張 娜，郭慶啟，黃文秀，趙新淮*

（1.哈爾濱商業(yè)大學 黑龍江省食品科學與工程重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150076；2.東北林業(yè)大學林學院，黑龍江 哈爾濱 150040；3.東北農(nóng)業(yè)大學 教育部乳品科學重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030）

微膠囊化蛋白酶在干酪制備中的應(yīng)用及干酪成熟過程中電泳分析

張 娜1，郭慶啟2，黃文秀1，趙新淮3,*

（1.哈爾濱商業(yè)大學 黑龍江省食品科學與工程重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150076；2.東北林業(yè)大學林學院，黑龍江 哈爾濱 150040；3.東北農(nóng)業(yè)大學 教育部乳品科學重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030）

將采用冷凍干燥工藝得到的明膠-阿拉伯膠-凝乳酶微膠囊用于干酪制備過程中，在排乳清之后向干酪中添加5.00 g微膠囊化蛋白酶，以促進干酪的成熟。在干酪成熟過程中通過三羥甲基氨基甘氨酸-尿素-十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳以及毛細管電泳分析監(jiān)測干酪中pH 4.6不溶性氮部分的變化情況。結(jié)果表明：干酪在成熟初期，αs1-酪蛋白較β-酪蛋白先水解，生成αs1-酪蛋白（f 102～199）和αs1-I-酪蛋白；干酪成熟21 d時，β-酪蛋白開始水解，αs1-酪蛋白繼續(xù)保持水解，生成的大的水解產(chǎn)物同時也發(fā)生二次水解；干酪成熟90 d時干酪中β-酪蛋白比αs1-酪蛋白具有更廣泛的水解程度，酪蛋白降解的同時，生成大量新的小分子肽。

干酪；蛋白酶微膠囊；電泳分析；酪蛋白水解；小分子肽

干酪成熟時間較長，導致生產(chǎn)成本增加，因此干酪的促熟受到人們普遍關(guān)注。干酪促熟常用的方法有酶法、修飾發(fā)酵劑細胞、懸浮液系統(tǒng)、提高成熟溫度、高壓處理等[1-2]。干酪在成熟過程中經(jīng)歷了一系列復雜的物理和化學變化，而最重要的是蛋白水解，其過程最為復雜，它主要影響干酪質(zhì)構(gòu)，包括硬度、流變性、黏結(jié)性、斷裂性、延展性、熔化性和乳化性，還影響干酪的風味[3-5]。本實驗選用明膠和阿拉伯膠作為復合壁材，凝乳酶為芯材，通過冷凍干燥技術(shù)進行蛋白酶的微膠囊化[6]，采用凝乳酶微膠囊干酪促熟，并且用三羥甲基氨基甘氨酸-尿素-十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（trincine-urea-sodium dodecyl sulfonate-polyacrylamide gelelectrophoresis，Trincine-Urea-SDS-PAGE）和毛細管電泳（capillary electrophoresis，CE）方法，對添加凝乳酶微膠囊的干酪在成熟過程中蛋白質(zhì)的降解產(chǎn)物進行分析，為干酪的生產(chǎn)提供理論參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

凝乳酶（Maxiren-180，1∶10 000，食品級） 荷蘭代夫特DSM公司；骨明膠 天津奧凱化工貿(mào)易有限公司；阿拉伯膠 德國Willy Benecke公司；低分子質(zhì)量標準蛋白質(zhì)（電泳級） 中國科學院上海生化研究所；冰乙酸 天津凱通化學試劑有限公司；甘油、β-巰基乙醇、溴酚藍 天津市博迪化工有限公司；酪蛋白-C5890、考馬斯亮藍R-250、四甲基乙二胺、十二烷基磺酸鈉、N, N-甲叉雙丙烯酰胺 美國Sigma公司；尿素、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、丙烯酰胺 北京索萊寶科技有限公司。

AL204型電子天平、DELTA 320型精密pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；TU-1900型紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；LGJ-1型冷凍干燥機 上海醫(yī)用分析儀器廠；FW100型高速萬能粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司；DYCZ-28A型電泳槽、DYY-6C型電泳儀 北京市六一儀器廠；UVP/C8484-05G凝膠成像分析系統(tǒng) 美國UVP公司；Foss2400型全自動凱氏定氮儀 瑞典Foss公司。

1.2 方法

1.2.1 凝乳酶微膠囊的制備

以明膠和阿拉伯膠為壁材，采用冷凍干燥工藝制備凝乳酶微膠囊，具體方法見參考文獻[6-7]。

1.2.2 添加凝乳酶微膠囊的干酪的制備工藝

在優(yōu)化后的毛霉干酪生產(chǎn)工藝的基礎(chǔ)上進行改進[8-9]。當采用重力-靜止-加熱方法排乳清后，在每100 g凝乳中添加5 g凝乳酶微膠囊，充分混勻后，將凝乳轉(zhuǎn)移至直徑15 cm、高30 cm的圓形模具中，0.3 MPa條件下壓榨2 h，每隔30 min將干酪翻轉(zhuǎn)，繼續(xù)壓榨。壓榨后的凝乳切割成3 cm×1.5 cm×1.5 cm的立方體，然后將干酪樣品轉(zhuǎn)移至相對濕度85%～90%、（4±1）℃的干酪成熟室進行成熟。

1.2.3 干酪中蛋白質(zhì)的降解

1.2.3.1 樣品預(yù)處理

在干酪成熟1、7、14、21、28、35、60 d和90 d時，從干酪中心區(qū)域和干酪表面區(qū)域采樣[10]。

pH 4.6-可溶性氮（pH 4.6-soluble nitrogen，pH 4.6-SN）部分和pH 4.6-不溶性氮（pH 4.6-insoluble nitrogen，pH 4.6-ISN）部分，根據(jù)Kuchroo[11]、Piraino[12]等所描述的方法提取。

1.2.3.2 化學分析

pH 4.6-SN部分采用凱氏定氮法進行測定[13]，并以其占干酪總含氮量的質(zhì)量百分數(shù)來表示（pH 4.6-SN/TN）。

1.2.3.3 電泳分析

0.2 g pH 4.6-ISN與0.2 mL Tris緩沖溶液（0.06 mol/L，pH 6.8）混合，其中含β-巰基乙醇（體積分數(shù)5%）、甘油（25 g/100 mL）、SDS（2 g/100 mL）、溴甲酚藍（0.1 g/100 mL），沸水中加熱5 min后用于Tricine-Urea-SDS-PAGE分析。標準酪蛋白用6.6 mol/L尿素溶解后，取0.2 mL按照干酪pH4.6-ISN樣品的操作方法進行標準酪蛋白的電泳上樣液的前處理。

Tricine-Urea-SDS-PAGE分析方法：采用三層不連續(xù)膠的結(jié)構(gòu)，由分離膠＋夾層膠＋濃縮膠構(gòu)成，各層膠由不同分子組成的丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺混合液聚合而成。49.5 g/100 mL丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺的總質(zhì)量濃度（T）-3.0%的交聯(lián)百分濃度（C）：丙烯酰胺48.0 g，甲叉雙丙烯酰胺1.5 g，用蒸餾水定容至100 mL。49.5% T-6.0% C：丙烯酰胺46.5 g，甲叉雙丙烯酰胺3.0 g，用蒸餾水定容至100 mL。凝膠緩沖溶液：Tris 36.4 g，用蒸餾水溶解后用HCl調(diào)pH值至8.45，再用蒸餾水定容至100 mL。陽極緩沖溶液：Tris 12.11 g，用蒸餾水溶解后用HCl調(diào)pH值至8.90，再用蒸餾水定容至500 mL。陰極緩沖溶液：Tris 12.11 g，Tricine 17.92 g，SDS 1.00 g，用蒸餾水定容至1000 mL。凝膠的配制方法如表1所示。

表1 分離膠、夾層膠和濃縮膠的組成Table 1 Composition of separating, spacer and stackinggels

3種膠的制膠體積比為4∶1.5∶1。電泳時，先將電壓調(diào)至80 V，待指示前沿到達分離膠時，把電壓調(diào)制120 V，至電泳結(jié)束。電泳結(jié)束后膠片固定2 h（固定液包含0.5%戊二醛，30%乙醇），染色12 h（染色液含有0.2 g/100 mL考馬斯亮藍R-250，50%甲醇，10%乙醇）。染色結(jié)束用脫色液（包含45%甲醇，10%冰乙酸）對膠片進行洗脫，直到蛋白質(zhì)條帶清晰為止。采用凝膠成像系統(tǒng)軟件Labwork 4.5軟件進行處理并分析。

CE分析條件：流動緩沖液（50 mmol/L）包含14.7 mol/L H3PO4、6 mol/L尿素溶液和0.05 g/100 mL羥丙基甲基纖維素，調(diào)整pH值至2.5。上樣緩沖液（pH 8.0）包含10 mmol/L H3PO4，8 mol/L尿素溶液和10 mmol/L二硫蘇糖醇。兩種緩沖溶液使用前用0.22 ?m微孔膜過濾，所有分析用溶液均用去離子水配制。

不同成熟時間的干酪pH 4.6-ISN部分溶解于上樣緩沖液中，終質(zhì)量濃度達到10 mg/mL，室溫下放置1 h后用0.22 ?m微孔膜過濾。用未涂層的熔融石英柱（60 cm×50 ?m，檢測窗口為長50 cm的石英柱），樣品在陽離子液中進行分離。樣品注入壓力0.5 psi，進樣時間5 s，分離電壓18.5 kV，分離溫度30 ℃，采用紫外檢測器在214 nm波長處進行檢測，數(shù)據(jù)收集頻率5 Hz。每次進樣前，將毛細管用0.1 mol/L NaOH、去離子水、0.1 mol/L HCl和流動緩沖溶液分別清洗3、5、3、5 min。用32-Karat軟件進行毛細管電泳圖的自動記錄和數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Tricine-Urea-SDS-PAGE分析結(jié)果

小分子的肽很難通過SDS-PAGE區(qū)分，需要借助Tricine-Urea-SDS-PAGE分析技術(shù)。Tricine-Urea-SDSPAGE能夠顯示酪蛋白水解的程度，根據(jù)蛋白質(zhì)亞基和肽片段分子質(zhì)量大小的不同將其分成不同的條帶，條帶顏色的深淺反映出蛋白質(zhì)和肽類含量的多少，并能具體確定酪蛋白降解產(chǎn)物，尤其能夠顯示出小分子肽的生成情況。Tricine-Urea-SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖1所示。參照已發(fā)表研究結(jié)果[14-21]，成熟1 d的干酪中主要含有的是αs1-酪蛋白（αs1-casein，αs1-CN）、αs2-酪蛋白（αs2-CN）和β-酪蛋白（β-CN），其中αs1-CN和αs2-CN的含量明顯多于β-酪蛋白。成熟過程中，αs1-CN、αs2-CN和β-CN的條帶顏色均減弱，成熟7 d時αs1-CN和β-CN顏色條帶變化不明顯，αs1-CN水解產(chǎn)物αs1-CN（f 102～199）和αs1-I-酪蛋白（αs1-ICN）出現(xiàn)，但不明顯。在成熟7～14 d時，αs1-CN顏色條帶減弱，同時發(fā)現(xiàn)αs1-CN（f 102～199）和αs1-I-CN所對應(yīng)的兩條帶顏色顯著加深（泳道3），而此過程中β-CN條帶顏色變化不明顯，說明αs1-CN較β-CN先水解。

由圖1可知，21 d時，β-CN條帶顏色比成熟14 d時要減弱，此時αs1-CN條帶顏色繼續(xù)保持減少趨勢，但是αs1-CN（f102～199）和αs1-I-CN的增長并不明顯，說明此過程中β-CN開始被水解，αs1-CN繼續(xù)保持水解，生成的大的水解產(chǎn)物同時也發(fā)生二次水解，生成分子質(zhì)量更小的肽類，條帶下移，在電泳圖中體現(xiàn)為副-κ-酪蛋白（副-κ-CN）以下形成分子質(zhì)量更小的條帶（泳道4）。這種變化一直持續(xù)到成熟90 d。90 d時，αs1-CN和β-CN條帶顏色同成熟1 d相比顏色極淺，同時在副-κ-CN以下形成的條帶顏色更深（泳道7）。αs1-CN和β-CN的變化同樣說明添加蛋白酶微膠囊的干酪發(fā)生蛋白質(zhì)的降解，生成新的中分子質(zhì)量肽及小分子質(zhì)量肽。

圖1 添加蛋白酶微膠囊的干酪pH 4.6-ISN部分的Tricine-Urea-SDSPAGGEE 電泳圖Fig.1 Tricine-Urea-SDS-PAGE profiles of pH4.6-ISN fraction separated from cheese prepared with rennet microcapsules

2.2 CE分析結(jié)果

圖2 添加蛋白酶微膠囊的干酪pH 4.6-ISN部分的CE結(jié)果Fig.2 CE profile of pH 4.6-ISN fraction separated from cheese prepared with rennet microcapsules

CE分析印證添加蛋白酶微膠囊的干酪中酪蛋白的水解情況，結(jié)果如圖2所示。參照已發(fā)表研究結(jié)果[22-26],對標準酪蛋白CE分析的譜圖（圖2E）結(jié)果進行命名。1號峰為αs1-CN，遷移時間為18.56 min；2號峰為αs0-CN，遷移時間為20.96 min；3、4號峰均為副-κ-CN，遷移時間為23.35～24.84 min；5號峰為β-CN-A1，遷移時間為26.52 min；6號峰β-CN-A2，遷移時間為28.74 min。添加蛋白酶微膠囊的干酪，在成熟1 d時，毛細管區(qū)帶電泳譜圖同標準酪蛋白（圖2A）類似，在遷移時間15～30 min內(nèi)存在5個主要組分，分別為αs1-CN、αs0-CN、副-κ-CN、β-CN-A1、β-CN-A2；除此之外，在遷移時間為51.8 min處也出現(xiàn)一個優(yōu)勢峰，這個峰可能是由于明膠的存在形成的。隨著干酪的成熟，整個CE圖中各峰的分布發(fā)生改變。成熟28 d時，CE譜圖中除原有的蛋白峰外，出現(xiàn)更多的的肽類峰圖譜，而其中αs1-CN、αs0-CN、副-κ-CN以及β-CN-A2的峰面積明顯降低，而β-CN-A1減少幅度最小。遷移時間為51.8 min處的明膠所對應(yīng)的峰面積也顯著減少。說明芯材釋放后作用干酪中的蛋白質(zhì)的同時也水解明膠，再次證明本課題組之前的假設(shè)，即蛋白酶微膠囊的芯材釋放機制之一可能是通過水解來實現(xiàn)。

蛋白酶微膠囊在干酪中的緩釋效果及對酪蛋白的作用顯著。這是由于明膠的溶解性與其自身濃度和環(huán)境溫度關(guān)系密切，在低溫、低水分含量的環(huán)境下，明膠的溶解性能極差。將蛋白酶微膠囊加入到室溫下的干酪半成品中后，明膠緩慢地吸水溶脹，不會造成蛋白酶的大量流失。作為典型的“高濃度低黏性”膠體，阿拉伯膠卻同時具有高微膠囊化產(chǎn)率、高微膠囊化效率、高水溶性的特點，能很容易地溶于冷、熱水中而不結(jié)團，配制成50%的水溶液后不結(jié)團，具有較好的流動性。當把蛋白酶微膠囊產(chǎn)品在壓榨前加入到干酪凝乳中，微膠囊表面的阿拉伯膠能夠迅速分散，吸收凝乳中的少量乳清，增加乳清的黏度，阻礙乳清的流動，并以水化的形式保持水分，為明膠溶脹提供充足的水分，使干酪中的微膠囊化蛋白酶能夠更快的作用于明膠，并從中釋放出來。

3 結(jié) 論

本實驗通過Trincine-Urea-SDS-PAGE以及CE方法對干酪成熟過程中蛋白質(zhì)降解分析，結(jié)果表明在酪蛋白成熟初期αs1-CN較β-CN先水解，生成αs1-CN（f102～199）和αs1-I-CN；干酪成熟21 d時，β-CN開始水解，αs1-CN繼續(xù)保持水解，生成的大的水解產(chǎn)物同時也發(fā)生二次水解，生成分子質(zhì)量更小的肽類；干酪成熟90 d時酪蛋白降解，生成大量新的小分子肽。芯材釋放后作用干酪中的蛋白質(zhì)的同時也對明膠產(chǎn)生水解作用，因此，推測蛋白酶微膠囊的芯材釋放機制之一是水解。

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Application of Rennet Microcapsule in the Preparation of Cheese and Electrophoretic Analysis of Cheese Ripening

ZHANG Na1, GUO Qing-qi2, HUANG Wen-xiu1, ZHAO Xin-huai3,*
(1. Key Laboratory of Food Science and Engineering of Heilongjiang Province, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China; 2. School of Forestry, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China; 3. Key Laboratory of Dairy Science, Ministry of Education, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

The application of freeze-dried rennet microcapsule entrapped in gelatin blended with arabic gumfor cheese production was studied. Approximately 5.00 g of rennet microcapsules were added to cheese after discharging whey to promote the maturity of cheese. Trincine-Urea-SDS-PAGE and capillary electrophoresis (CE) were employed to analyze pH 4.6-insoluble nitrogen (pH4.6-ISN) fractions, and the results showed that caseins in cheese were degraded during the early stage of ripening, αs1-casein was degraded earlier than β-casein, and αs1-casein (f102–199) and αs1-I casein were produced; while at 21 d of ripening, β-casein was degraded and αs1-casein was still degraded, and the resultant hydrolysate with high molecular weight was and further degraded; while at 90 d, β-casein was degraded more extensively than αs1-casein. The proteolysis of caseins and some peptides with low molecular weight were generated at the same time. The release mechanism of chymosin from the freeze-dried microcapsule may be the hydrolysis of gelatin. The released core material acts on cheese and gelatin at the same time.

cheese; rennet microcapsules; electrophoretic analysis; casein degradation; low molecular weight peptide

TS201.1；TS252.53

A

1002-6630（2014）05-0134-05

10.7506/spkx1002-6630-201405027

2013-04-09

國家自然科學基金青年基金項目（31301602）；黑龍江省應(yīng)用技術(shù)研究與開發(fā)計劃項目（GC13B215）；

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（863計劃）項目（2006AA10Z324）；黑龍江省高校科技創(chuàng)新團隊建設(shè)計劃項目（2010td11）

張娜（1979—），女，副教授，博士，研究方向為食品化學和食品安全。E-mail：foodzhangna@163.com

*通信作者：趙新淮（1963—），男，教授，博士，研究方向為食品化學和食品安全。E-mail：zhaoxh@mail.neau.edu.cn