薛淑雅，楊月峰

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重組腺病毒載體靶向性策略的研究進展

薛淑雅，楊月峰

230032 合肥，安徽醫(yī)科大學研究生院（薛淑雅）；100850 北京，軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所實驗血液學研究室（楊月峰）

近年來，研究者致力于突破基因治療的瓶頸，極大推動了基因治療的發(fā)展。載體系統(tǒng)是基因治療的基礎，截止 2013 年 7 月，在“Gene Therapy Clinical Trial Worldwide”網站登記注冊的基因治療方案中，重組腺病毒載體占 476 項（23.5%）。在 6 個亞群（A-F）、50 多種血清型的腺病毒載體中，5 型腺病毒（adenovirus type 5，Ad5）可特異性識別并結合多種正常組織高表達的柯薩奇病毒-腺病毒受體（coxsackie-adenovirus receptor，CAR）從而進入細胞發(fā)揮作用，基因轉導效率高，因此，Ad5 是目前應用最廣泛的腺病毒載體。

雖然 Ad5 對多種組織具有高效感染能力，但也存在脫靶效應這一缺陷。例如，正常肝臟細胞中 CAR 的表達高，系統(tǒng)用藥可能會使大量病毒滯留肝臟，產生毒副作用，使得 Ad5 在臨床應用中存在很大隱患[1]。因此，提高重組腺病毒的靶向性對于推動重組腺病毒的臨床應用意義重大。那么，如何增強腺病毒感染或目的基因表達的靶向性呢？近年來，研究者嘗試通過多種途徑提升重組腺病毒的靶向性，大量文獻報道主要是通過對基因轉導靶向和基因轉錄靶向的調控，實現(xiàn)治療的靶向性。我們對現(xiàn)有的研究進展作一綜述。

1 基因轉導靶向性策略

基因轉導，簡言之就是將目的基因導入到特定的細胞中。提高靶向性的實質就是提高重組腺病毒載體對特定細胞（組織）的感染效率，與此同時，降低其對其他細胞（組織）的感染效率。目前常用的策略包括：①改構腺病毒外殼，使其選擇性地與靶細胞膜表面的特異性受體結合；②通過雙功能分子和雙特異性抗體介導靶向轉導[2]等。

1.1 重組腺病毒外殼的改構與修飾

眾所周知，Ad5 通過識別靶細胞表面的 CAR 受體進入細胞，其具體過程為：腺病毒的纖維頂球與靶細胞表面 CAR 受體等黏附、結合；然后，由五聚體基部的一段肽鏈精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp，RGD）與細胞表面的“第二受體”整合素 αvβ3 和 αvβ5 識別并結合，通過受體介導的細胞內吞作用使病毒內化；最后，完成目的基因的轉錄、復制?；诖诉^程，針對參與病毒與靶細胞識別、病毒內化等過程的關鍵外殼蛋白，進一步進行結構改造與修飾，是提高重組腺病毒基因轉導靶向性的最直接策略。

Ad5 外殼蛋白的改構或修飾，可提高其對 CAR 受體低表達的腫瘤細胞的感染效率，同時，降低對 CAR 高表達的正常組織的感染。Wickham 等[3]和 Murugesan 等[4]的研究結果表明在野生型纖維蛋白的 C 末端連接多聚 RGD，可識別 αv 整聯(lián)蛋白，從而提高 CAR 低表達細胞的感染效率；進一步發(fā)現(xiàn)，改構后的病毒對 CAR 高表達的肝臟等組織的感染效率降低，因此無明顯系統(tǒng)毒性；同時對卵巢移植瘤的感染效率選擇性提高，治療效果明顯增強。另有研究表明，在纖毛結節(jié)區(qū)的 HI 環(huán)中插入與整合素結合的短肽（CDCGRDCFC，RGD-4C），可提升對 CAR 陰性細胞的感染效率和基因轉導效率[5]。

不同血清型的重組腺病毒識別不同的表面受體，而 B 組腺病毒可識別腫瘤細胞和造血細胞高表達的 CD46 分子。為提高重組腺病毒對腫瘤或造血細胞的靶向性，研究者結合 C 族 5 型腺病毒和 B 族腺病毒，構建了具有嵌合纖維頂球的重組腺病毒載體，包括 Ad5/F11P、Ad5/3 和 Ad5F35 等。Lu 等[6]采用11p 型腺病毒（Ad11p）的纖維頂球替換 5 型腺病毒載體的纖維頂球，獲得的雜合病毒 Ad5F11p 可顯著增強對造血細胞的感染效率。此外，含有 Ad5 與 Ad3 嵌合型纖維頂球的重組腺病毒可明顯增強對腫瘤細胞的感染效率[7]。同時，研究者驚喜地發(fā)現(xiàn)，將 5 型腺病毒載體的纖毛完全置換為 35 型腺病毒的纖毛，可使重組腺病毒的體內分布發(fā)生巨大變化，為實現(xiàn)系統(tǒng)給藥打下基礎[8]。因此，通過對重組腺病毒纖毛以及外殼蛋白的修飾，可使重組腺病毒具有特定的靶向性。

1.2 雙功能分子或雙特異性抗體介導的靶向性策略

雙功能分子或雙特異性抗體，即分子橋或抗體橋，其一端與腺病毒的衣殼蛋白結合，另一端與細胞表面特異性受體結合，從而將重組腺病毒導向靶細胞，該策略是提高轉導靶向性的另一重要方式。腫瘤細胞表面往往高表達成纖維細胞生長因子受體（fibroblast growth factors receptor，F(xiàn)GFR）和表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）等分子。研究表明，它們與腺病毒外殼蛋白的雙特異性分子可顯著提高對頭頸部鱗狀細胞癌、膀胱癌細胞（EGFR+）以及膠質細胞瘤（CAR 低表達）等多種腫瘤細胞的感染效率，同時又可減少肝臟毒性。另有研究表明，抗結節(jié)區(qū)抗體的 Fab 片段與 FGFR2 共扼結合，可提高重組腺病毒的治療效果，包括提升目的基因表達量，降低肝臟和系統(tǒng)毒性等[9-11]。

分子橋或抗體橋雖可顯著提高腺病毒基因轉導的靶向性，但仍存在不足之處，如制備和鑒定雙功能分子橋費時、費力，體內用藥有時可引起腺病毒的清除，補體系統(tǒng)激活等，從而限制了其臨床應用[12]。因此，積極改進制備工藝以及優(yōu)化分子結構，可以推進其在臨床上的應用。

2 基因轉錄靶向性策略

基因轉錄靶向性，是指在多種轉錄調控元件的調控下，實現(xiàn)目的基因在細胞內的高效、特異表達。其主要策略包括：①采用特異性啟動子調控目的基因的表達；②采用條件復制型溶瘤腺病毒策略；③采用雙啟動子[13]、增強子[14]和乏氧調控元件[15]等策略。

2.1 特異性啟動子調控策略

通過組織或腫瘤特異性啟動子（增強子）等調控外源基因的表達，是提高治療基因轉錄靶向性，減少毒性反應的重要途徑之一。理想的特異性調控序列，應具有無泄漏、特異性高、可調控和表達效率高等特點。至今，已有包括癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）[16]和人端粒酶反轉錄酶（telomerase reverse transcriptase，hTERT）[17]的調控序列等多種腫瘤特異性啟動子應用于該策略。例如，采用單純的或經修飾的 CEA 特異性調控序列，控制胞嘧啶脫氧酶（cytosine deaminase，CD）基因的表達，可使自殺基因高效、特異表達，實現(xiàn)腫瘤的靶向性治療[18-19]；由 hTERT 啟動子調控腺病毒基因組，并攜帶細胞因子信號肽抑制劑 3（suppressor of cytokine signaling 3，SOCS3）基因的重組腺病毒，能有效靶向腫瘤細胞并對正常細胞無毒副作用，因此被廣泛應用于肝癌的治療研究[20]。CEA、AFP、hTERT 等啟動子雖可在惡性腫瘤細胞獲得特異性表達，但仍存在一定的泄漏。因此，腫瘤的靶向性基因治療需要尋找表達更嚴密、效率更高的腫瘤特異性啟動子。

轉錄靶向的策略，是目前溶瘤腺病毒構建最常用的方法。在轉錄水平，通過腫瘤特異性啟動子，如甲狀腺球蛋白啟動子[21]和前列腺細胞特異性抗原（PSA）啟動子等，調控腺病毒復制必需基因的表達，可實現(xiàn)重組腺病毒特異性的復制。通過 PSA 特異性啟動子和前列腺特異性增強子（PSE）調控腺病毒復制必需基因 E1A 的表達，構建的前列腺癌特異性溶瘤腺病毒 CV706 可以有效地實現(xiàn)前列腺腫瘤細胞內特異性復制，從而進一步殺傷前列腺腫瘤細胞。該溶瘤腺病毒已完成 I 期臨床安全性評價[22]。

除腫瘤特異性啟動子外，可用于轉錄靶向調控的特異性啟動子還包括神經元特異性烯醇化酶（neuron-specific enolase，NSE）啟動子、II 型肺泡上皮特異性啟動子和細胞內細胞黏附分子-2（intracellular cell adhesion molecule-2，ICAM-2）啟動子等組織或細胞特異性啟動子等[23-25]。

2.2 條件復制型腺病毒策略

條件復制型腺病毒（conditionally-replicating adenovirus，CRAD），又稱溶瘤腺病毒（oncolytic adenovirus），是指在腫瘤細胞中特異性復制并裂解腫瘤細胞，進而釋放子代病毒，去感染周圍的腫瘤細胞，通過級聯(lián)放大效應最終消滅腫瘤。目前，CRAD 已被廣泛應用于腫瘤的治療與研究，并在動物及臨床前研究階段取得了令人鼓舞的結果。目前，有大量的相關臨床試驗正在開展。CRAD 的主要構建策略包括：①選擇性敲除腺病毒在腫瘤細胞中復制不必需的基因，但這些基因對于腺病毒在正常細胞中復制卻是必不可少的，如 ONYX-015 和 H101 等，其中 ONYX-015 處于 III 期臨床研究階段，而 H101 已在中國批準上市；②通過腫瘤（組織）特異性啟動子調控腺病毒復制必需基因 E1A 的表達等。第二種策略是目前研究者普遍采用的一種應用較為靈活且具有廣泛意義的方法，已在特異性啟動子調控策略中闡述，接下來詳細闡述第一種策略。

重組腺病毒 EIA 基因中 55 kD 蛋白區(qū)段缺失后，可使病毒在 p53 突變的細胞中選擇性復制并裂解細胞，最具代表性的是美國 ONYX 公司研發(fā)的腫瘤特異性增殖型病毒 ONYX-015，目前處于治療復發(fā)性頭部和頸部癌癥的 III 期臨床試驗階段，治療結直腸、卵巢、胰腺和口腔腫瘤的 II 期臨床試驗階段，以及治療消化道、食道和肝臟腫瘤的 I 期臨床試驗階段[26]；dl922-947 和△24 則通過刪除病毒單一保守區(qū) E1A-CR2 區(qū)基因，使其失去與 pRb 結合功能，從而實現(xiàn)靶向溶瘤[27]；而 AxdAdB-3 則同時存在E1A 和 E1B-55KD 兩處突變從而限制其只能夠在 p53 和 pRb 同時缺失的細胞中復制[28]。此外，Doronin 等[29]報道，去除 E3 區(qū)而 ADP 過表達的溶瘤腺病毒可選擇性地在分裂相的腫瘤細胞中復制，進而顯著延緩腫瘤的生長。

CRAD 只在腫瘤細胞內復制，而在正常細胞中不復制，具有產生旁觀者效應、溶瘤效應及明顯提高治療基因的表達效率等優(yōu)勢。

2.3 雙啟動子、增強子和乏氧調控元件等調控策略

多項研究表明，通過雙啟動子、增強子和乏氧調控元件等策略，可顯著提高腺病毒的靶向性。轉錄控制的溶瘤腺病毒 CG5757，攜帶了兩個腫瘤特異性啟動子，包含 E2F-1 和人端粒酶反轉錄酶基因。臨床前研究結果顯示，CG5757 全身應用具有低毒性及更好的腫瘤選擇性和更強的療效[13]。此外，將乏氧調控元件整合入改良后的人 α-甲胎蛋白（hAFP）啟動子后，大大提高了溶瘤腺病毒的選擇性和抗腫瘤效應[15]。

3 腺病毒雙靶向或多靶向策略

應用不同腫瘤特異性啟動子分別來控制腺病毒復制必需基因，如 E1A、E1B 和 E4 等，并結合外殼蛋白修飾等方法，可實現(xiàn)更為安全的多靶向溶瘤腺病毒治療。有學者首先利用 hTERT 啟動子、存活蛋白啟動子和 CEA 啟動子分別控制 E1A、E1B 和 E4 基因的表達，同時將 5 型腺病毒的纖維蛋白替換成 35 型。結果表明，該重組腺病毒能夠更安全、更有效地殺傷腫瘤[30]。

由劉新垣院士提出的癌癥的靶向雙基因-病毒治療策略，是指分別采用不同的策略構建溶瘤腺病毒 Ad-TERT 和 ZD55，然后分別將多種抗癌基因加入 ZD55 及 Ad-TERT 系統(tǒng)中。結果顯示，其療效優(yōu)于 ONYX-015、ZD55 或Ad-TERT[31-32]。研究證實，將分別攜帶不同基因的兩個病毒聯(lián)合使用，可以發(fā)揮其協(xié)同效應或互補作用，可增強其抗癌功能。這種雙基因-病毒治療策略，獲得了良好的抗癌療效，也是迄今不需用化療輔助就可在動脈腫瘤模型中將腫瘤全部消滅的、極具發(fā)展前景的生物治療方案之一[33]。

4 展望

重組腺病毒是臨床應用最為廣泛的基因治療載體，但是目前僅有很少的方案進入 III 期臨床試驗。因此，要實現(xiàn)其在臨床中的廣泛應用，還有諸多問題需要解決，如靶向性、病毒抗體的產生等問題。將重組腺病毒與其他治療手段，如放療、化療、免疫治療等聯(lián)合應用，將是基因治療的重要發(fā)展方向。已有研究報道，將 ONYX-015 和化療藥物如5-氟尿嘧啶、順鉑等聯(lián)合應用，可發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤作用，且療效優(yōu)于單獨化療[34-35]。

此外，溶瘤腺病毒本身在刺激機體抗腫瘤免疫上有較大的優(yōu)勢，如腫瘤細胞溶解后釋放大量自身抗原，為刺激機體產生腫瘤抗原特異性免疫反應提供了豐富的腫瘤抗原來源。利用溶瘤腺病毒作為載體，攜帶免疫調節(jié)基因或腫瘤相關抗原，感染腫瘤細胞后可作為腫瘤疫苗刺激機體產生針對該抗原的免疫反應。因此，如何將重組腺病毒與腫瘤免疫治療有機地結合起來，以充分調動機體的抗腫瘤免疫反應，是重組腺病毒領域的一個重要研究方向[36]。

本課題組在腺病毒轉錄靶向調控方面開展了大量工作，建立了基于 Adeasy系統(tǒng)的轉錄靶向溶瘤腺病毒制備體系，并先后完成了具有端粒酶靶向和前列腺癌靶向溶瘤腺病毒的研制和體內外評價工作[37]，目前，正在完善臨床前研究；此外，本課題組利用 Ad11p 腺病毒的 CD46 分子靶向作用，成功建立了具有造血細胞和腫瘤細胞靶向的 Ad5/F11p 重組腺病毒系統(tǒng)[6, 38]。在此基礎上，進一步完善重組腺病毒靶向性策略，推動腺病毒基因治療的臨床研究，將是我們下一步工作的重點。

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國家高技術發(fā)展研究計劃（863計劃）（2012AA020807）；國家自然科學基金（30901379）

楊月峰，Email：yuefengyang1981@163.com

2013-11-29

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.02.008