曲 衛(wèi) 張 靜 姜兆順* 萬國峰 韓晨東 李 霖 王 靜 李美曄 張勝蘭

抗TNF-α抗體減輕創(chuàng)傷感染應(yīng)激高血糖大鼠急性胰島素抵抗的實驗研究*

曲 衛(wèi)①張 靜△姜兆順①*萬國峰①韓晨東①李 霖①王 靜①李美曄①張勝蘭①

目的：研究抗腫瘤壞死因子α抗體(anti-TNF-α antibody)對腹部創(chuàng)傷合并感染膿毒血癥大鼠的急性胰島素抵抗的影響機(jī)制。方法：建立大鼠創(chuàng)傷膿毒癥導(dǎo)致高血糖的動物模型，并隨機(jī)分為4組，分別給予大劑量和小劑量抗TNF-α治療；通過血糖、血清胰島素水平、葡萄糖耐量試驗以及高胰島素正葡萄糖鉗夾試驗等方法比較各組大鼠的差異。結(jié)果：采用抗TNF-α抗體治療可顯著降低術(shù)后血清胰島素水平、葡萄糖耐量、葡萄糖輸注率和肝組織Akt磷酸化水平，提高mTOR磷酸化水平。結(jié)論：抗TNF-α抗體治療可調(diào)節(jié)肝組織胰島素信號通路Akt和mTOR的磷酸化水平，進(jìn)而減輕創(chuàng)傷感染應(yīng)激后大鼠急性胰島素抵抗程度。

應(yīng)激性高血糖；大鼠；抗TNF-α抗體；胰島素抵抗

[First-author’s address] Department of Endocrinology, Jinan General Military Hospital, Jinan 250031, China.

創(chuàng)傷后血糖升高的現(xiàn)象非常普遍，其持續(xù)存在將導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)、誘發(fā)感染以及影響組織修復(fù)，增加多器官功能不全的發(fā)生率和病死率。炎性因子是引起慢性胰島素抵抗的重要原因。前期研究發(fā)現(xiàn)，抗腫瘤壞死因子α(anti-tumor necrosis factor-α，anti-TNF-α)單克隆抗體治療可以降低大鼠創(chuàng)傷感染應(yīng)激條件下的炎性因子水平及肝組織內(nèi)炎癥通路的信號分子表達(dá)，提高大鼠的生存率，提示炎性因子水平的改善可能有助于減輕急性胰島素抵抗的發(fā)生。本研究擬通過觀察anti-TNF-α抗體干預(yù)對腹部創(chuàng)傷合并感染的大鼠的急性胰島素抵抗的影響，并探討可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物模型建立和動物分組

SPF級8周齡Wistar大鼠200只，體質(zhì)量為230～250 g，購自山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心。采用實驗大鼠盲腸結(jié)扎穿孔(cecal ligation and puncture，CLP)術(shù)＋內(nèi)毒素(3 mg/kg)腹腔內(nèi)注射方法，建立創(chuàng)傷膿毒癥致高血糖模型。將大鼠隨機(jī)分為4組：大劑量抗TNF-α抗體治療組(TNF組)、小劑量抗TNF-α抗體治療組(tnf組)、非藥物干預(yù)手術(shù)對照組(Cntl組)和正常對照組(CN組)。其中單克隆TNF組6 mg/kg腹腔注射，tnf組3 mg/kg腹腔注射。大鼠使用氯胺酮麻醉，開腹后將盲腸末端以手術(shù)線結(jié)扎，再以手術(shù)針頭刺破腸壁，擠出少許糞便，然后將盲腸納入腹腔，逐層縫合腹壁。術(shù)畢腹腔內(nèi)以3 mg/kg注射內(nèi)毒素，大鼠自由進(jìn)食進(jìn)水，觀察7 d。

1.2 血糖與血清胰島素測定

大鼠CLP術(shù)后12 h內(nèi)使用強(qiáng)生穩(wěn)豪血糖儀測定其鼠尾末梢毛細(xì)血管血糖，每2 h監(jiān)測血糖1次，每日監(jiān)測血糖3～4次，ELISA法監(jiān)測大鼠血清胰島素水平。

1.3 葡萄糖耐量試驗

大鼠CLP術(shù)后第24 h進(jìn)行腹腔注射葡萄糖耐量試驗。每只大鼠按10 ml/kg體重進(jìn)行腹腔注射10%葡萄糖注射液，記錄注射前及注射后0.5 h、1 h、2 h、3 h鼠尾末梢血糖值，為防止血糖儀誤差，每個時點均連續(xù)測2次血糖，取均值。

1.4 正葡萄糖鉗夾試驗

葡萄糖耐量試驗結(jié)束后，以氯胺酮麻醉大鼠，直視下進(jìn)行頸內(nèi)靜脈和股靜脈穿刺插管，分別連接靜脈輸液裝置及注射泵，一臺注射泵固定速率輸注常規(guī)人胰島素(200 mμ/kg bolus，20 mμ/kg/min)，另一臺連續(xù)輸注20%葡萄糖，監(jiān)測血糖(5 min/次)，根據(jù)血糖水平調(diào)節(jié)葡萄糖輸注速度，當(dāng)血糖水平達(dá)到穩(wěn)定(約為5.0 mmol/L)并持續(xù)50 min后記錄葡萄糖的輸注速率。

1.5 蛋白質(zhì)印跡

采用蛋白質(zhì)印跡(Western blot)法檢測大鼠肝臟組織P-sr473位點磷酸化Akt與總Akt、磷酸化mTOR與總mTOR的表達(dá)水平，并根據(jù)灰度值計算P-sr473Akt/Akt、P-mTOR/mTOR的表達(dá)比率。蛋白質(zhì)印跡所需抗體：抗-phospho-S473-Akt、抗-total-Akt、抗-phospho-mTOR、抗-totalmTOR，購自美國Santa Cruz公司。取大鼠肝組織0.2 g，與提取緩沖液混勻制備勻漿，置于-80 ℃冰箱儲存?zhèn)溆?。采用蛋白測定BCA法測定組織裂解液中蛋白質(zhì)濃度。取各組30 ug蛋白質(zhì)上樣溶解于10%SDSPAGE電泳分離，然后轉(zhuǎn)移至醋酸纖維膜，封閉過夜，加入一抗孵育2 h，洗膜，依次加入二抗及底物孵育1 h，TTBS溶液洗2次，TBS溶液洗1次。將化學(xué)發(fā)光試劑ECL的A液和B液等量混合，點于轉(zhuǎn)印膜上，室溫孵育1 min，傾掉ECL混合液，使用保鮮膜覆蓋后置暗盒中暴光。X光片掃描成像，經(jīng)凝膠自動分析成像系統(tǒng)和ImageJ圖像分析軟件對圖中印跡區(qū)帶進(jìn)行定量分析。以cntl組作為對照組，比較各組大鼠上述實驗結(jié)果的差異。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行相關(guān)統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以α=0.05作為檢驗標(biāo)準(zhǔn)，采用單因素方差分析進(jìn)行兩兩組間比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠不同時間的平均血糖水平和血清胰島素水平比較

大鼠血糖水平于術(shù)后1 h開始急劇升高，4～6 h達(dá)到峰值，6 h以后緩慢下降，至術(shù)后1周時仍然高于術(shù)前水平，各組大鼠創(chuàng)傷后各時間的平均血糖水平無顯著差異(如圖1所示)。

圖1 各組大鼠術(shù)后不同時間血糖水平比較

TNF組和tnf組于術(shù)后6～72 h的血清胰島素水明顯減低，cntl組相比其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=5.543，F(xiàn)=3.677；P＜0.05)，且呈劑量依賴性(如圖2所示)。

圖2 各組大鼠術(shù)后血清胰島素水平動態(tài)比較

2.2 各組大鼠葡萄糖耐量試驗結(jié)果

各組與NC組相比，大鼠葡萄糖耐量均顯著升高，存在統(tǒng)計學(xué)差異(F=7.895，F(xiàn)=10.944，F(xiàn)=11.770；P＜0.01)；與cntl組比較，TNF組對術(shù)后第24 h大鼠經(jīng)腹腔注射的葡萄糖耐量具有降低作用，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=4.086，P＜0.05)；而同時間tnf組僅有輕微降低作用，無統(tǒng)計學(xué)差異(如圖3所示)。

圖3 各組大鼠葡萄糖耐量實驗結(jié)果

2.3 各組大鼠高胰島素正葡萄糖鉗夾試驗結(jié)果

高胰島素正葡萄糖鉗夾試驗結(jié)果顯示，與NC組相比，各手術(shù)組葡萄糖輸注率均顯著減低，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=14.338，F(xiàn)=6.229，F(xiàn)=8.631；P＜0.05）；同時，TNF組和tnf組抗TNF-α抗體治療組的葡萄糖輸注率高于cntl組，兩兩比較具有統(tǒng)計學(xué)差異(F=6.062，F(xiàn)=5.892；P＜0.05)。

圖4 正葡萄糖高胰島素鉗夾實驗結(jié)果

2.4 大鼠肝組織Psr473Akt/Akt和P-mTOR/mTOR的蛋白表達(dá)比率

與cntl組相比，各抗TNF-α抗體治療組均可不同程度地降低大鼠肝組織Akt的磷酸化水平，降低效果呈劑量依賴性，TNF組比tnf組降低效果更強(qiáng)(F=9.931，P＜0.05) (如圖5所示)。

圖5 各組大鼠P-Akt/Akt蛋白表達(dá)比較

與cntl組相比，各抗TNF-α抗體治療組均可提高大鼠肝組織mTOR的磷酸化水平，效果呈劑量依賴性，即TNF組優(yōu)于tnf組(F=10.954，F(xiàn)=6.125；P＜0.05)(如圖6所示)。

圖6 各組大鼠P-mTOR/TOR蛋白表達(dá)比較

3 討論

應(yīng)激性高血糖在創(chuàng)傷、失血、膿毒癥、燒傷和危重癥患者中非常常見[1-3]。創(chuàng)傷和急危重癥引起的高血糖，往往會增加并發(fā)癥發(fā)病率和病死率，給疾病預(yù)后帶來不良結(jié)果[4-5]。創(chuàng)傷與危重癥引起的應(yīng)激性高血糖發(fā)生，是由于肌肉組織對外周葡萄糖攝取減少和肝臟葡萄糖輸出增多所導(dǎo)致，通常被認(rèn)為是急性胰島素抵抗的表現(xiàn)，包括胰島素受體前和(或)后信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路受阻因素。

近年來，針對肥胖和2型糖尿病的慢性胰島素抵抗的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α與慢性胰島素抵抗的發(fā)生關(guān)系密切。多項基礎(chǔ)研究表明，抗腫瘤壞死因子α抗體可以改善脂肪細(xì)胞分泌的炎癥因子引起的慢性胰島素抵抗[6-7]。采用抗TNF-α單克隆抗體在治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病的臨床試驗研究，意外獲得了幫助改善這類患者的胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)的益處[8-10]。盡管已知TNF-α對急性胰島素抵抗有一定的影響，但抗TNF-α抗體治療對于急性胰島素抵抗的作用機(jī)制，目前還所知甚少[11]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗TNF-α抗體治療雖然對創(chuàng)傷應(yīng)激狀態(tài)下大鼠葡萄糖水平無明顯幫助，卻可以降低創(chuàng)傷后血清胰島素水平，并呈劑量依賴性的改善大鼠創(chuàng)傷后24 h的葡萄糖耐量和提高高胰島素正葡萄糖鉗夾試驗的葡萄糖輸注率。因此，抗TNF-α抗體治療可能會通過改善創(chuàng)傷與危重癥患者的急性胰島素抵抗而使拮抗TNF-α治療成為一種治療急性胰島素抵抗的手段。

本研究前期結(jié)果提示，胰島素強(qiáng)化治療可以降低高血糖危重癥患者的炎性因子水平，從而改善患者生存率。然而，近年來的系列臨床研究卻認(rèn)為強(qiáng)化胰島素治療對這部分患者并不能獲益，強(qiáng)化胰島素治療因增加低血糖事件的發(fā)生而增加了患者的病死率，從而導(dǎo)致了陰性結(jié)果[12-13]。因此，針對創(chuàng)傷后的重癥患者能夠改善其急性胰島素抵抗分子機(jī)制的一些治療思路，可能會對預(yù)防和治療應(yīng)激性高血糖提供新的治療方法。近期臨床試驗發(fā)現(xiàn)，抗TNF-α抗體治療能夠改善類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)[14]。而在有關(guān)膿毒癥的臨床試驗中，抗TNF-α治療卻未能顯示其顯著改善病情的療效，其主要是因為試驗結(jié)果受患者病情嚴(yán)重程度的影響更為顯著[15]。然而動物實驗研究顯示，TNF-α抗體治療能夠降低膿毒癥實驗動物的血清TNF-α和IL-6水平，減少機(jī)體的蛋白質(zhì)分解代謝，減輕血清皮質(zhì)醇水平升高的幅度，提高腹腔感染伴多器官功能障礙實驗動物的生存率和改善胰島素受體底物和胰島素c-Jun氨基末端激酶(JNK)信號的激活，能夠降低高脂餐飼養(yǎng)大鼠的血糖脂代謝紊亂和肝脂肪變程度[16]。使用TNF-α抗體治療也能夠提高丙型病毒性肝炎患者的胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗TNF-α抗體干預(yù)可以呈劑量依賴性地降低大鼠肝組織Psr473Akt/Akt的表達(dá)比率，提高大鼠肝組織P-mTOR/mTOR的表達(dá)比率，提示拮抗TNF-α治療對于肝組織胰島素受體后信號轉(zhuǎn)導(dǎo)具有一定調(diào)節(jié)作用，其可能是作用于肝組織胰島素信號通路Akt和mTOR的磷酸化水平，從而減輕創(chuàng)傷應(yīng)激后急性胰島素抵抗程度。

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Experimental study on effect of anti-TNF-α antibody to alleviate the acute insulinresistance induced by stress hyperglycemia after traumatic infection

/QU Wei, ZHANG Jing, JIANG Zhao-shun, et al// China Medical Equipment,2014,11(8):4-7.

Objective: The objective of this study was to investigate the alleviating effect of TNF-α Antibody on acute insulin resistance induced by experimental stress hyperglycemia after traumatic infection. Methods: On stress hyperglycemia model of rats induced by sepsis, rats were randomly divided into groups, which were given antagonist therapy of high-dose or low-dose TNF-α. Then blood glucose, serum insulin level, glucose tolerance test and hyperinsulinemic euglycemic clamp test were used to evaluate the differences among the intervention groups. Results: Anti-TNF-α antibody could significantly reduce serum insulin levels, glucose tolerance, rate of glucose infusion and the phosphorylation level of AKt in liver tissue, meanwhile, it could also raise the phosphorylation level of mTOR. Conclusion: Therapy using Anti-TNF-α antibody could reduce the degree of acute insulin resistance after stress hyperglycemia induced by post-traumatic infection, which may adjust by the phosphorylation level of mTOR and AKt in signaling pathway of insulin metabolism.

Stress hyperglycemia; Rats; Anti-TNF-α antibody; Insulin resistance

1672-8270(2014)08-0004-04

R587

A

10.3969/J.ISSN.1672-8270.2014.08.002

2014-05-28

中國博士后科學(xué)基金面上項目(20080441294)“抗TNF-a抗體對創(chuàng)傷感染應(yīng)激性高血糖大鼠急性胰島素抵抗的作用及機(jī)制”

△共同第一作者：張靜 濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院干部一科 山東 濟(jì)南 250031

①濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院內(nèi)分泌科 山東 濟(jì)南 250031

*通訊作者：zhaoshunjiang@sohu.com

曲衛(wèi)，女，(1971- )，博士，主治醫(yī)師。濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院內(nèi)分泌科，研究方向：內(nèi)分泌與代謝相關(guān)疾病。