王 帥，吳子健,*，劉建福，胡志和，王連芬

雞卵類黏蛋白結(jié)構(gòu)與性質(zhì)研究進(jìn)展

王 帥1，吳子健1,*，劉建福1，胡志和1，王連芬2

（1.天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300134；2.北京食品科學(xué)研究院，北 京 100068）

雞卵類黏蛋白是雞蛋中最 主要也是過敏原性最強(qiáng)的過敏原蛋白。本文總結(jié)該蛋白的結(jié)構(gòu)，包括氨基酸序列、糖基組成、二硫鍵位置、二級(jí)結(jié)構(gòu)以及組成該蛋白的3 個(gè)結(jié)構(gòu)域，并描述其理化性質(zhì)，最后著重分析討論其 過敏原性，特別是其分子結(jié)構(gòu)中二硫鍵、糖基和結(jié)構(gòu)域等因素與過敏原性之間的內(nèi)在聯(lián)系。

雞卵類黏蛋白；過敏原性；二硫鍵；糖基；結(jié)構(gòu)域

雞蛋具有營養(yǎng)全面且營養(yǎng)素配比平衡的特點(diǎn)[1]，可提供均衡的蛋白質(zhì)、脂類、糖類、礦物質(zhì)和維生素等營養(yǎng)物質(zhì)，還含有大量磷脂類物質(zhì)（包括卵磷脂、腦磷脂、神經(jīng)磷脂），是一種重要的食品，利于嬰幼兒、兒童、發(fā)育期青少年的成長(zhǎng)發(fā)育，特別是利于其大腦和神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育；同時(shí)雞蛋也是重要的食品加工原料，具有優(yōu)良的凝膠性、乳化性、起泡性等加工特性，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于肉制品、糕點(diǎn)、面條、餅干等食品[2-3]。

然而，雞蛋也是一種主要的食物過敏原來源[4-6]，雞蛋的廣泛應(yīng)用也使得雞蛋過敏者無法通過規(guī)避的方式來解決其食用安全的問題，其對(duì)兒童和青少年的潛在危害尤其突出。例如：Cooke等[7]利用雙盲安慰劑對(duì)照食物激發(fā)實(shí)驗(yàn)（double-blind placebo-controlled food challenges，DBPCFC）檢測(cè)出470 例青少年過敏情況中有約66.7%的青少年是對(duì)雞蛋過敏。雞蛋過敏反應(yīng)涉及多種器官和系統(tǒng)，包括皮膚、胃腸道、呼吸及中樞神經(jīng)系統(tǒng)，可引起神經(jīng)性水腫、濕疹、腹痛、哮喘等[8]。目前已知雞蛋中過敏原主要有雞卵類黏蛋白（hen’s egg ovomucoid，HOVM）、卵白蛋白（ovalbumin，OVA）、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白（ovotransferrin，OTF）和溶菌酶4 種[3]，其中HOVM是雞蛋過敏反應(yīng)中致敏性最普遍、最強(qiáng)的蛋白，早在1950年，Miller等[9]就通過對(duì)342 名雞蛋過敏患者的皮膚測(cè)試發(fā)現(xiàn)這4 種蛋白的致敏性依次為：HOVM＞OVA＞OTF＞溶菌酶。因此分析研究HOVM的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)，特別是其結(jié)構(gòu)與其過敏源性的關(guān)系具有十分重要的意義，同時(shí)也是研究如何有效消減其致敏性的先決條件。

1 HOVM的結(jié)構(gòu)

1.1 HOVM的一級(jí)結(jié)構(gòu)

HOVM是一種單亞 基糖蛋白。其蛋白部分含量占75%～80%，由186個(gè)氨基酸殘基組成，其氨基酸殘基序列如圖1所示[10]，其中N末端為丙氨酸殘基，C末端為苯丙氨酸殘基[11]；整個(gè)蛋白中親水性殘基約占50.00%，包括天冬氨酸殘基、谷氨酸殘基、蘇氨酸殘基、天冬酰胺殘基、賴氨酸殘基等；疏水性殘基約占32.26%，包括纈氨酸殘基、脯氨酸殘基、酪氨酸殘基、亮氨酸殘基、苯丙氨酸殘基等；但不含色氨酸殘基；其他氨基酸殘基約為17.74%，包括15 個(gè)甘氨酸殘基，18 個(gè)半胱氨酸殘基，這18 個(gè)半胱氨酸殘基兩兩配對(duì)形成了9 個(gè)二硫鍵，其位置如表1所示。

圖1 HOVM亞基的一級(jí)結(jié)構(gòu)的氨基酸序列[10]Fig.1 Amino acid residues sequence of primary structure from HOVM[10]

表1 二硫鍵在結(jié)構(gòu)域中的位置[12]Table 1 Locations of disulfide bonds in each domain[12]

圖2 HOVM糖鏈結(jié)構(gòu)[15]Fig.2 Structure of sugar chains from HOVM[15]

HOVM分子約含有20%～25%的糖基（carbohydrate moiety），通常包含14.00%～16.00%的N-乙酰葡萄糖胺、6.50%～8.50%的甘露糖、0.50%～4.00%的半乳糖以及0.04%～2.20%的唾液酸等單糖殘基[13]。該蛋白分子一級(jí)序列含有5個(gè)N-連接糖基化位點(diǎn)，分別位于結(jié)構(gòu)域1的Asn10和Asn53、結(jié)構(gòu)域2的Asn69和Asn75以及結(jié)構(gòu)域3的Asn175[10]，這些位點(diǎn)都具有Asn-X-Thr/Ser序列[14]，其中結(jié)構(gòu)域3中的Asn175位點(diǎn)結(jié)合糖基概率約為50%，即該結(jié)構(gòu)域有兩種，一種含有糖基（糖基分子質(zhì)量約為3 ku），另一種不含糖基。由于糖鏈生物合成的差異，HOVM分子的糖基具有高度的微觀不均一性[15]，含有不同類型的糖基[16-17]。Yamashita等[18]研究指出HOVM所含糖基以三甘露糖五糖核心（即Manα1→6（Manα1→3）Manβ1→4GlcNAcβ1→4GlcNAc）為基礎(chǔ)，演化形成了3類五觸角雜合型N-連接的糖鏈基團(tuán)（penta-antennary complex-type asparagine-linked sugar chains），分別為N-1、N-2和N-3b，N-3b型糖基是這些糖鏈 共有的結(jié)構(gòu)（圖2a），約占整個(gè)糖蛋白分子的14%；而N-1型和N-2型是兩類N-3b型糖基的衍生物，其中N-1型由二個(gè)半乳糖殘基通過β1→4糖苷鍵分別與N-3b型2、3、4位觸角的N-乙酰葡萄糖胺共價(jià)結(jié)合，形成兩種同質(zhì)異構(gòu)分子（圖2b），而N-2型由一個(gè)半乳糖殘基通過β1→4糖苷鍵與N-3b型2、3、4位觸角的N-乙酰葡萄糖胺共價(jià)結(jié)合，形成3 種同質(zhì)異構(gòu)分子（圖2c）[15]。

1.2 HOVM的二級(jí)結(jié)構(gòu)及二級(jí)以上結(jié)構(gòu)

通常利用圓二色譜法（circular dichroism，CD）和旋光色散法（optical rotatory dispersion，ORD）來測(cè)定并計(jì)算HOVM分子中二級(jí)結(jié)構(gòu)組成。Tomimatsu[19]和Ikeda[20]等分別利用ORD法和CD法測(cè)得去除糖基的HOVM二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋的比例分別為27%以及26%，Baig等[21]也利用CD法得出未去除糖基的HOVM二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋的比例為30%，這些研究數(shù)據(jù)基本一致。Watanabe等[22]采用CD法并輔以鏈霉蛋白酶和內(nèi)-β-乙酰氨基半乳糖苷酶酶解去除蛋白的糖基的方法，同時(shí)測(cè)定了無糖基以及含糖基的HOVM二級(jí)結(jié)構(gòu)組成，其研究結(jié)果如表2所示。糖基部分對(duì)于HOVM的二級(jí)結(jié)構(gòu)中β-折疊和β-轉(zhuǎn)角組分比例影響較大，而對(duì)于α-螺旋以及無規(guī)卷曲所占比例幾乎沒有什么影響。

表2 HOVM二級(jí)結(jié)構(gòu)類型的組成[22]Table 2 Composition of secondary structure types of HOVM[22]

Kato等[10]利用胰蛋白酶酶解HOVM分子，將其進(jìn)一步分割成了3個(gè)相對(duì)獨(dú)立的同源結(jié)構(gòu)域，即Gal d1.1（氨基酸殘基1～68）、Gal d1.2（氨基酸殘基 65～130）和Gal d1.3（氨基酸殘基131～186），Gal d1.1 和Gal d1.2有50%的同源性，但 Gal d1.3與Gal d1.1和 Gal d1.2的同源性不足30%[7]（表1）。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)這3 個(gè)結(jié)構(gòu)域的一級(jí)結(jié)構(gòu)組成具有相似的特點(diǎn)：1）約含60 個(gè)氨基酸殘基（其中有兩個(gè)為酪氨酸殘基）[14]；2）每個(gè)都具有3 個(gè)域內(nèi)二硫鍵，而各域間沒有二硫鍵相連[7]；3）均含一個(gè)抗胰蛋白酶酶解作用的活性位點(diǎn)，位于域內(nèi)的一個(gè)開放環(huán)區(qū)[14]；4）每個(gè)域都含有糖鏈，但是Gal d1.1和Gal d1.2各含有2 個(gè)糖鏈，而Gal d1.3只含有1 個(gè)糖鏈（Gal d1.3結(jié)構(gòu)中的另一半不含糖鏈結(jié)構(gòu)）[10,23-24]。

Watanabe等[22]通過溴化氰（cyanogen bromide，CNBr）將HOVM分子裂解成Gal d1.1和Gal d1.2+ G a l d 1.3，并通過金黃色葡萄球菌蛋白酶V-8（Staphylococcus aureus protease V-8）將HOVM分子酶解成Gal d1.1+Gal d1.2和Gal d1.3，進(jìn)而分析各結(jié)構(gòu)域中二級(jí)結(jié)構(gòu)組成的含量，其結(jié)果如表3所示：其中α-螺旋在Gal d1.1中的含量較高，而在G al d1.2與Gal d1.3中含量較低；β-結(jié)構(gòu)在各個(gè)結(jié)構(gòu)域中的組分基本一致，不過β-轉(zhuǎn)角在Gal d1.3中含量較低；無規(guī)卷曲在Gal d1.2與Gal d1.3中含量較高，而在Gal d1.1中含量較低。

表3 HOVM二級(jí)結(jié)構(gòu)組分及其在結(jié)構(gòu)域中的分布[22]Table 3 Secondary structure fractions of HOVM and their distribution in each domain[22]

目前對(duì)于HOVM的空間結(jié)構(gòu)還沒有直接證據(jù)，但不同的禽類卵清卵類黏蛋白具有相同的空間結(jié)構(gòu)組成，因此HOVM的空間模式與源自鵪鶉卵清的卵類黏蛋白十分相似[14]。Weber等[14]指出日本鵪鶉卵清卵類黏蛋白Gal d1.3結(jié)構(gòu)域的空間構(gòu)型為球形，且大小為3.5 nm×2.7 nm×1.9 nm，包含兩條反平行β-折疊（殘基Pro22～Gly32）和1 個(gè)α-螺旋（殘基Asn33～Ser44），同時(shí)該結(jié)構(gòu)域內(nèi)所存在的廣泛相互作用使得域內(nèi)約70%的氨基酸殘基形成規(guī)正二級(jí)結(jié)構(gòu)（β-折疊和α-螺旋）或疏水核心，這些域內(nèi)穩(wěn)定的非共價(jià)相互作用以及域內(nèi)含有的3 個(gè)二硫鍵也極大地限制了構(gòu)象變化，維系著其天然構(gòu)象的穩(wěn)定性。

2 HOVM的理化性質(zhì)

HOVM是雞卵清中一種較為特殊的蛋白，具有一些獨(dú)特的理化性質(zhì)：1）抑制絲氨酸蛋白酶酶解的性能[25]，HOVM是一種絲氨酸蛋白酶抑制劑，包括專一性地抑制胰蛋白酶酶解活性，通常1 mg HOVM就可抑制相當(dāng)于1 mg的胰蛋白酶，特別是對(duì)豬和牛的胰蛋白酶具有很強(qiáng)的抑制作用，并且其抑制胰蛋白酶活性也受到加熱變性的影響，若將HOVM加熱充分，可使其喪失抗胰蛋白酶酶解的活性。但是HOVM對(duì)胰凝乳蛋白酶的抑制作用較低，若使其充分加熱變性，HOVM可被胰凝乳蛋白酶迅速水解。2）特殊的溶解性能，HOVM具有很好的水溶性能，即使在其等電點(diǎn)處，該蛋白的溶解度也很高，而且HOVM在三氯乙酸鹽溶液（約3%～5%）[26]和丙酮溶液（約50%～75%）[27-28]也具有相當(dāng)高的溶解度，Lineweaver等[25]發(fā)現(xiàn)稀釋6 倍的雞蛋清液與熱的三氯乙酸鈉鹽溶液（5%）1∶1混合時(shí)，HOVM仍無法沉淀，后來Fredericq等[26]研究發(fā)現(xiàn)pH 2.8～4.9、3%～5%范圍的三氯乙酸溶液中HOVM溶解度在12.6～16.15 g/L范圍內(nèi)變化不大，而雞蛋清中其他的蛋白溶解度則變化很大；Lineweaver等[25]還發(fā)現(xiàn)即便加熱使水溶液中的HOVM變性（即失去對(duì)胰蛋白酶酶解的抑制性能），其仍會(huì)在pH 4.1處（HOVM的等電點(diǎn)）具有相當(dāng)?shù)娜芙舛取Ｒ虼?，選擇合適的pH值、丙酮和三氯乙酸鹽濃度，可以從蛋清中除去大量的非HOVM[29-30]，從而可分離純化高純度的HOVM。3）較高的熱穩(wěn)定性，Lineweaver等[25]研究表明HOVM在80 ℃條件下加熱30 min后，其對(duì)胰蛋白酶酶解抑制活性只損失了約10%；Fraenkel-Conrat等[31]研究發(fā)現(xiàn)HOVM置于pH 5.0、7.0溶液中90 ℃加熱處理15 min，其活性分別為原來的80%、62%；Fredericq等[26]將HOVM置于pH 3.9溶液中100 ℃加熱1 h，其在pH 8.6、離子強(qiáng)度為0.1的二乙基巴比妥酸鹽緩沖液的電泳特性沒有發(fā)生改變。且Deutsch等[30]將HOVM于100 ℃加熱1 h后其黏度、電泳和沉降系數(shù)結(jié)果表明也沒有發(fā)生變性，但會(huì)喪失其生物活性，包括結(jié)合特異性抗體能力及其抗胰蛋白酶活性的喪失；Stevens等[27]發(fā)現(xiàn)將該蛋白置于pH 6.0、100 ℃加熱15 min后其抗胰蛋白酶活性仍為原來的30%；Bleumink等[32]甚至發(fā)現(xiàn)煮熟的雞蛋對(duì)雞蛋過敏患者仍保持過敏原性。4）耐受有機(jī)溶劑沉淀或變性的性能，其在中性及偏酸性溶液能夠耐受高濃度脲，例如，pH 3.0～7.0條件下將HOVM用9 mol/L尿素25 ℃處理18 h后其胰蛋白酶酶解抑制活性為未處理前的90%，加熱至100 ℃處理0.5 h后其活性仍保持66%，但將其置于pH 9.0的堿性條件下80 ℃處理0.5 h后其活性則迅速喪失，不足未處理的10%[25]。

3 HOVM的過敏原性

國內(nèi)外學(xué)者通常通過交叉放射免疫電泳（crossed radioimmunoelectropho-resis，CRIE）[33]、放射性過敏原吸收實(shí)驗(yàn)（radioallergo-sorbent test，RAST）[34]、斑點(diǎn)免疫印記（dot-immunoblotting）[35]以及皮膚點(diǎn)刺實(shí)驗(yàn)（skinprick test，SPT）[36]檢測(cè)確定雞蛋中的過敏原。大量研究表明HOVM是雞卵清中一種主要的過敏原，如表4所示，其對(duì)雞蛋過敏人群的致敏頻率達(dá)34%～97%，各個(gè)實(shí)驗(yàn)所得致敏率的差異可能是由于調(diào)查對(duì)象個(gè)體的不同或者是檢測(cè)方法有別。由于HOVM自身結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定，且對(duì)蛋白酶（特別是機(jī)體消化道蛋白酶）具有抑制性能[39]，造成該蛋白過敏原性很難消除，即便利用蛋白酶酶解將其降解 成肽段，這些降解得片段仍保持一定的抗原性和過敏原性，如Matsuda[40]、Gu[41]和Kovacs-Nolan[42]等的研究都發(fā)現(xiàn)經(jīng)胃蛋白酶消化分解得到的HOVM的片段還保留有與整體蛋白相似的抗原性和過敏原性。已有研究表明，HOVM不僅存在一定過敏表位，其蛋白內(nèi)在結(jié)構(gòu)中的氨基酸殘基組成、二硫鍵、糖基組成等都對(duì)其過敏原性的表達(dá)具有一定的作用。

表4 HOVM致敏率的測(cè)定Table 4 Allergenicity of HOVM

3.1 HOVM中的過敏原表位

目前已知通過熱處理或蛋白變性很難消除HOVM過敏原性以及抗原性，這表明引起超敏反應(yīng)前，抗體（IgE或IgG）與該蛋白結(jié)合表位主要是線性表位[40,43]。目前對(duì)于該蛋白中的氨基酸殘基組成對(duì)抗體結(jié)合的作用、HOVM與IgE或IgG結(jié)合的線性表位以及這些線性表位在3 個(gè)結(jié)構(gòu)域中的分布情況已經(jīng)有了一定的了解：1）氨基酸殘基組成對(duì)于抗體結(jié)合的重要性：Mine等[44]研究指出極性氨基酸殘基（絲氨酸殘基、蘇氨酸殘基、酪氨酸殘基和半胱氨酸殘基）、疏水性氨基酸殘基（亮氨酸殘基、苯丙氨酸殘基和甘氨酸殘基）以及側(cè)鏈帶電荷的氨基酸殘基（即天冬氨酸殘基、賴氨酸殘基和谷氨酸殘基）對(duì)于其與IgG抗體的結(jié)合很重要，在參與IgG結(jié)合的55 個(gè)氨基酸殘基中，極性氨基酸 殘基占27/55、疏水性氨基酸殘基占18/55、側(cè)鏈帶電荷的氨基酸殘基占10/55；2）HOVM參與抗體 結(jié)合的線性表位及其在結(jié)構(gòu)域中的分布：Cooke等[7]利用合成肽鑒別了5 個(gè)IgE結(jié)合表位（約7～20 個(gè)氨基酸殘基長(zhǎng)度）和7 個(gè)IgG結(jié)合表位（約9～34 個(gè)氨基酸殘基長(zhǎng)度）；Mine等[44]通過重疊肽膜確定HOVM中有9 個(gè)IgE結(jié)合表位（約5～16 個(gè)氨基酸殘基長(zhǎng)度）和8 個(gè)IgG結(jié)合表位（約5～11 個(gè)氨基酸殘基長(zhǎng)度），其在結(jié)構(gòu)域的分布如表5所示。

表5 HOVM IgE/IgG結(jié)合表位在結(jié)構(gòu)域中的分布Table 5 The distribution of IgE/IgG-binding epitopes in each domain of HOVM

HOVM與IgE或IgG結(jié)合引起超敏反應(yīng)的內(nèi)在原因不僅由于其線性表位，也有構(gòu)象表位的原因。Zhang Jiewei等[45]利用CNBr化學(xué)裂解法或金黃色葡萄球菌蛋白酶V-8酶解法分別制備得到Gal d1.1或Gal d1.2與Gal d1.3，并通過酶聯(lián)免疫反應(yīng)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）測(cè)定各個(gè)結(jié)構(gòu)域與雞蛋過敏患者血清之間的過敏反應(yīng)性，發(fā)現(xiàn)各個(gè)結(jié)構(gòu)域中的IgE和IgG的結(jié)合表位主要是線性結(jié)構(gòu)，但還存在構(gòu)象表位，因?yàn)?個(gè)結(jié)構(gòu)域與IgE反應(yīng)性的加和只占到HOVM與IgE總反應(yīng)性的55%～75%，同樣，3個(gè)結(jié)構(gòu)域與IgG反應(yīng)性的加和只占到HOVM與IgG總反應(yīng)性的50%～60%。HOVM與抗體結(jié)合總反應(yīng)性與這些結(jié)構(gòu)域與抗體結(jié)合反應(yīng)性加和之間的差異主要在于[45-46]：1）連接結(jié)構(gòu)域Gal d1.1與Gal d1.2之間以及結(jié)構(gòu)域Gal d1.2與Gal d1.3之間的氨基酸殘基存在著過敏原表位，但在制備各個(gè)結(jié)構(gòu)域時(shí)被酶解切除了；2）在制備各個(gè)結(jié)構(gòu)域的過程中，天然狀態(tài)的HOVM所具有的過敏原構(gòu)象表位也許被破壞。

3.2 二硫鍵對(duì)HOVM過敏原性的影響

研究二硫鍵對(duì)HOVM過敏原性作用時(shí)，首先將HOVM中的二硫鍵斷裂[7]（通常利用的兩種方法：過氧甲酸氧化或經(jīng)二硫蘇糖醇等還原劑還原再烷基化）。然后，采用ELISA法檢測(cè)并比較二 硫鍵斷裂前后的HO VM與IgE或IgG的結(jié)合活性。Djurtoft等[35]發(fā)現(xiàn)二硫鍵經(jīng)方法二斷裂后，HOVM與許多雞蛋過敏者血清中IgE和IgG的結(jié)合活性幾乎喪失，但也有少量過敏者血清中的IgE和IgG與之結(jié)合活性保持不變。Co oke等[7]采用雞蛋過敏患者血清并按照抑制-ELISA技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)該蛋白中二硫鍵經(jīng)方法一斷裂后沒有顯著影響HOVM結(jié)合IgE的活性，但顯著減少了其與IgG的特異性結(jié)合；同時(shí)發(fā)現(xiàn)二硫鍵經(jīng)方法二斷開后，HOVM結(jié)合IgE的活性顯著降低，但其與IgG的結(jié)合能力幾乎沒有變化。Zhang Jiewei等[45]發(fā)現(xiàn)該蛋白中二硫鍵經(jīng)還原再羧甲基化后，并沒有影響HOVM及其各結(jié)構(gòu)域與HOVM特異性IgG抗體結(jié)合的數(shù)量；但還原二硫鍵再羧甲基化的Gal d1.3與IgE的結(jié)合活性提高（由27.4%增至40.1%），如表6所示。

表6 雞蛋過敏患者IgE/IgG抗體與HOVM結(jié)構(gòu)域結(jié)合活性的平均 百分比[45]Table 6 The average percent activity of human IgG/IgE antibodies specifically bind to HOVM domains from egg-allergic patients[45]

毋庸置疑，二硫鍵是穩(wěn)定HOVM空間結(jié)構(gòu)的重要因素之一。前面所提各實(shí)驗(yàn)研究所得結(jié)果存在一定差異，間接表明構(gòu)象改變對(duì)不同過敏者血清中IgE與HOVM結(jié)合活性的影響是不同：優(yōu)先與構(gòu)象表位發(fā)生反應(yīng)的過敏者血清中的IgE與二硫鍵被還原的HOVM結(jié)合活性呈下降趨勢(shì)；而優(yōu)先與線性表位反應(yīng)的過敏者血清中IgE與二硫鍵被還原的HOVM結(jié)合活性呈上升趨勢(shì)[47-48]。

3.3 糖基對(duì)HOVM結(jié)合IgE/IgG活性的影響

糖基在整個(gè)HOVM分子中占有相當(dāng)?shù)谋戎?，可穩(wěn)定分子的結(jié)構(gòu)并使其具有耐熱、酸、堿以及抗酶解消化的作用[23,49]。研究糖基與HOVM結(jié) 合IgE/IgG活性關(guān)系，通常預(yù)先去除HOVM中的糖基，然后再對(duì)比去除糖基前后其與IgE/IgG結(jié)合活性的變化。Gu等[41]發(fā)現(xiàn)HOVM經(jīng)三氟甲磺酸（trifluoromethanesulfonic acid，TFMS）去糖基化（去除外周的半乳糖和內(nèi)部的甘露糖，但仍保留約40%的N-乙酰氨基葡萄糖）后，其免疫活性未發(fā)生改變。Besler等[38]也利用TFMS去除糖基（除糖基率約為98.4%）、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）免疫印跡法以及酶聯(lián)變應(yīng)原吸附實(shí)驗(yàn)（enzyme-allerg osorbent tes t experiments，EAST）測(cè)定，結(jié)果顯示去糖基化后的HOVM結(jié)合IgE活性并未發(fā)生變化。但是去除糖基后，HOVM的熱穩(wěn)定性和抗酶解性能必定下降，自然也會(huì)影響到HOVM結(jié)合IgE/IgG活性，Gu等[41]發(fā)現(xiàn)去除糖基的HOVM較含有糖基的HOVM更容易熱變性，進(jìn)而致使其與IgE結(jié)合活性的下降。

另一些研究則比較了含有糖基和未含糖基 的Gal d1.3（即兩種形式的Gal d1.3）結(jié)合IgE/IgG活性。如前文所敘，Gal d1.3若含有糖基，則該糖基的分子質(zhì)量約為3 ku。目前的研究結(jié)果 顯示了兩種現(xiàn)象：1）Matsuda等[50]發(fā)現(xiàn)含糖基的Gal d1.3與過敏血清中IgE結(jié)合 活性明顯高于未含糖基的Gal d1.3，且含糖基的Gal d1.3能與過敏血清中IgG結(jié)合，而不含糖基的Gal d1.3幾乎不與過敏血清中IgG結(jié)合；2）Zhang Jiewei等[45]發(fā)現(xiàn)未含糖基的Gal d1.3結(jié)合雞蛋過敏者血清中的IgE/IgG的活性明顯高于含糖基的，似乎糖基抑制Gal d1.3與IgE結(jié)合活性。

3.4 HOVM各結(jié)構(gòu)域的過敏原性

Matsuda等[50]研究顯示HOVM所含的3 個(gè)結(jié)構(gòu)域都具有與IgE/IgG結(jié)合活性，然而究竟是哪個(gè)結(jié)構(gòu)域占主導(dǎo)還存在一定的異議。Eigenmann等[51]利用外周血單核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）增殖測(cè)試發(fā)現(xiàn)，Gal d1.3對(duì)T細(xì)胞增殖的作用略大于Gal d1.2，但兩者差異并不明顯，而Gal d1.1卻顯著降低T細(xì)胞的增殖；另外他們還建立了HOVM特異性T細(xì)胞系模型，其產(chǎn)生的細(xì)胞因子多為Th2樣的因子，如白細(xì)胞介素-5（interleukin-5，IL-5）、IL-4、干擾素-γ、IL-13。Holen等[52]報(bào)道HOVM可促進(jìn)T細(xì)胞的增殖，而最終CD4+/CD8+T細(xì)胞得到了富集，且CD2+含量大于95%，同時(shí)HOVM可誘導(dǎo)約1%的B細(xì)胞合成IgE。Cooke等[7]研究發(fā)現(xiàn)IgE會(huì)優(yōu)先結(jié)合Gal d1.2，而在數(shù)量上3 個(gè)結(jié)構(gòu)域結(jié)合IgG并無區(qū)別，另外PBMC增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明HOVM各個(gè)結(jié)構(gòu)域均會(huì)提高T細(xì)胞增殖，但是Gal d1.1的作用要遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于Gal d1.2和Gal d1.3。Zhang Jiewei等[45]的研究結(jié)果表明IgE/IgG結(jié)合活性最高的是Gal d1.3，且HOVM特異性結(jié)合IgE抗體以及IgG抗體的比例幾乎相同。

4 結(jié) 語

HOVM是雞蛋中最主要的過敏原蛋白，且所引起的過敏反應(yīng)也是最強(qiáng)烈，嚴(yán)重影響雞蛋過敏癥患者的生活質(zhì)量甚至是生命安全，因此如何消減該蛋白的過敏原性已成為食源性過敏蛋白的熱點(diǎn)問題。目前研究者對(duì)其結(jié)構(gòu)、性質(zhì)以及分子結(jié)構(gòu)與組成對(duì)其過敏原性的影響等都有較深入的研究。但 如何利用物理法（加熱法和非加熱法）、化學(xué)法（化學(xué)修飾）、酶法以及基因工程法加工HOVM并消減其過敏原性，開發(fā)制備安全、低致敏性的雞蛋類食品仍亟待進(jìn)一步的研究。

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Recent Advances in Understanding the Structure and Characteristics of Hen’s Egg Ovomucoid

WANG Shuai1, WU Zi-jian1,*, LIU Jian-fu1, HU Zhi-he1, WANG Lian-fen2
(1. Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science, Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China; 2. Beijing Academy of Food Sciences, Beijing 100068, China)

Hen’s egg ovomucoid (HOVM) is the most dominant allergic protein with the strongest allergenicity in egg. In this paper, the structure and characteristics of HOVM are reviewed with respect to amino acid sequences, carbohydrate moieties, disulfide bond positions and three tandem domains. Meanwhile, the physicochemical properties of HOVM are also described. The emphasis is put on discussing its allergenicity, especially its intrinsic relationships with structural features such as disulfide bonds, carbohydrate moieties and three domains

hen’s egg ovomucoid; allergenicity; disulfide bond; carbohydrate moiety; domain

R392.1

A

1002-6630（2014）17-0326-06

10.7506/spkx1002-6630-201417061

2014-05-26

天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃面上項(xiàng)目（14JCYBJC30900）

王帥（1990—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：wswangshuaiws@126.com

*通信作者：吳子?。?973—），男，副教授，碩士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：wzjian@tjcu.edu.cn