張文成，常銘洋，王韞芳，裴雪濤

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間充質干細胞無異源/無血清培養(yǎng)基研發(fā)的現(xiàn)狀和前景

張文成，常銘洋，王韞芳，裴雪濤

100850 北京，軍事醫(yī)學科學院野戰(zhàn)輸血研究所全軍干細胞與再生醫(yī)學重點實驗室/510000 廣州，軍事醫(yī)學科學院華南干細胞與再生醫(yī)學研究中心

間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是廣泛存在于成體骨髓、脂肪、牙髓及圍產期臍血、臍帶、胎盤等多種人體組織器官中，具有多向分化潛能、良好的體外擴增能力以及免疫調節(jié)功能的成體干細胞[1]，近年來在外科燒傷[2]、軟組織填充[3]、終末期肝病[4]、心肌梗死[5]、糖尿病足[6]等疾病的治療中展現(xiàn)出良好的安全性和有效性。2011 年開始，韓國 KFDA 先后批準的全球首個治療急性心肌梗死的自體骨髓 MSCs 藥物Hearticellgram-AMI、治療軟骨再生的臍帶 MSCs 藥物Cartistem、治療復雜性克羅恩病并發(fā)肛瘺的自體脂肪來源 MSCs 藥物Cuepistem，以及加拿大衛(wèi)生部批準美國 Osiris 公司的干細胞藥物Prochymal 的上市，是 MSCs 臨床應用的歷史性進步，為合理、合法、安全、有效地應用于多種疾病的治療提供了新的契機。

在已知的眾多組織中，骨髓來源 MSCs 是研究和應用較為充分的一種。然而，因其取材技術要求嚴格、對供體造成痛苦較大，在一定程度上限制了其應用。近年來，脂肪、牙髓、臍帶及胎盤等組織 MSCs 分離技術的成熟，極大拓寬了 MSCs 的來源及其可能的應用前景。其中，臍帶 MSCs 因較成年組織 MSCs 具有更低免疫原性和更強的體外增殖能力，在異體細胞治療中顯現(xiàn)出更為突出的優(yōu)勢。

由于組織中 MSCs 數量極其有限，為了獲得足夠用于臨床應用的細胞量，需要在輸注前對其進行體外擴增。干細胞制劑制備所用的培養(yǎng)基成分除了要遵循《干細胞制劑質量控制及臨床前研究指導原則》所制定的“應有足夠的純度并符合無菌、無致病微生物及內毒素的質量標準，殘留的培養(yǎng)基對受者應無不良影響”的標準外，還要保證其“干性”、增殖及分化能力。盡管常規(guī)用于普通細胞培養(yǎng)的含胎牛/新生牛血清的培養(yǎng)體系同樣適合 MSCs 的體外擴增和維持，但血清批次的不穩(wěn)定性導致難以避免的異源性污染及培養(yǎng)細胞內殘存的動物血清引發(fā)的免疫等問題為其臨床應用帶來諸多隱患[7]?；谌搜寤蚱溲苌锏娜嗽椿囵B(yǎng)基以及無血清培養(yǎng)基的研發(fā)和應用為這些問題的解決提供了新的途徑和方案。

1 人源化 MSCs 培養(yǎng)基

目前已有研究嘗試利用自體血清、血漿或人外周血/臍血來源的血小板及其衍生物，如人血小板裂解物（human platelet lysate，hPL）等作為 MSCs 培養(yǎng)體系中異源性血清的替代物。自體血清無論是在倫理還是安全性方面都有一定的優(yōu)勢，但獲得的自體血清量往往不足以支持自體 MSCs 體外擴增至臨床應用所需的細胞數量級，而且大量采血對特殊人群造成的身體機能危害也不容忽視。Dahl 等[8]研究也證實，血清對 MSCs 的支持能力會隨機體病理改變和年齡增長而退減，這些問題限制了自體血清在 MSCs 體外規(guī)?；瘮U增中的應用。異體血清由于存在免疫排斥風險、一些常規(guī)方法無法檢測的病原體污染及可能涉及到的血液制品來源及交易等問題而被禁止在 MSCs 培養(yǎng)中應用。Lange 等[9]和 Abdelrazik 等[10]的研究證實，在添加 hPL 的培養(yǎng)基中培養(yǎng)擴增 MSCs，其成骨和脂肪誘導分化的能力會明顯減弱，表面特異性標志的表達也發(fā)生改變，并由此導致其體外的免疫抑制和免疫調節(jié)作用的削弱。雖然這些研究可能存在血清來源的個體差異等原因，但這些問題都是基于人源血清的培養(yǎng)基在應用前亟待解決的問題。

2 MSCs 無血清培養(yǎng)基

對 MSCs 等成體干細胞的體外多能性維持和擴增機制研究的深入，極大推動了 MSCs 體外無血清培養(yǎng)體系的研發(fā)和建立。2008 年，Invitrogen 公司推出第一款 MSCs 無血清培養(yǎng)基 StemPro? MSC SFM，專用于骨髓來源 MSCs 的分離培養(yǎng)。StemPro? MSC SFM 對 MSCs 體外增殖具有良好的作用，而且能在相當細胞代數內維持 MSCs 分化的多能性，這為長期以來因含血清培養(yǎng)基的使用帶來的異源性污染等問題提供了理想的解決方案。隨后R&D、Stemcell、ScienCell 等公司也先后推出了商品化的 MSCs 無血清培養(yǎng)基。

目前市售的無血清培養(yǎng)基大多包括基礎培養(yǎng)基和添加物兩部分，有的商品化無血清培養(yǎng)基還包括促進貼壁的明膠、膠原等細胞外基質，以增加細胞的貼壁能力，提高細胞得率。基礎培養(yǎng)基中的白蛋白、胰島素、轉鐵蛋白、脂質、維生素、激素以及微量元素等對維持 MSCs 的生長非常重要，而細胞生長因子則對其多能性維持和體外增殖起到決定性作用。Rodrigues 等[11]對維持 MSCs 增殖和多能性的細胞生長因子進行了系統(tǒng)的總結，發(fā)現(xiàn)單獨或聯(lián)合使用TGFβ、bFGF、VEGF、HGF、EGF、PDGF 以及 Wnt 蛋白家族 Wnt3a、Wnt5a 等細胞因子，可通過激活或抑制特異的細胞信號轉導通路而維持 MSCs 的增殖和多能性，這些主要的信號通路包括 Wnt、Notch、FGF 及 MAPK 信號通路（Ras-Raf-Mek1/2-Erk1/2）等。

盡管現(xiàn)有的 MSCs 無血清培養(yǎng)基不僅維持 MSCs 的體外增殖和分化多能性，而且具有批次可控和化學成分明確的特點，應用中具有良好的安全性，對 MSCs 臨床應用的規(guī)范化開展產生了重大的積極作用，但是，大多數已有的無血清培養(yǎng)基并不足以支持原代細胞培養(yǎng)，在原代細胞分離過程中仍然需要依賴低濃度血清實現(xiàn)細胞的獲取，且部分培養(yǎng)基需要對培養(yǎng)瓶/皿進行包被以促進細胞貼壁和生長，從而大大增加了細胞操作過程的工作量和污染幾率。此外，由于無血清培養(yǎng)基中大多以人源化重組蛋白、微量元素和生長因子的“雞尾酒”式組合實現(xiàn) MSCs 多能性的維持和體外擴增，所以目前在售的 MSCs 無血清培養(yǎng)基均價格昂貴，保存時間有限，使得廣大干細胞研究及臨床應用工作者望而卻步。因此，尋找成分明確、無異源性蛋白而且成本較低的無血清培養(yǎng)體系對于 MSCs 的臨床應用具有重要的意義。

3 基于小分子化合物的新型 MSCs 無血清培養(yǎng)基

小分子化合物是一類分子量低于 900 Da 的有機化合物，通常作為酶的底物或通過與其他生物大分子結合作用于特定的細胞轉導通路（例如，酪氨酸激酶受體等），在 DNA 復制、細胞分化、腫瘤轉移、細胞凋亡等過程中發(fā)揮重要的生物學作用。近年來，包括酪氨酸激酶抑制劑的一批小分子化合物藥物也投入臨床試用，證實其可以替代部分生產條件苛刻、服用復雜和價格昂貴的重組蛋白藥物，對腫瘤發(fā)揮靶向治療作用[12]，顯示出可觀的應用前景。小分子化合物因其成本低、批次質量穩(wěn)定的優(yōu)勢而逐漸替換原有體系中的部分細胞生長因子，被應用于干細胞體外多能性維持和定向誘導分化的研究中。目前，部分小分子化合物已經替代細胞生長因子用于胚胎干細胞（embryonic stem cells，ESCs）的培養(yǎng)及定向誘導分化體系中，ESCs 保持了體外全能性和長期擴增及多向誘導分化潛能[13-15]。

初步研究表明，多種小分子化合物通過作用于 MSCs 多能性相關的信號通路而對其增殖和多能性維持發(fā)揮重要的作用。Saraswati 等[16]研究證實，Wnt/β-catenin 信號通路抑制劑pyrvinium 可以有效提高 MSCs 的增殖并抑制其自發(fā)成骨分化能力。Heng[17]證實，在 ESCs 全能性維持中具有重要作用的 Rho 相關激酶抑制劑 Y-27632，同樣也可以有效提高 MSCs 凍存復蘇后的細胞存活率和貼壁生長能力。Hong 和 Kang[18]研究表明，在 MSCs 培養(yǎng)體系中加入 4 μmol/L Hedgehog 激動劑purmorphamine 可明顯提高 MSCs 的增殖能力，同時有效降低細胞凋亡的發(fā)生。雖然 TGFβ 在 MSCs 的維持中具有重要的作用，然而 Chen等[19]研究表明，使用 10 μmol/L TGFβ 抑制劑SB431542可以高效促進胚胎干細胞和誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）向 MSCs 誘導分化，并維持這類多能干細胞誘導分化獲得的 MSCs 的多能性和體外增殖能力。上述研究提示，小分子化合物與生長因子的作用并非完全等同，作用機制也各異；此外，不同的小分子化合物之間具有協(xié)同或拮抗作用，這都是在基于小分子化合物的無血清培養(yǎng)基研發(fā)和應用中值得注意的問題。

4 結語

MSCs 的無血清培養(yǎng)基為其安全、有效、可控地應用于基礎及臨床研究提供了理想的培養(yǎng)擴增環(huán)境。然而，目前已有的無血清培養(yǎng)基尚不完善，對其細胞致畸作用的評價及其體內、外長期的安全性評估還有待進一步驗證，不同培養(yǎng)體系中小分子化合物的組合方案也需要進行相應的改良。小分子化合物較細胞因子、生長因子更具穩(wěn)定性、批次可控性和價格優(yōu)勢，更容易實現(xiàn)真正的成分確定培養(yǎng)基的研發(fā)和推廣使用。通過高通量篩選合適的小分子化合物及其合理組合，可實現(xiàn)對 MSCs 無血清培養(yǎng)基中關鍵生長因子的替代和優(yōu)化，從而研發(fā)出更加安全、高效、易于質量控制且成本低廉的 MSCs 無血清培養(yǎng)基，為 MSCs 無血清培養(yǎng)體系的建立和臨床轉化研究與應用奠定基礎。

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國家高技術發(fā)展研究計劃（863 計劃）（2013AA020109、2012AA020501）

王韞芳，Email：wangyf2011126@126.com；裴雪濤，Email：peixt@nic.bmi.ac.cn

2013-11-22

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.02.009