丁 寧 康 樂(lè) 高 明 孫文鵬

復(fù)方兒茶止瀉霜對(duì)番瀉葉致瀉大鼠結(jié)腸水通道蛋白3表達(dá)的影響*

丁 寧①*康 樂(lè)②高 明②孫文鵬②

目的：探討復(fù)方兒茶止瀉霜對(duì)番瀉葉致瀉大鼠模型結(jié)腸組織水通道蛋白3(AQP-3)表達(dá)的影響。方法：將50只SD大鼠隨機(jī)分為空白組、陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、高劑量組和低劑量組5組，每組10只。模型建立成功后取大鼠結(jié)腸組織，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和蛋白質(zhì)Western blot印跡法檢測(cè)各組動(dòng)物結(jié)腸AQP-3的表達(dá)水平。結(jié)果：RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示一致，高劑量組、低劑量組結(jié)腸AQP-3 mRNA和蛋白表達(dá)水平與陰性對(duì)照組、空白組比較均增多，高劑量組增加顯著(F=48.687，P＜0.05)；高劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組相比較，其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：復(fù)方兒茶止瀉霜對(duì)番瀉葉致瀉大鼠結(jié)腸AQP-3蛋白的表達(dá)有上調(diào)作用，且呈一定劑量的依賴(lài)性。

復(fù)方兒茶止瀉霜；結(jié)腸；水通道蛋白3；腹瀉

[First-author’s address] Department of Biochemistry, Medical College of Dalian University, Dalian 116622, China.

復(fù)方兒茶止瀉霜(compound catechu antidiarrhea ointment)是近年來(lái)中醫(yī)治療腹瀉研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)藥物之一，其治療腹瀉的藥效學(xué)研究取得了一定的進(jìn)展，但分子作用機(jī)制尚不明確[1-2]。目前發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物體內(nèi)有13種水通道蛋白(AQPs)，其中水通道蛋白3(aquaporin 3，AQP-3)在結(jié)腸、直腸中廣泛分布，且與腹瀉發(fā)病的水代謝紊亂密切相關(guān)[3]。本實(shí)驗(yàn)研究采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR)和蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)觀察了復(fù)方兒茶止瀉霜對(duì)番瀉葉(Folium sennae)致瀉大鼠結(jié)腸AQP-3蛋白表達(dá)的影響，為復(fù)方兒茶止瀉霜進(jìn)一步應(yīng)用于臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SD雄性大鼠50只，10周齡，體重(220±10)g，由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[合格證號(hào)：SCXK (遼)2008-0002]。

復(fù)方兒茶止瀉霜(批號(hào)：20111001)，高劑量含生藥量0.58 ggg-1基質(zhì)；低劑量含生藥量0.34 ggg-1基質(zhì)，由大連大學(xué)中醫(yī)藥研究所提供；鹽酸小檗堿片(批號(hào)：110631)，東北制藥總廠生產(chǎn)；免抗AQP-3多克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz Technology公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體購(gòu)自北京中杉金橋公司；RIPA蛋白裂解液、Bradford定量及ECL發(fā)光試劑盒購(gòu)自碧云天生物公司；Trizol及反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自大連寶生物公司。

1.2 動(dòng)物分組及模型建立

將SD大鼠50只分為陰性對(duì)照組、空白組、陽(yáng)性對(duì)照組、高劑量組和低劑量組5個(gè)組，每組10只。模型建立主要步驟為：①陽(yáng)性對(duì)照組灌胃15 mg/ml小檗堿藥液；②高劑量組和低劑量組連續(xù)3 d分別于早晚涂抹3 g高、低劑量樣品；③實(shí)驗(yàn)第10 d時(shí)除空白對(duì)照組外其他各組灌服番瀉葉提取液20 ml/kg(1次/d)，觀察記錄大鼠糞便印跡及腹瀉次數(shù)，直到建模成功[4]。

1.3 RT-PCR檢測(cè)目的蛋白

(1)大鼠總RNA的提取及保存。提取各組大鼠結(jié)腸(距肛門(mén)約11～13 cm處)組織塊約100 mg，加入Trizol試劑1 ml(Trizol試劑與結(jié)腸組織體積比約為10∶1)，勻漿5 min，加入0.2 ml氯仿，混勻靜置后于4 ℃以12000 r/min離心15 min；取上清液加入等體積異丙醇，混勻后室溫靜置10 min，于4 ℃以12000 r/min離心10 min；棄上清，加入75%乙醇1 ml，于4 ℃以12000 r/min離心5 min；棄上清，漂洗2次沉淀。干燥5 min，加入DEPC處理水50 μl，55 ℃溫育10 min，溶解后-80 ℃凍存。取3 μl RNA稀釋后分光光度計(jì)260 nm處讀取數(shù)值且A260/A280=1.8～2.2間可用，總RNA濃度=A260×4(μg/μl)，用前調(diào)整至1 μg/μl。

(2)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。提取大鼠總RNA 2 μg，隨機(jī)引物0.5 μg，70 ℃溫育5 min后放置冰上，加入RT反應(yīng)體系(含逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液、dNTPs、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶)，混勻后短暫離心，加入PCR儀，反應(yīng)條件為42℃ 30 min，99 ℃ 5 min，5 ℃ 5 min。

(3)PCR反應(yīng)。選用GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參照引物基因，反應(yīng)中所用上游引物為5’-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3’，下游引物為5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物為308 bp。AQP-3上游引物為5’-CCTCTGGACACTTGGATATGG-3’，下游引物為5’-CAGCTTCACATTCTCTGCCTC-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物為398 bp。AQP-3反應(yīng)條件為94 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共30個(gè)循環(huán)；GAPDH反應(yīng)條件為94℃ 20 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共30個(gè)循環(huán)。取每組PCR擴(kuò)增產(chǎn)物各10 μl，置1%瓊脂糖凝膠(含1 μg/ ml DNA green)于TBE電泳緩沖液中(電壓電泳4 V/ cm)60 min，采用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行灰度掃描定量，AQP-3基因與GAPDH比值表示AQP-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.4 Western blot檢測(cè)目的蛋白

(1)組織取材與樣品制備。將200 mg組織塊剪碎，置于5 ml離心管中加1 ml裂解液。使用微型勻漿器進(jìn)行勻漿，勻漿后置于冰上1 h后10000 g，4 ℃離心10 min。取上清液至1.5 ml管，12000g，4 ℃ 10 min，再次取上清液至新1.5 ml管，-80 ℃儲(chǔ)存。

(2)組織蛋白含量的測(cè)定。①?gòu)?20 ℃取出1 mg/ ml BSA，室溫融化備用；②取7個(gè)5 ml離心管，分別加入1 mg/mlBSA于0、10 μl、20 μl、40 μl、60 μl、80 μl、100 μl管中，用蒸餾水補(bǔ)足各管至100 μl；③各組樣品取5 μl，加蒸餾水95 μl混勻；④各管加考馬斯亮藍(lán)G-250溶液2 ml混勻，室溫靜止2 min。⑤酶標(biāo)儀比色分析，測(cè)定490 nm的光吸收值，測(cè)定時(shí)濃度由低到高；⑥于Excel根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)得出的公式計(jì)算樣本濃度。

(3)Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)。加入預(yù)處理樣品100 μg進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜，將5%的小牛血清封閉2 h，一抗孵育4 ℃12～16 h，TBST洗滌3次；二抗室溫孵育2 h，TBST洗滌4次后ECL顯色。經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)掃描生成圖像并采用Quantity One軟件對(duì)其進(jìn)行灰度分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SSPS 13.0軟件進(jìn)行方差分析和LSD檢驗(yàn)，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR檢測(cè)各組動(dòng)物結(jié)腸AQP-3表達(dá)水平變化

RT-PCR結(jié)果顯示，高、低劑量組中結(jié)腸AQP-3 mRNA表達(dá)水平與陰性對(duì)照組、空白組比較均增多，高劑量組較陰性對(duì)照組增加顯著，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=48.687，P＜0.05)；高劑量組(0.79±0.13)與陽(yáng)性對(duì)照組(0.83±0.17)相比較無(wú)顯著差異(見(jiàn)表1)。

表1 AQP-3在mRNA及蛋白表達(dá)水平比較(ean±SD)

2.2 Western blot檢測(cè)各組動(dòng)物結(jié)腸AQP-3表達(dá)水平變化

Western blot結(jié)果與RT-PCR一致，顯示高、低劑量組中結(jié)腸AQP-3 mRNA表達(dá)水平與陰性對(duì)照組、空白組比較均增多，高劑量組較陰性對(duì)照組AQP-3表達(dá)量顯著增加，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=34.254，P＜0.05)；高劑量組(0.58±0.09)與陽(yáng)性對(duì)照組(0.55±0.12)相比較無(wú)顯著差異(見(jiàn)表1)。

3 討論

腹瀉是臨床消化系統(tǒng)多發(fā)病之一，分急性和慢性?xún)深?lèi)。急性腹瀉病因復(fù)雜，發(fā)病較急，病情進(jìn)展迅速，屬于中醫(yī)學(xué)“泄瀉”之“暴瀉”范疇，早期合理用藥非常重要。目前，臨床多采用中西醫(yī)結(jié)合治療方法，其療效較好，而復(fù)方兒茶止瀉霜因其使用方便，適用人群廣泛。

復(fù)方兒茶止瀉霜是復(fù)方中藥制劑，主要由兒茶、黃柏、五倍子和木香組成，其通過(guò)體外透皮吸收后作用于胃腸道，發(fā)揮清熱燥濕、澀腸止瀉的功效，在急慢性腹瀉中發(fā)揮抗炎止瀉及增強(qiáng)免疫力作用[5-6]。本實(shí)驗(yàn)前期研究顯示，復(fù)方兒茶止瀉霜?jiǎng)┛梢匝娱L(zhǎng)腸內(nèi)容物停留的時(shí)間，促進(jìn)水的吸收，減少糞便水含量[3]。然而，通過(guò)調(diào)節(jié)水通道蛋白而發(fā)揮止瀉作用的機(jī)制尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

AQP-3是消化道主要分布的水通道蛋白，在胃體、小腸及結(jié)腸等均有顯著的表達(dá)[7]。在結(jié)腸主要分布于基底膜表面內(nèi)皮細(xì)胞，對(duì)維持水代謝平衡有調(diào)節(jié)作用。大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)，AQP-3高表達(dá)可引起結(jié)腸黏膜對(duì)水重吸收增加而導(dǎo)致便秘，AQP-3的低表達(dá)可引起結(jié)腸黏膜對(duì)水重吸收減少而導(dǎo)致腹瀉或便溏[8]。AQP-3在中醫(yī)中藥治療中的作用一直是研究熱點(diǎn)。張曉丹等[9]建立實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型用中藥“平胃散”作用后經(jīng)免疫組化等方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，分布在胃賁門(mén)黏膜的AQP-3減少，與其抑制過(guò)多水轉(zhuǎn)運(yùn)到胃細(xì)胞機(jī)制相關(guān)；分布在小腸中段組織AQP-3的表達(dá)升高，與其促使積聚的水吸收排泄、調(diào)節(jié)腸節(jié)律性運(yùn)動(dòng)恢復(fù)正常以及消化吸收功能恢復(fù)密切相關(guān)。劉慧慧等[10]用慢性應(yīng)激結(jié)合束縛方法建立腹瀉型腸易激綜合征大鼠動(dòng)物模型，進(jìn)行眼針治療后用定量RT-PCR分析、免疫組化等方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸組織中AQP-3的mRNA及蛋白表達(dá)明顯升高。以上研究表明AQP-3與結(jié)腸水代謝紊亂的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，AQP-3有可能會(huì)成為腹瀉治療研究的新靶點(diǎn)[11-12]。

本實(shí)驗(yàn)研究采用灌服20%番瀉葉提取液方法建立大鼠腹瀉模型，是研究急性腹瀉發(fā)病機(jī)制及藥物治療的良好模型[13]。本實(shí)驗(yàn)中RT-PCR和Western blot結(jié)果均表明，陰性對(duì)照組即腹瀉模型組其AQP-3表達(dá)水平比空白組及復(fù)方兒茶止瀉霜高低劑量組均顯著減少，與Ikarashi等[14]報(bào)道一致。而用復(fù)方兒茶止瀉霜干預(yù)發(fā)現(xiàn)其高、低劑量組AQP-3蛋白表達(dá)水平比空白組及陰性對(duì)照組均顯著增多。結(jié)果提示，復(fù)方兒茶止瀉霜可上調(diào)AQP-3蛋白的表達(dá)，是其發(fā)揮止瀉作用的重要機(jī)制之一。但是復(fù)方兒茶止瀉霜對(duì)其上調(diào)的具體機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步研究[15]。

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Effect on compound catechu anti-diarrhea ointment on the expression of AQP-3 proteinin colon of diarrhea rats

/DING Ning, KANG Le, GAO Ming, et al// China MedicalEquipment,2014,11(8):1-3.

Objective: To investigate the effect of Compound Catechu Anti-diarrhea Ointment on the expression of aquaporin 3(AQP-3)of colonic mucosa of diarrhea rats. Methods: Fifty SD rats were divided into 5 groups, per group for 10 rats, including diarrhea model(DM)group, low dose-(L), and high dose-(H)Water extraction solution of Compound Catechu groups, positive control drug(PC)group, and normal control(NC) group. The expression of AQP-3 protein of colonic mucosa in different groups was determined by RT-PCR and Western blot methods. Results: Western blot and RT-PCR results showed that the expressions of AQP-3 in the colon region of high/low dose group were increased significantly than DM and NC group, AQP-3 of H group were obviously increased than L group(F=48.687, P＜0.05), but similar with the expressions of AQP-3 in the colon region of PC group. Conclusion: Compound Catechu Anti-diarrhea Ointment can increase the expression level of AQP-3 protein in the colon region in diarrhea rats and play a important role in the drug therapy.

Compound catechu anti-diarrhea ointment; Colon; Aquaporin 3; Diarrhea

1672-8270(2014)08-0001-03

R963

A

10.3969/J.ISSN.1672-8270.2014.08.001

2014-03-26

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81073011)“復(fù)方兒茶止瀉霜抗腹瀉藥效關(guān)系及作用機(jī)制的研究”

①大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)中心 遼寧 大連 116622

②大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室 遼寧 大連 116622

*通訊作者：dingning@dlu.edu.cn

丁寧，女，(1977- )，碩士，實(shí)驗(yàn)師。大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)中心，從事腫瘤分子生物學(xué)及臨床生化檢測(cè)相關(guān)研究。