游廣輝，董娟，王麗娟

（1.鄭州人民醫(yī)院藥學部，河南鄭州450000；2.鄭州第一人民醫(yī)院藥劑科，河南鄭州450004；3.鄭州大學醫(yī)學院藥學院，河南鄭州450000）

響應(yīng)面法優(yōu)化沙棘提取工藝研究

游廣輝1，董娟2，王麗娟3

（1.鄭州人民醫(yī)院藥學部，河南鄭州450000；2.鄭州第一人民醫(yī)院藥劑科，河南鄭州450004；3.鄭州大學醫(yī)學院藥學院，河南鄭州450000）

目的以蘆丁提取量為響應(yīng)值，優(yōu)化沙棘的提取工藝。方法采用加熱回流法，結(jié)合單因素試驗和響應(yīng)面分析法，選取回流時間、乙醇濃度、溶劑倍量3個因素，對沙棘的提取工藝進行優(yōu)化考察。結(jié)果沙棘的最佳提取條件為：回流時間為70min，乙醇濃度為60%，溶劑倍量為12，在此提取條件下平均提取量為（0.268±0.005）mg／g。結(jié)論采用本實驗方法優(yōu)化沙棘的提取工藝，具有可行性。

沙棘；提取；蘆丁；響應(yīng)面法

沙棘為胡頹子科植物沙棘Hippophae rhamnoides L.的干燥成熟果實。系蒙古族、藏族習用藥材［1］。具有健脾消食，止咳祛痰，活血散瘀功效。用于脾虛食少，食積腹痛，咳嗽痰多，胸痹心痛，瘀血經(jīng)閉，跌撲瘀腫等癥［2］。沙棘是藥食兼用的功能植物，果實中含有脂肪酸、類胡蘿卜素、植物甾醇、黃酮醇苷、原花青素等多種活性物質(zhì)，并具有解重金屬毒、放射保護、抗氧化應(yīng)激、抗腫瘤、抗炎、抗?jié)?、調(diào)節(jié)免疫等多種藥理作用［3］。本實驗采用響應(yīng)面法擬合數(shù)據(jù)模型，優(yōu)化沙棘的提取工藝，為進一步制備沙棘新制劑提供參考［4］。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 PS-20型超聲波清洗器（深圳市科潔超聲科技有限公司）；DZKW-C型電子恒溫水浴鍋（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；SHB-3型循環(huán)水多用真空泵（鄭州杜甫儀器廠）；WFZ UV-2102 PCS型紫外可見分光光度計（尤尼柯上海儀器有限公司）；

蘆丁對照品（購自中國藥品生物鑒定所）；沙棘藥材（購自成都市荷花池中藥材市場）經(jīng)鄭州大學藥學院張振中教授鑒定為合格藥材；超純水自制；試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 含量測定方法的建立

①對照品溶液的制備：精密稱取蘆丁對照品適量，加60%乙醇，水浴微熱使溶解，制得含量為0.5mg／mL的對照品溶液。

②測定波長的選擇［5］：采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法。取對照品溶液2 mL于25 m L量瓶中，加60%乙醇至5mL，加5%亞硝酸鈉溶液1mL，混勻，放置6min，再加1M 10%硝酸鋁溶液1mL，搖勻，放置6min。再加氫氧化鈉試液10mL，加60%乙醇至刻度，搖勻，放置15min，以60%乙醇為空白，于波長400～600 nm范圍內(nèi)掃描，508 nm波長處有一最大吸收峰，故選擇508 nm為測定波長。

③標準曲線的繪制：精密量取對照品溶液1、2、3、4、5、6mL，分別置于25mL量瓶中，按1.2.1項下方法于波長508 nm下測定其吸光度，用60%乙醇作參比，以吸光度A對濃度C作線性回歸。

④供試品溶液的制備：將沙棘藥材，去雜質(zhì)，置于烘箱中60℃干燥6 h，粉碎過篩。各取10 g，精密稱定，回流溫度為80℃，將不同回流法的提取液濃縮，用提取時相應(yīng)濃度的提取溶液定容至25 mL，精密吸取1 mL，用乙醇稀釋至10 mL，搖勻備用。

1.2.2 單因素考察［6］

①考察回流時間對蘆丁提取量的影響：精密稱取沙棘各10 g，固定溶劑倍量為8，乙醇濃度40%，以回流時間40、50、60、70、80min進行提取，考察回流時間對蘆丁提取量的影響。

②考察乙醇濃度對蘆丁提取量的影響：精密稱取沙棘各10 g，固定溶劑倍量為8，按照最佳回流時間，分別用40%、50%、60%、70%、80%的乙醇作為提取溶劑，考察乙醇濃度對蘆丁提取量的影響。

③考察溶劑倍量對蘆丁提取量的影響：精密稱取沙棘各10 g，按照最佳乙醇濃度及回流時間，以溶劑倍量6、8、10、12、14進行提取。

1.2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝［7-8］：在單因素實驗的基礎(chǔ)上，以蘆丁的提取量為指標，選擇對沙棘提取效果影響較顯著的3個因素作為考察指標，即回流時間（A），乙醇濃度（B），溶劑倍量（C），采用三因素三水平的Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝［9］（見表1）。

表1 各因素水平的代碼值及實際物理量Tab.1 Code value of each factor level and actual quantity

2 結(jié)果

2.1 標準曲線 以吸光度A對濃度C作線性回歸得到：A＝12.899C－0.8932（r＝0.9995），結(jié)果顯示蘆丁在0.02～0.12mg／mL內(nèi)具有良好線性關(guān)系。

2.2 單因素考察結(jié)果

2.2.1 回流時間對蘆丁提取量的影響 由圖1可知，沙棘中蘆丁的提取量隨著回流時間的增加而升高，當回流時間為70min時，蘆丁的提取量取得較大值，此后隨著時間的延長，提取量反而降低，可能是因為蘆丁的溶出已較為完全，而回流時間的增加，導致其他雜質(zhì)溶出增加，相對減少了蘆丁的溶出，故選擇70min為最佳提取時間。

圖1 回流時間對蘆丁提取量的影響Fig.1 Effect of reflux extraction time on rutin extraction amount

2.2.2 乙醇濃度對蘆丁提取量的影響 由圖2可知，隨著乙醇濃度的升高，沙棘中蘆丁的提取量逐漸增大，當乙醇濃度達到60%時，蘆丁的提取量達到最大值，之后隨著乙醇濃度的增加，蘆丁含量反而下降，其原因可能是蘆丁是極性高的黃酮類化合物，且乙醇濃度過高，增加了醇溶性雜質(zhì)及色素等的溶出，故60%為乙醇最佳提取濃度。

圖2 乙醇濃度對蘆丁提取量的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on rutin extracts

2.2.3 溶劑倍量對蘆丁提取量的影響 由圖3可知，隨著溶劑倍量的增加，蘆丁的提取量上升到一定程度后，增加量反而降低，這可能是隨著溶劑體積的增大，其他可溶性雜質(zhì)的溶解度逐漸增大，進而導致蘆丁的提取量減少，故選定12為溶劑倍量。

圖3 溶劑倍量對蘆丁提取量的影響Fig.3 Effect of extracting solvent times on rutin extracts

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化提取結(jié)果 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝結(jié)果，見表2、表3。

表2 沙棘Box-Behnken中心組合實驗設(shè)計與結(jié)果Tab.2 Experimental design and results of seabuckthorn Box-Behnken center combination

表3 回歸系數(shù)顯著性分析Tab.3 Significance analysis of regression coefficient

采用Design-Expert8.0.6軟件對實驗數(shù)據(jù)進行二次回歸擬合，以蘆丁含量對數(shù)據(jù)進行擬合得到回歸方程：Y＝0.27-0.00625A＋0.010B＋0.016C＋0.015AB＋0.018AC＋0.015BC＋0.00625A2-0.026B2-0.024C2，P＝0.0160＜0.01；根據(jù)回歸方程可得，二次多項式擬合結(jié)果較好。方程回歸分析及方差分析結(jié)果見表3，并根據(jù)二次回歸方程繪制響應(yīng)面曲線，能得到2個因素交互作用對響應(yīng)值Y的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 兩因素交互作用對蘆丁提取量影響的響應(yīng)圖Fig.4 Response figure of two factor interactions on rutin extracts

由圖4可知，各因素對蘆丁提取量的影響由大到小依次為：溶劑倍量C＞乙醇濃度B＞回流時間A；在3個因素中，溶劑倍量及乙醇濃度之間的交互作用對響應(yīng)面的影響曲線較陡，等高線的數(shù)目也多于其他兩兩之間的交互作用，故乙醇濃度和溶劑倍量對蘆丁的提取量具有非常顯著的影響（P＜0.01）。

2.4 最佳處方的驗證 采用Design-Expert V8.0.6軟件分析數(shù)據(jù)，得到沙棘中蘆丁提取的理論最佳工藝條件為：回流時間為70.59min，乙醇濃度為61.03%，溶劑倍量為12.21。在此條件下預測蘆丁的提取量為0.276 mg／g?？紤]實驗具體操作性，按回流時間70min，乙醇濃度60%，溶劑倍量12，對沙棘進行3次平行驗證試驗，測得蘆丁的平均提取量為（0.268±0.005）mg／g。結(jié)果表明，試驗優(yōu)化的提取工藝參數(shù)準確可靠，具有實際應(yīng)用價值。

3 討論

沙棘為蒙古族、藏族習用藥材。在免疫系統(tǒng)、抗腫瘤、心血管系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、抗氧化、抗放射性、抗炎、抗過敏，以及對代謝影響等諸多方面均有作用［10］。同時，沙棘所含的維生素、黃酮類化合物、三萜及甾體類化合物、脂肪酸類、酚類、有機酸類、5-羥色胺、鞣質(zhì)、微量元素、多糖等多種化學成分［11］。

參考相關(guān)文獻［12］及中國藥典，本文以黃酮類成分蘆丁作為評價指標進行研究。通過單因素實驗和響應(yīng)面法相結(jié)合，考察了回流時間、乙醇濃度、溶劑倍量對蘆丁的提取量的影響，優(yōu)選沙棘的回流提取條件，結(jié)合實驗具體操作得到最佳超聲提取條件：回流時間為70min，乙醇濃度為60%，溶劑倍量為12，蘆丁的提取量較好，為沙棘新制劑的制備相關(guān)研究提供參考。

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（編校：王儼儼）

Study on optim izing extraction technics of Hippophae rhamnoides L.by response surfacemethodology

YOU Guang-hui1，DONG Juan2，WANG Li-juan3

（1.Department of Pharmacy，People's Hospital of Zhengzhou，Zhengzhou 450000，China；2.Department of Pharmacy，Zhengzhou First People's Hospital，Zhengzhou 450004，China；3.College of Pharmacy，Medical college of Zhengzhou University，Zhengzhou 450000，China）

ObjectiveTo optimize the extraction process of Hippophae rhamnoides L.with the content of rutin which is regarded as evaluation index.MethodsExtraction process of Hippophae rhamnoides L.was investigated and optimized based on the single factor experimentand response surface methodology with reflux extraction time，ethanol concentration，and solid-liquid ratio as three evaluation factors.ResultsThe results indicated that the optimal extraction processwas obtained as follows：12 times extracting solvent of60%ethanol under reflux extraction 70min；the average content of rutin was（0.268±0.005）mg／g.Conclusion Themethod to optimize the extraction process is reasonable.

Hippophae rhamnoides L.；extraction；rutin；response surfacemethodology

R283.6

A

1005－1678（2014）08－0180－03

國家自然科學基金項目（30973742）

游廣輝，男，碩士，副主任醫(yī)師，研究方向：臨床藥學，E-mail：youguanghui1212＠163.com。