張 虹，都立輝，施榮華，劉 琴*

（南京財經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇省糧油品質(zhì)控制及深加工技術(shù)重點實驗室，江蘇 南京 210023）

植物乳桿菌NP_785232蛋白N端兩個特定結(jié)構(gòu)域在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)

張 虹，都立輝，施榮華，劉 琴*

（南京財經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇省糧油品質(zhì)控制及深加工技術(shù)重點實驗室，江蘇 南京 210023）

以植物乳桿菌KLDS1.0320的候選表面黏附蛋白NP_785232為研究對象，采用外源重組表達(dá)的方法大量制備其前兩個結(jié)構(gòu)域。應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法克隆NP_785232蛋白N端的前兩個結(jié)構(gòu)域，將克隆獲得的片段連入表達(dá)載體pET30a中構(gòu)建重組質(zhì)粒pET30a/N2，該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，用終濃度為1 mmol/L的異丙基硫代半乳糖苷誘導(dǎo)重組菌，重組蛋白經(jīng)HisTrap柱純化后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，對電泳獲得的目的大小的片段進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。結(jié)果表明：獲得的重組蛋白與NP_785232蛋白N端的前兩個結(jié)構(gòu)域完全相同。通過大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)可以有效表達(dá)植物乳桿菌KLDS1.0320的候選表面黏附蛋白NP_785232 N端的前兩個結(jié)構(gòu)域。

植物乳桿菌；NP_785232蛋白；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；誘導(dǎo)表達(dá)；純化

乳酸菌能調(diào)節(jié)和維持人類及動物胃腸道微生態(tài)系統(tǒng)的平衡，并能通過直接或誘導(dǎo)性的在腸道內(nèi)合成某些小分子活性物質(zhì)來刺激和增強(qiáng)機(jī)體的免疫系統(tǒng)和抵抗力[1-2]，從而改善機(jī)體的腸道健康狀況。乳酸菌的益生功能已被廣泛認(rèn)可，現(xiàn)已作為重要的食品級益生菌廣泛應(yīng)用于食品、飼料、保健和醫(yī)藥等行業(yè)中[3]。乳酸桿菌在腸道內(nèi)的黏附和定殖是其發(fā)揮益生功能的前提和基礎(chǔ)，而黏附被認(rèn)為是定殖的前提條件[4]。乳酸桿菌的黏附具有特異性[5]，它可通過菌體細(xì)胞表面的黏附素與腸道細(xì)胞表面的受體特異性結(jié)合，這些表面黏附素包括細(xì)菌表面蛋白、細(xì)胞壁毛緣、脂磷壁酸和多糖等，其中文獻(xiàn)報道的與黏附有關(guān)的乳酸菌表面蛋白有S-層蛋白、引物酶Sortase依賴蛋白和黏膜結(jié)合蛋白[6]等。近年來，不少研究者認(rèn)為乳酸桿菌和某些病原菌能識別相同的宿主受體，兩者對受體形成競爭性黏附[7]。有研究報道，卷曲乳酸桿菌ZJ001的菌體表層提取物S-層蛋白能明顯地抑制出血性大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌對人宮頸癌細(xì)胞的黏附[8]。乳酸菌具有的腸道黏附和定殖能力為其益生功能的發(fā)揮提供了先決條件。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多能夠促進(jìn)黏附的乳酸菌分子[9]，但在與乳酸菌相互作用的宿主分子方面，相關(guān)報道很少。乳酸菌調(diào)節(jié)宿主免疫能力的發(fā)現(xiàn)，促使研究者將目光投向了這一領(lǐng)域，漸漸有宿主互作分子方面的報道出現(xiàn)[10]。

將目的蛋白外源表達(dá)進(jìn)行研究是蛋白質(zhì)功能研究的重要方法之一。大腸桿菌系統(tǒng)是目前應(yīng)用最廣泛的蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)[11-12]。楊桂連等[13]使用thyA基因缺陷型E. coli X13成功表達(dá)了乳酸菌胞外蛋白水解酶基因。古英洪等[14]使用E. coli Rosetta-gami（DE3）pLysS成功表達(dá)了桃的多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因。黃茜等[15]通過對含有IF2、SUMO、GST、NusA和麥芽糖結(jié)合蛋白（maltose binding protein，MBP）融合標(biāo)簽的表達(dá)載體進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)膽鹽水解酶（bile salt hydrolase，BSH）蛋白只有與融合標(biāo)簽MBP連接才能獲得大量表達(dá)。

根據(jù)已公布的基因組注釋信息發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌KLDS 1.0320能編碼一種由6個結(jié)構(gòu)域組成的NP_785232蛋白，初步推斷該蛋白可能對其在動物腸道中的黏附具有一定作用。該蛋白由2 219個氨基酸組成，想要完整表達(dá)整個蛋白很難實現(xiàn)，進(jìn)一步的多序列比對研究表明：該蛋白6個結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列同源性很高，且同源性較高區(qū)域的氨基酸排列順序也基本相同，這些蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的相似性暗示了其各個結(jié)構(gòu)域可能具有相似的功能。因此，本實驗從植物乳桿菌KLDS 1.0320中克隆出NP_785232蛋白N端的前兩個結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)的基因（N2蛋白基因），構(gòu)建該基因的原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET30a/N2。將這兩個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的重組蛋白在大腸桿菌中大量表達(dá)，并利用HisTrap HP柱分離純化His-N2重組蛋白。

1 材料與方法

1.1 菌株和載體

植物乳桿菌KLDS 1.0320、Escherichia coli DH5α、表達(dá)菌株Escherichia coli Rosetta（DE3）和表達(dá)質(zhì)粒pET30a均由本實驗室保存；重組表達(dá)質(zhì)粒pET30a/N2由本實驗構(gòu)建。

1.2 試劑

限制性內(nèi)切酶Nco I和Xho I、HSTMMix、T4 DNA連接酶和250 bp DNA Marker、凝膠純化回收試劑盒 日本TaKaRa公司；AxyPrep質(zhì)粒DNA小量試劑盒 愛思進(jìn)生物技術(shù)有限公司；多功能DNA純化回收試劑盒 北京百泰克生物技術(shù)有限公司；卡那霉素 美國Amresco公司；異丙基硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG） 加拿大Bio Basic公司；寬范圍彩色預(yù)染蛋白質(zhì)Marker 天根生化科技（北京）有限公司；HisTrap HP柱 美國GE公司；其他試劑均為分析純。

1.3 儀器與設(shè)備

THZ-D型恒溫振蕩器 江蘇太倉市強(qiáng)樂實驗設(shè)備有限公司；無菌工作臺 上海三發(fā)科技有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；高速臺式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；J-26XP落地式高速冷凍離心機(jī) 美國Beckman Coulter公司；LDZX-50FB立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；U-3900紫外-可見分光光度計 日本Hitachi公司；梯度PCR自動系列化分析儀東盛國際貿(mào)易有限公司；DYY-6C型電泳儀 北京六一儀器廠；JS-6800全自動凝膠成像分析儀 上海培清科技有限公司；JY92-Ⅱ超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新藝超聲設(shè)備有限公司；AKTA蛋白純化系統(tǒng) 美國GE公司。

1.4 方法

1.4.1 N2蛋白基因大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建

1.4.1.1 N2蛋白基因的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增

根據(jù)NP_785232蛋白的基因序列設(shè)計引物，P1：ACACCATGGAAACGGCGATCGTAACGTATT；P2：CACCTCGAGTTATTACTGATAATAAACTTGTACAT CTGG，該引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以植物乳桿菌KLDS 1.0320基因組為模板，對NP_785232蛋白N端兩個特定結(jié)構(gòu)域基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系如下：HSTMMix 25 μL，上、下游引物各1 μL（終濃度1 μmol/L），植物乳桿菌KLDS 1.0320基因組5 ng，加雙蒸水至50 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性50 s、58 ℃退火30 s、72 ℃延伸2 min，共30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL PCR反應(yīng)液進(jìn)行1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并對N2蛋白基因的PCR反應(yīng)液進(jìn)行切膠回收。

1.4.1.2 N2蛋白基因與表達(dá)載體pET30a的連接

將攜帶有表達(dá)載體pET30a的E. coli菌株接種于Luria-Bertani（LB）液體培養(yǎng)基（含終質(zhì)量濃度為50 μg/mL的卡那霉素）中，37 ℃培養(yǎng)過夜，然后提取質(zhì)粒，以Nco Ⅰ、XhoⅠ雙酶酶切，切膠回收得到N2蛋白基因PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體pET30a。用多功能DNA純化回收試劑盒對雙酶切反應(yīng)液分別進(jìn)行純化，按照表達(dá)載體和N2蛋白基因片段的物質(zhì)的量比1∶3～1∶10的比例，用T4 DNA連接酶16 ℃過夜進(jìn)行連接反應(yīng)。

將上述連接液轉(zhuǎn)化至自制的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，在LB固體培養(yǎng)基（含終質(zhì)量濃度為50 μg/mL的卡那霉素）上培養(yǎng)以篩選陽性重組體，同時以菌落為模板通過PCR擴(kuò)增N2蛋白基因進(jìn)行鑒定。從菌落PCR鑒定陽性的重組子中提取重組質(zhì)粒，使用限制性內(nèi)切酶Nco I和Xho I進(jìn)行雙酶切鑒定，將鑒定正確的重組質(zhì)粒送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序驗證。將驗證正確的重組質(zhì)粒pET30a/N2轉(zhuǎn)化至E.coli Rosetta（DE3）表達(dá)菌株中。

1.4.2 N2蛋白基因在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)

1.4.2.1 IPTG誘導(dǎo)N2蛋白基因表達(dá)

將篩選獲得的含有pET30a/N2重組質(zhì)粒的E.coli Rosetta（DE3）菌株單菌落接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基（含終質(zhì)量濃度50 μg/mL的卡那霉素）中，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。吸取3 mL活化過夜的菌液體積分?jǐn)?shù)1%接種于300 mL LB液體培養(yǎng)基（含終質(zhì)量濃度50 μg/mL的卡那霉素）中，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)，直至OD600nm值在0.6～0.8。向培養(yǎng)液中加入300 μL濃度為1 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，繼續(xù)培養(yǎng)9 h。加入IPTG之前取樣一次，之后每隔1 h取樣一次。同時以同樣的方法誘導(dǎo)含有空載體pET30a的E. coli Rosetta（DE3）作為陰性對照。

1.4.2.2 電泳分析

將轉(zhuǎn)化成功含有重組質(zhì)粒pET30a/N2的E. coli Rosetta（DE3）重組菌用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，取適量菌體破碎液上清進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDSPAGE）電泳以檢測蛋白的表達(dá)情況，具體方法如下：將誘導(dǎo)0～9 h的菌液4 ℃、12 000 r/min離心1 min收集菌體,用生理鹽水洗滌菌體兩次后再用40 μL體積分?jǐn)?shù)40%甘油和10 g/100 mL SDS的上樣緩沖液重懸菌體沉淀，沸水浴中煮沸10 min。冷卻后取15 μL上清液進(jìn)行電泳分析[16]。

1.4.3 His-N2蛋白的分離純化和鑒定

1.4.3.1 樣品的制備

將誘導(dǎo)培養(yǎng)5 h的菌液4 ℃、12 000 r/min離心10 min收集菌體，用生理鹽水清洗菌體3次，用1%初始培養(yǎng)液體積的His TrapTM柱結(jié)合緩沖液懸浮菌體，將菌懸液置于冰水混合物中，超聲波破碎菌體細(xì)胞直至溶液澄清，超聲參數(shù)為：200 W超聲2 s間隙9 s。將破碎后的菌體溶液4 ℃、13 000 r/min離心30 min以除去不溶性物質(zhì)，上清液用0.22 μm的濾膜過濾后上樣于AKTA蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)，使用HisTrap HP親和色譜柱分離融合表達(dá)的His-N2蛋白。

1.4.3.2 His-N2蛋白的親和層析純化

按照His TrapTM柱的使用說明書進(jìn)行操作。

1.4.3.3 His-N2蛋白的鑒定

將純化獲得的His-N2蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后，切取目的大小的膠帶送交蘇州普泰生物技術(shù)有限公司，采用NanoLC-ESI-MS/MS進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 N2蛋白基因的擴(kuò)增與序列測定

圖1 N2蛋白基因的PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.1 Electrophoresis of PCR amplification products of the first two domains of N2 gene

如圖1所示，在1 200 bp附近有一條明亮的PCR擴(kuò)增條帶，同預(yù)期目的片段（1 242 bp）大小相符，表明已擴(kuò)增出N2蛋白基因片段。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)切膠回收、Nco I和Xho I雙酶切、純化等處理后與雙酶切表達(dá)載體pET30a進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化至DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，以篩選的陽性重組體為模板擴(kuò)增N2蛋白基因，電泳結(jié)果與圖1相同，說明重組質(zhì)粒pET30a/N2已成功轉(zhuǎn)化至DH5α大腸桿菌中。小量提取PCR擴(kuò)增鑒定正確的重組體的質(zhì)粒，用Nco I和Xho I進(jìn)行雙酶切鑒定結(jié)果如圖2所示。

圖2 重組質(zhì)粒pET30a/N2的雙酶切鑒定結(jié)果Fig.2 Identification of recombinant plasmid pET30a/N2 by double enzyme digestion

由圖2可知，重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后出現(xiàn)兩條帶，一條帶的大小在4 500 bp以上，為表達(dá)載體的線性條帶，約為5 400 bp；另一條帶為插入的N2蛋白基因片段，大小在1 200 bp左右。由此可以看出，N2蛋白基因已成功連入pET30a表達(dá)載體中。將提取的另一部分重組質(zhì)粒送到生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果表明獲得的N2蛋白基因PCR產(chǎn)物序列與GenBank公布（EU552054.1）的相同，因此成功構(gòu)建了含有NP_785232蛋白N端兩個特定結(jié)構(gòu)域基因的原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET30a/N2。

2.2 N2蛋白基因誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE電泳分析

圖3 His-N2重組蛋白的SDS-PAGE電泳結(jié)果Fig.3 SDS-PAGE analysis of His-N2 protein

重組菌體破碎液上清的電泳結(jié)果如圖3所示，含有重組質(zhì)粒pET30a/N2的E. coli Rosetta（DE3）重組菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，有明顯的N2蛋白質(zhì)條帶出現(xiàn)，而含有空質(zhì)粒pET30a的E. coli Rosetta（DE3）菌株在IPTG誘導(dǎo)過程中始終沒有出現(xiàn)N2蛋白質(zhì)條帶，當(dāng)誘導(dǎo)表達(dá)3、5、6、7 h時，N2蛋白的表達(dá)量較高，從8 h時開始有所下降，綜合工作效率和實驗成本等因素，本實驗選擇誘導(dǎo)表達(dá)5 h以制備足量的His-N2蛋白。

2.3 His-N2融合重組表達(dá)蛋白的分離純化及其鑒定

圖4 純化后得到的蛋白溶液SDS-PAGE電泳結(jié)果Fig.4 SDS-PAGE analysis of the purified protein

HisTrap HP親和色譜柱分離融合表達(dá)的His-N2蛋白時，在用洗脫緩沖液進(jìn)行洗脫時，在280 nm波長處有一個明顯的吸收峰，這說明誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白能通過HisTrap HP柱進(jìn)行親和層析分離。SDS-PAGE電泳分析純化獲得溶液中的蛋白組成結(jié)果如圖4所示。溶液中主要有兩種分子質(zhì)量不同的蛋白，第1條帶為分子質(zhì)量在135 kD左右的雜蛋白，第2條帶為誘導(dǎo)表達(dá)的His-N2蛋白，分子質(zhì)量在63～75 kD。

圖5 His-N2表達(dá)蛋白的nanoLC-ESI-MS/MS鑒定結(jié)果Fig.5 NanoLC-ESI-MS/MS analysis of His-N2 protein

切取目的大小的第2條蛋白條帶送交蘇州普泰生物技術(shù)有限公司進(jìn)行nanoLC-ESI-MS/MS鑒定的部分結(jié)果如圖5所示，經(jīng)數(shù)據(jù)庫搜索比對，證實所測蛋白條帶與NP_785232蛋白的氨基酸序列完全一致。表明NP_785232蛋白N端的前兩個結(jié)構(gòu)域在大腸桿菌中獲得了正確表達(dá)。

3 結(jié) 論

本研究在成功構(gòu)建含有NP_785232蛋白N端兩個特定結(jié)構(gòu)域基因的pET30a/N2重組質(zhì)?；A(chǔ)上，將其轉(zhuǎn)化E.coli Rosetta感受態(tài)細(xì)胞，通過卡那霉素抗性篩選獲得陽性重組菌，實現(xiàn)了His-N2重組蛋白的外源表達(dá)。但用HisTrap HP柱分離His-N2目的蛋白時，SDS-PAGE電泳發(fā)現(xiàn)：純化獲得的蛋白溶液中除含有His-N2目的蛋白外，還含有一種分子質(zhì)量在135 kD左右的雜蛋白。究其原因，可能是His-N2蛋白在純化過程中自發(fā)地形成了二硫鍵。因為超聲過程中會產(chǎn)生大量的熱和自由基，不僅對重組蛋白可能造成氧化損傷，也可能對人體健康不利[17]。同時，由于His-N2蛋白中含有半胱氨酸，破碎菌體時未在溶液中加入β-巰基乙醇或二硫蘇糖醇以維持一個很強(qiáng)的還原環(huán)境，從而導(dǎo)致目的蛋白之間可能自發(fā)地形成了二硫鍵[18]。這在其他研究中也已被證實[19-20]。

本實驗采用1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)時，含有His標(biāo)簽蛋白的NP_785232蛋白N端的前兩個結(jié)構(gòu)域能在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中有效表達(dá)，這為研究該植物乳桿菌KLDS1.0320的候選表面黏附蛋白的互作腸道分子奠定基礎(chǔ)。

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Expression of the First Two Domains at N Terminus of NP_785232 Protein from Lactobacillus plantarum in Escherichia coli

ZHANG Hong, DU Li-hui, SHI Rong-hua, LIU Qin*
(Jiangsu Key Laboratory of Quality Control and Further Processing of Cereals and Oils, College of Food Science and Engineering, Nanjing University of Finance and Economics, Nanjing 210023, China)

Lactobacillus plantarum KLDS 1.0320 adhesion surface protein NP_785232 was selected as the candidate in this work, and its first two domains at N terminus were subcloned and heterologously expressed in E. coli expression system. The purified recombinant protein was subsequently tested. PCR method was utilized to clone the first two domains at N terminus of the protein NP_785232, and the cloned fragment was ligated into the expression vector pET30a to construct a recombinant plasmid pET30a/N2, which was then transformed into E. coli. After being induced with a final concentration of 1 mmol/L IPTG, the recombinant protein was purified through HisTrap affinity chromatography and then analyzed by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). The polypeptide fragment with the right size in the SDS-PAGE was further identified by mass spectrometry. The results showed that the recombinant protein was exactly the same as the first two domains at N terminus of NP_785232 protein. Thus, we concluded that the first two domains at N terminus of NP_785232 protein was successfully heterologously expressed in E. coli expression system.

Lactobacillus plantarum; NP_785232 protein; polymerase chain reaction (PCR); expression; purifi cation

TS252.1

A

1002-6630（2014）05-0129-05

10.7506/spkx1002-6630-201405026

2013-04-09

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目（31101338）；江蘇省高校自然科學(xué)基金面上項目（11KJB550002）；

南京財經(jīng)大學(xué)研究生創(chuàng)新研究項目（M12067）

張虹（1987—），女，碩士研究生，研究方向為食品微生物與生物技術(shù)。E-mail：121615605@qq.com

*通信作者：劉琴（1968—），女，教授，博士，研究方向為食品化學(xué)。E-mail：liuq_s@yahoo.com