capable to carry biologicalmolecules into cellswithoutaffecting its biological activity and damaging the cellmembranes，which makes it the ideal carrier of ONs.Since their transmembrane abilities are uneven，which one should be chose to use need consideration.A large number of experiments can be used to detect the penetrating abilities of CPPs into the cells，and fluorescence analysis is themost classic one.Considering ithas the possibility of causing false positive results，it should be combined with splice corrected ONs to auurately analyze the condition of CPPs-ONs into the cell.

cell-penetrating peptides；oligonucleotides；splice correction assay；CRE system

Q241

A

1005－1678（2014）08－0185－04

國家自然科學(xué)基金（81202625）；宜昌市自然科學(xué)基金（14301－13）

李海濤，男，本科，主治醫(yī)師，研究方向：影像生物介入治療，E-mail：yczxyylihaitao＠sina.com；周華軍，通信作者，男，博士，主治醫(yī)師，研究方向：神經(jīng)疾病生化藥物，E-mail：zhouhuajun02＠126.com。