■ 冷進(jìn)松 朱 珠 孫國玉 劉長虹

(1.吉林工商學(xué)院食品工程學(xué)院，吉林長春130062；2.糧油食品深加工吉林省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林長春130062；3.河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南鄭州450001)

紫蘇（Perilla frutescens）作為我國傳統(tǒng)的藥食兩用植物，也是國家衛(wèi)生部首批頒布的既是食品又是藥品的60種中藥之一。紫蘇籽是紫蘇成熟的果實(shí)，含有豐富的紫蘇油和蛋白質(zhì)，其蛋白質(zhì)含量約為20%～25%。浸出法提油后的紫蘇餅粕蛋白質(zhì)含量更為豐富，高達(dá)28%～45%，其氨基酸組成較全面，種類多達(dá)18種，并含有人體所必需的8種氨基酸，具有氣味芳香，適口性好，雜質(zhì)少的特點(diǎn)。紫蘇餅粕不存在對人體健康有害的物質(zhì)，是很好的植物蛋白資源。隨著紫蘇大面積種植和紫蘇油開發(fā)利用而產(chǎn)生大量的紫蘇餅粕副產(chǎn)物只是作為動物飼料、燃料或回入田中充當(dāng)肥料，沒有得到充分合理的利用，并且在一定程度上還可能造成環(huán)境污染。因此，有效利用紫蘇餅粕資源，研究開發(fā)蛋白新產(chǎn)品十分必要。高壓脈沖電場(PEF)輔助提取天然成分是近幾年發(fā)展起來的一種非熱提取技術(shù)，其原理是高壓脈沖電場可以在很短時(shí)間內(nèi)使細(xì)胞壁和細(xì)胞膜電位混亂，改變其通透性，并可以擊破細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，使細(xì)胞組分流出，從而有助于對天然成分的提取。此方法提取溫度低，因此被提取物的分子結(jié)構(gòu)不易被破壞，而且省時(shí)、高效、低能耗。本文采用高壓脈沖輔助堿溶酸沉法，通過在不同電場強(qiáng)度、脈沖頻率、料液比、堿提溫度、堿提時(shí)間、堿提pH值的條件下提取紫蘇餅粕蛋白工藝的研究，為紫蘇蛋白資源的開發(fā)利用提供理論指導(dǎo)和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

壓榨紫蘇餅粕(吉林沃達(dá)食品有限公司)；牛血清蛋白、濃鹽酸、氫氧化鈉、硫酸銅、濃硫酸、四氯化碳、酒石酸鉀、甲基紅(市售分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 儀器與設(shè)備

AY120型島津托盤電子分析天平(日本島津制作所)；Sigma 1-14K高速冷凍離心機(jī)(德國SIGMA公司)；IKA A11小型冷凍粉碎機(jī)(德國IKA集團(tuán))；101A-3型電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海實(shí)驗(yàn)儀器廠)；EG823MF4-NR1型微波爐(美的集團(tuán)股份有限公司)；FW-80萬能粉碎機(jī)(上海仕元科學(xué)器材有限公司)；22PC可見分光光度計(jì)(上海棱光技術(shù)有限公司)；HH-S恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠)；SHB-3循環(huán)水多用真空泵(廣州市深華生物技術(shù)有限公司)；PHS-802酸度計(jì)(北京華瑞博遠(yuǎn)科技發(fā)展有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程

脫脂紫蘇粕→加水?dāng)嚢琛⒉ㄌ幚怼鶱aOH溶液調(diào)節(jié)pH值→攪拌→離心分離→蛋白質(zhì)溶液→鹽酸調(diào)節(jié)至等電點(diǎn)→離心分離→干燥→紫蘇蛋白。

1.3.2 可溶性蛋白質(zhì)的測定

1.3.2.1 雙縮脲試劑的配制

取1.5 g硫酸銅和6.0 g酒石酸鉀鈉溶于500 ml蒸餾水中,加入300 ml的10%NaOH溶液并攪拌,用蒸餾水定容至1 000 ml即可,此試劑可長期保存。

1.3.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

牛血清白蛋白(BSA)用0.9%NaCl溶液配制成10 mg/ml標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液。取6只10 ml試管并編號,分別加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液,用蒸餾水補(bǔ)足至1.0 ml,然后各加入雙縮脲試劑4.0 ml,旋渦混合器混勻1 min,在室溫下放置30 min,于540 nm處,以蒸餾水作參比,進(jìn)行比色測定,以牛血清白蛋白濃度(mg/ml)為橫坐標(biāo)(X),吸光度A為縱坐標(biāo)(Y)繪制濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

圖1 牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.3.2.3 樣液測定

取樣品溶液1.0 ml置容量瓶內(nèi),加入1.0 ml CCl4,加入雙縮脲試劑3.0 ml,旋渦混合器混勻1 min,在室溫下放置30 min后,4 000 r/min離心10 min,取上清液于540 nm處,以蒸餾水作參比,進(jìn)行比色測定,對照標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求得樣品溶液蛋白質(zhì)的濃度。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.3.1 單因素實(shí)驗(yàn)

采用單次單因素法，假定各因素不存在交互作用，當(dāng)其它因素保持不變，只改變其中1個(gè)因素，然后逐個(gè)進(jìn)行考察分析。

1.3.3.2 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，對電場強(qiáng)度（kV/cm）、脈沖頻率(Hz)、料液比、堿提溫度(℃)、堿提時(shí)間(min)、堿提pH值6個(gè)因素進(jìn)行考察，每個(gè)因素取低水平“-1”和高水平“l(fā)”。另設(shè)1個(gè)虛擬列，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)次數(shù)N=12的Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)，以提取率Y為回應(yīng)值，Plackett-Burman試驗(yàn)因素及結(jié)果見表1。

1.3.3.3 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

響應(yīng)面的擬合方程須在緊接鄰域內(nèi)才近似真實(shí)情形，在其它區(qū)域，擬合方程與被近似的方程毫無相似之處，幾乎無意義；因此，找出主要因素后，必須通過使主要因素同時(shí)朝向響應(yīng)值的最大方向變化，逼近最大響應(yīng)區(qū)間，找出峰值，才能建立有效響應(yīng)面方程。最陡坡法是多因素序貫試驗(yàn)法中的一種方法，它是將多個(gè)需要考查的因素組合在一起同時(shí)試驗(yàn)，而不是一次只變動一個(gè)因素，因而有利于揭露各因素間的交互作用，可沿著試驗(yàn)指標(biāo)變化最快的方向迅速找到最優(yōu)條件。這種試驗(yàn)方法在選礦領(lǐng)域的潛在用途是很廣泛的。尤其在最佳工藝條件的選擇問題上更顯示出了它的科學(xué)性和實(shí)用性。利用Plackett-Burman設(shè)計(jì)試驗(yàn)，確定以電場強(qiáng)度(x1)、脈沖頻率(x2)、料液比(x3)、堿提pH值(x4)4個(gè)主要因素為自變量，以提取率(Y)為回應(yīng)值。

1.3.3.4 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)Box-Benhnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，用來評價(jià)指標(biāo)和因素間的非線性關(guān)系，估計(jì)一階、二階與一階交互作用項(xiàng)的多項(xiàng)式模式，是一種有效的響應(yīng)面設(shè)計(jì)法。利用Design-Expert8.0.5b進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化影響紫蘇餅粕蛋白粉的4個(gè)主要因素：微波時(shí)間(x1)、料液比(x2)、堿提溫度(x3)、堿提pH值(x4)進(jìn)行優(yōu)化組合，考察目標(biāo)為蛋白質(zhì)提取率。

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

表1 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

利用Minitab對Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果如表2所示，其標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.177 92，預(yù)測誤差平方和為60.39%，回歸方程的系數(shù)R2為95.60%；調(diào)整后R2為87.90%。

表2 偏回歸系數(shù)及影響因子的顯著性分析

從檢驗(yàn)結(jié)果可以看出：主效應(yīng)中，電場強(qiáng)度(x1)、脈沖頻率(x2)、料液比(x3)、堿提pH值(x4)4個(gè)主要因素效應(yīng)顯著，其P值分別為0.004、0.008、0.021和0.048，均小于0.050，可以作為進(jìn)一步優(yōu)化的因素。其他因素對結(jié)果影響不大，在進(jìn)一步研究中，取中間水平，對影響效果不進(jìn)行分析。

2.2 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)，確定以電場強(qiáng)度(x1)、脈沖頻率(x2)、料液比(x3)、堿提pH值(x4)4個(gè)主要因素為自變量，以提取率(Y)為回應(yīng)值，其因素水平編碼與結(jié)果見表3。

由表3可知：第3組實(shí)驗(yàn)的提取率最高。這說明最優(yōu)實(shí)驗(yàn)在第4組實(shí)驗(yàn)附近。故以實(shí)驗(yàn)3的條件為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平的中心點(diǎn)，電場強(qiáng)度(x1)、脈沖頻率(x2)、料液比(x3)、堿提pH值分別為30 kV/cm、15 Hz、1∶22、9進(jìn)行下一步研究。

表3 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.3 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

基于單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，對優(yōu)化工藝條件進(jìn)行了一系列的實(shí)驗(yàn)，在最陡爬坡實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Benhnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理。利用Design-Expert8.0.6進(jìn)行Response Surface Methodology(RSM)響應(yīng)面法優(yōu)化影響紫蘇餅粕蛋白提取率的四個(gè)主要因素：電場強(qiáng)度(x1)、脈沖頻率(x2)、料液比(x3)、堿提pH值(x4)進(jìn)行優(yōu)化組合?？疾炷繕?biāo)為提取率，實(shí)驗(yàn)因素水平安排以及根據(jù)以上水平編碼設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)表格并檢測響應(yīng)值結(jié)果見表4。

對表4數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，可求出影響因素的一次效應(yīng)、二次效應(yīng)以及交互效應(yīng)的關(guān)聯(lián)方程并可繪制出響應(yīng)面圖。該模型通過二階經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛯ψ兞康捻憫?yīng)行為進(jìn)行表征，即：

式中：Y代表響應(yīng)值，β0、βi、βii分別表示偏移項(xiàng)、線性偏移和二階偏移系數(shù)，βij是交互效應(yīng)系數(shù)，xi是各因素的編碼值。對表4試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合得到感官評分(Y)對編碼自變量x1、x2和X3的二次多項(xiàng)式回歸方程：

表4 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果

表5結(jié)果表明，模型是顯著的(P＜0.05)，R-Squared=0.692 4，Adj R-Squared=0.384 9，Pred R-Squared=-0.771 6，模型變異系數(shù)為10.52%，精密度為4.811，說明模型準(zhǔn)確度和精密度都較高，用該模型進(jìn)行分析和預(yù)測是合理的。

表5 回歸模型系數(shù)及顯著性檢驗(yàn)

由表5可知，一次項(xiàng)X4顯著，由F值和Prob＞F可知，單因素的影響順序?yàn)閤1＞x4＞x2＞x3，電場強(qiáng)度＞堿提pH值＞脈沖頻率＞料液比；二次項(xiàng)x12、x22、x32高度顯著，x42顯著。

2.4 回應(yīng)曲面分析

2.5 最佳條件的確定

圖2 兩因素交互作用對紫蘇餅粕蛋白提取率影響的響應(yīng)曲面

為了確定最佳工藝配方條件，對回歸方程取一階偏導(dǎo)數(shù)等于零解方程組得x1=-0.264 896，x2=0.299 463、x3=-3.833 197，x4=-0.350 252，此時(shí)Y=28.756 81%，即紫蘇餅粕蛋白提取的最佳工藝參數(shù)為電場強(qiáng)度27.351 04 kV/cm、脈沖頻率16.497 32 Hz、料液比為1∶14.333 61、堿提pH值為8.649 748。為檢驗(yàn)響應(yīng)曲面法所得結(jié)果的可靠性，采用最佳提取工藝條件進(jìn)行紫蘇餅粕蛋白粉脫臭加工，考慮到實(shí)際操作的便利，將工藝參數(shù)修正為：電場強(qiáng)度28 kV/cm、脈沖頻率15 Hz、料液比為1∶15、堿提pH值為9。

3 結(jié)論

本研究應(yīng)用Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法快速篩選了對紫蘇餅粕蛋白提取效果有影響的各個(gè)因素，既省時(shí)也可同時(shí)比較分析各因素之間的交互作用，保證了實(shí)驗(yàn)的精確性。并通過最陡爬坡試驗(yàn)以及Box-Behnken中心組合試驗(yàn)，建立了紫蘇餅粕蛋白質(zhì)提取相互作用的二階多項(xiàng)式回歸模型。對回歸模型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，獲得最優(yōu)化工藝。高壓脈沖輔助提取紫蘇餅粕蛋白質(zhì)的最佳工藝條件為：電場強(qiáng)度28 kV/cm、脈沖頻率15 Hz、料液比為1∶15、堿提pH值為9。在此條件下，紫蘇餅粕蛋白質(zhì)提取率為27.001 31%。

（參考文獻(xiàn)15篇，刊略，需者可函索）