■周萬里 朱思榮 高廣恒 史建國 畢春元

(1.山東省科學院生物研究所，山東濟南250014；2.山東省科學院中日友好生物技術研究中心，山東濟南250014)

海洋紅酵母不僅含有豐富的蛋白質、氨基酸、維生素，而且還能產生胡蘿卜素和蝦青素等，是高檔水產品肌肉色素的主要來源。目前國內海洋紅酵母生產中，由于檢測生物類參數的傳感器缺乏,一些對反應過程重要的生物變量不能在線測量，給發(fā)酵過程的控制帶來了盲目性。要實現發(fā)酵生產過程優(yōu)化控制，首先解決生物反應過程相關生物量的在線檢測問題[1]，這已成為發(fā)酵工業(yè)面臨的主要技術瓶頸之一，發(fā)酵過程的在線檢測和優(yōu)化控制是提高工業(yè)發(fā)酵生產水平的有效途徑。

目前發(fā)酵工業(yè)生產中通常采用兩種方法實現生物量測量：一種是通過在線分析儀表，如HPLC、GC等，這類在線分析技術在不斷發(fā)展，但在工業(yè)生產環(huán)境仍存在著維護工作量大、測試成本高、分析周期長、測量結果滯后等缺陷；另一種方法是采用離線分析測量[2]，即目前生產過程中常采用離線分析方法，每隔幾小時采樣一次送化驗室進行人工分析，離線人工分析通常滯后幾小時，難以滿足生產要求。

生物傳感器是生物識別單元與信號轉換元件耦聯形成的功能器件，以生物活性單元作為生物敏感膜，通過各種信號轉換器捕捉待測物與敏感物質間的反應，是分析生物化學信息獲取的重要工具。其中，固定化酶生物傳感器已廣泛應用于醫(yī)藥、食品、化工、環(huán)境、能源等領域，其特點是：特異性好，分析速度快，測定成本低，結果準確，可實現對復雜樣品中特定生化組分的快速或在線檢測[3]，這對解決發(fā)酵過程生化參數的在線檢測提供了先進的技術支撐。

本文采用生物傳感器分析方法，建立了葡萄糖、乳酸、乙醇等生化參數的在線檢測技術，通過多傳感器融合，實現了葡萄糖、乳酸、乙醇、pH值、OD等多參數在線分析系統(tǒng)[4]。該系統(tǒng)集合常規(guī)發(fā)酵罐所有功能的同時，還具有了對發(fā)酵過程中關鍵點監(jiān)控的功能，為建立更科學的發(fā)酵控制數學模型[5]奠定了數據基礎，有了更科學的控制模型可以更好地對發(fā)酵過程進行優(yōu)化控制[6]，進一步滿足發(fā)酵行業(yè)的需求。該在線檢測系統(tǒng)在海洋紅酵母高密度培養(yǎng)[7]生產中得以成功應用，采用葡萄糖母液為發(fā)酵原料，通過分析優(yōu)化發(fā)酵過程數據，建立了流加反饋控制方法，為海洋紅酵母發(fā)酵生產提供了新的檢測控制模式[8]，也為生物傳感器在線檢測系統(tǒng)[9]在發(fā)酵行業(yè)的廣泛應用奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

海洋紅酵母菌，由山東省科學院生物研究所提供。

1.1.2 試劑

葡萄糖母液(濰坊盛泰藥業(yè)有限公司提供)；氫氧化納(化學級)；硫酸銅(分析純)。

1.1.3 種子培養(yǎng)基

70 g/l葡萄糖、50 g/l蛋白胨、2 g/l磷酸二氫鉀、0.5 g/l硫酸鎂、5 g/l硫酸銨。

1.1.4 發(fā)酵培養(yǎng)基

10 g/l葡萄糖、35 mg/l氨基氮、2 g/l磷酸二氫鉀、0.5 g/l硫酸鎂、3 g/l硫酸銨。

1.1.5 主要儀器

CHI800電化學分析儀(上海辰華儀器公司)；GUJS-15-100C全自動發(fā)酵罐系統(tǒng)(鎮(zhèn)江東方生物工程設備技術有限責任公司生產，控制系統(tǒng)自主研發(fā)安裝)；在線無菌取樣裝置、智能稀釋裝置和生物量檢測傳感器，自制；高壓蒸汽滅菌鍋(北京盛達生物電子設備有限公司)；高溫烘箱(上海精科儀器設備廠)；離心機(LD4-2A)；HYG-II型固轉恒溫調速搖瓶柜(上海新星自動化控制成套設備廠)；數碼顯微鏡(奧林巴斯CX31型)。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

無菌條件下，將斜面保存的海洋紅酵母菌種接入裝有50 ml種子培養(yǎng)基的250 ml搖瓶中，置于搖床中以200 r/min震蕩，30℃下培養(yǎng)18 h即可。將制備的種子液按5%的接種量接種至裝有10 L發(fā)酵培養(yǎng)基的15 L全自動發(fā)酵罐中，發(fā)酵周期40 h，溫度30～32℃，pH值 5.0，溶氧30%，初始葡萄糖濃度30 g/l，培養(yǎng)過程中通過流加葡萄糖維持發(fā)酵液中葡萄糖濃度為0.5 g/l、氨基氮濃度為40 mg/l。

1.2.2 生物敏感膜的制備

葡萄糖氧化酶0.03 U、20%牛血清白蛋白5 μl、2%戊二醛2 μl、均勻噴涂在載體膜圈表面,靜置固化15 min，用蒸餾水洗去多余反應物，冷凍干燥即得。

1.2.3 配套試劑

緩沖劑：為保護酶膜并創(chuàng)造酶反應最適條件的專用輔助材料，用蒸餾水配制。

SBA三合一標準液：100 mg/dl葡萄糖、100 mg/dl乙醇、50 mg/dl乳酸混合標準液。

1.3 生物傳感器在線檢測系統(tǒng)

生物傳感器在線監(jiān)測系統(tǒng)主要包括：在線無菌自動取樣裝置、智能稀釋裝置、生物量檢測傳感器、常規(guī)發(fā)酵罐檢測模塊和人機交互控制界面等幾大部分。

1.3.1 在線無菌取樣裝置（見圖1）

圖1 在線無菌取樣裝置

在開始發(fā)酵前，微開P23，AA1，發(fā)酵過程的取樣完全由自動閥控制。自動取樣過程如下：先開吹氣閥A29和取樣閥P25，凈化空氣通過取樣管路進入發(fā)酵罐，經一定延時后關P25，開啟夾斷閥2和3，凈化空氣吹凈取樣管路內可能存在的水分。然后關閉吹氣閥A29，打開取樣閥P25，發(fā)酵罐內的發(fā)酵液在罐壓的作用下排出，當管道內的液體檢測器測到有發(fā)酵液到達后立即關閉夾斷閥2，禁止發(fā)酵液繼續(xù)外排，同時開氣動閥P23，使P23后部的發(fā)酵液

回吹到發(fā)酵罐內。一定延時后關閥P25，留下P23和檢測器之間的一段發(fā)酵液作為檢測用發(fā)酵液。發(fā)酵罐自動取樣間隙，取樣管路充滿凈化空氣，與取樣口沒有發(fā)酵營養(yǎng)液的連接，不易污染取樣口，但為確保發(fā)酵不被污染，在長期發(fā)酵測試中，應每隔12 h對取樣口進行一次滅菌操作，方法同前，滅菌操作應在自動分析系統(tǒng)完成取樣后立即進行，在下次取樣前完成操作。

1.3.2 智能稀釋裝置和生物量檢測傳感器（見圖2）

圖2 生物傳感器自動稀釋、檢測反應裝置

生物量的檢測是通過自動采樣、自動稀釋、自動標定和自動測定實現，基于生化反應的測定體系是實現系統(tǒng)功能的關鍵。取樣、稀釋和測定主要由以下系統(tǒng)有機組合而成。

采樣池用于發(fā)酵液的自動采樣，本系統(tǒng)檢測兩個發(fā)酵罐，采樣池是一體的兩個直徑9 mm的獨立的小池，可以防止兩個發(fā)酵罐發(fā)酵液的混合，發(fā)酵液通過取樣蠕動泵從底部送入，發(fā)酵液的氣泡和在取樣過程中注入的空氣從采樣池上部自動逸出，樣品測完成后，剩下的發(fā)酵液通過蠕動泵反轉和電磁夾斷閥切換流通管路，作為廢液排出。

稀釋池分二級，第一級固定稀釋10倍，或20倍（總500倍稀釋時），第一級稀釋池同時用于光密度（OD）的測定。第二級則根據實際稀釋倍數調整。由于稀釋池清洗后有清洗水的殘留，所以稀釋過程需要減少加稀釋水的量，以抵消殘留水的影響。標樣池僅用于存放標準液，是一個中心有取樣孔的容器，自動分析過程中需要保證標樣池中始終有標樣，如標樣用盡，則定標過程會出現酶活太低報警。

三電極反應池為生物傳感器測量過程酶促反應提供測定環(huán)境，在反應池的左、右和后方各安裝一支H2O2酶電極，反應池的前部安裝緩沖液進、出口接口。反應池正中為反應腔，清洗過程緩沖液通過入口進入反應腔，再通過反應腔上方的錐形溢流帽排到廢液腔，最后經排液出口排出到廢液中。由于三電極系統(tǒng)反應池反應腔體積較大，在清洗前先通過排空接口把混有樣品的緩沖液排空，加快清洗速度，并節(jié)約緩沖液的使用。

1.3.3 發(fā)酵過程在線檢測系統(tǒng)整體構架（見圖3）

圖3 發(fā)酵過程在線檢測系統(tǒng)

整個控制系統(tǒng)共有幾大部分：信號采集模塊、A/D轉換模塊、人機交互界面、中央控制單元、D/A轉換模塊、控制設備。整個系統(tǒng)的流程如下：首先通過信號采集模塊即參數傳感器（如溫度傳感器、OD傳感器、溶氧電極、pH值電極、壓力傳感器、在線生物傳感器等）采集到相應的信號，經由A/D轉換模塊進行A/D轉換，轉換完畢后傳遞到中央處理器C8051F120,中央控制器根據人機界面發(fā)出的控制指令，根據相應的控制算法進行計算后，將輸出的控制信號傳遞給D/A轉換模塊，控制信號經D/A轉換后傳遞給控制設備，從而實現對控制設備的控制。在該系統(tǒng)中上位機主要起到遠程監(jiān)控的作用。發(fā)酵過程主要需要控制的變量有溫度、溶解氧含量、光密度、壓力、底物、pH值、轉速等。

1.3.4 發(fā)酵控制系統(tǒng)人機交互界面設計

發(fā)酵控制系統(tǒng)采用工業(yè)級彩色觸摸液晶屏作為人機對話輸入輸出設備，顯示屏為10.4寸TFT LED背光屏，所用的操作均通過仿WINDOWS的觸摸控制實現，點擊顯示屏上的相應按鈕，可以完成各種操作。

控制界面類似于WINDOWS的屬性頁，分為3個工作區(qū)，如圖4所示。

界面上面為頁頭區(qū)，點擊不同的頁頭，可以快速切換到不同的工作界面，當前顯示頁面頁頭為凸起狀態(tài)，字符顯示為黃色。由于頁面不能在一行內顯示，在頁頭的右側有2個翻頁按鈕，可以切換顯示的頁頭。頁頭區(qū)的最右側，有2個按鈕，用于A罐和B罐的切換，當前顯示罐的按鈕狀態(tài)下按下狀態(tài)，字符顯示為黃色?？刂平缑娴淖钕露藶闋顟B(tài)區(qū)，在狀態(tài)區(qū)的左側顯示最后一次發(fā)酵的發(fā)酵時間，或在滅菌狀態(tài)下顯示滅菌計時。狀態(tài)區(qū)的最右側，顯示當前時間日期信息。控制界面的中部為人機對話頁面，用于數據顯示和輸入輸出，本控制系統(tǒng)共有9個顯示頁面，分別為“主界面”、“發(fā)酵曲線”、“數據列表”、“發(fā)酵參數”、“電極標定”、“動態(tài)控制”、“SBA設置”、“SBA信息”和“系統(tǒng)設置”，每一頁實現相應的功能。

圖4 發(fā)酵控制系統(tǒng)人機交互界面

2 結果與討論

利用生物傳感器在線檢測裝置，實現了海洋紅酵母發(fā)酵過程中葡萄糖、乳酸、乙醇、DO、pH值、OD等多參數在線動態(tài)顯示如圖5所示。

圖5 海洋紅酵母發(fā)酵過程動態(tài)顯示

利用生物傳感器在線檢測系統(tǒng)確定海洋紅酵母高密度培養(yǎng)的最佳工藝：最適培養(yǎng)溫度為30～32℃；最適pH值為5.0；最適溶氧(DO)為30%；培養(yǎng)過程中通過流加補料維持發(fā)酵液中葡萄糖濃度為0.5 g/l、氨基氮濃度為40 mg/l。在此條件下，培養(yǎng)40 h后細胞干重最高可達56.6 g/l，細胞得率42.4%。

海洋紅酵母使用生物傳感器在線分析裝置前后對比見表1。

表1 海洋紅酵母發(fā)酵在線分析裝置使用前后對比結果

3 小結

總之，SBA生物傳感器在線分析系統(tǒng)實現多種生化參數的在線檢測。該系統(tǒng)包括取樣、樣品預處理裝置、液體泵、注射閥、傳感器、信號轉換和計算機。其測定方式為是安裝在反應器外，被測樣液經取樣裝置、稀釋系統(tǒng)后被送至傳感器檢測單元，與生物傳感器接觸反應產生信號。

發(fā)酵過程在線檢測技術的發(fā)展趨勢是物理參數、化學參數和生物參數傳感器的集成，使在線檢測系統(tǒng)能用于檢測培養(yǎng)介質特性的變化、代謝過程中能量變化、菌體的生長變化、原料的消耗和產物的合成過程。同時，應加強對測量參數及其變化意義的綜合性理解，在基因水平、細胞水平和反應器工程水平等不同層次上認識和建立發(fā)酵過程分析的理論體系，切實可行地發(fā)揮在線檢測技術在發(fā)酵工業(yè)中的應用效果。