郭寶鳳，王玉華，侯海玲

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110)

升陽(yáng)十一味丸由全石榴、益智、紅花、蓽茇、黃精、玉竹、蒺藜、肉桂、天花粉、冬葵果、天冬11 味藥材組方，具有暖腎、利水、消食、燥“協(xié)日烏素”的功效，可用于胃寒、消化不良、腎寒腰疼、寒性腹瀉等癥，臨床應(yīng)用廣泛。其藥品標(biāo)準(zhǔn)收載于1998 年版《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·蒙藥分冊(cè)》[1]，現(xiàn)有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中沒(méi)有含量測(cè)定內(nèi)容。筆者建立了測(cè)定升陽(yáng)十一味方中君藥全石榴沒(méi)食子酸含量的高效液相色譜(HPLC)法，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

日本L-2000 型高效液相色譜儀，DAD 檢測(cè)器，EZChrom Elite for Hitachi Version 工作站;Mettle RAE240 型電子天平(梅特勒-托利多有限公司);28HVLRASOTH 型超聲處理器(昆山市超聲儀器有限公司)。升陽(yáng)十一味丸(編號(hào)A，B，C，內(nèi)蒙古烏蘭浩特中蒙制藥有限公司，批號(hào)分別為090214，090701，090313;編號(hào)D，E，F(xiàn)，阜新蒙藥有限責(zé)任公司，批號(hào)分別為20100302，20060224，20100414;編號(hào)G，內(nèi)蒙古蒙藥股份有限公司，批號(hào)為100537);沒(méi)食子酸對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為110831 -200302，供含量測(cè)定用);甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

稱取沒(méi)食子酸對(duì)照品適量，精密稱定，置容量瓶中，加甲醇制成每1 mL 含沒(méi)食子酸27 μg 的溶液，即得對(duì)照品溶液。取樣品粉末約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入75%乙醇25 mL，超聲處理(功率220 W，頻率40 kHz)30 min，過(guò)濾，濾液50 ℃減壓旋干，用25 mL 水分次轉(zhuǎn)入60 mL 分液漏斗中，用醋酸乙酯萃取5 次，每次25 mL，合并萃取液，30 ℃減壓旋干，殘?jiān)眉状挤执稳芙?，轉(zhuǎn)移至25mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按照處方比例及制備工藝，取缺全石榴的方中其他藥材粉末，制備陰性對(duì)照品，精密稱取適量，按供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照品溶液。

2.2 色譜條件

色譜柱:菲羅門(mén)Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:甲醇-0.1%磷酸水溶液(5 ∶95);檢測(cè)波長(zhǎng):273 nm;流速:1.0 mL/min;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:10 μL。理論板數(shù)按沒(méi)食子酸的峰計(jì)算不低于4 000。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn):分別吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，色譜圖見(jiàn)圖1。在沒(méi)食子酸對(duì)照品色譜峰的保留時(shí)間處，供試品溶液有色譜峰且與相鄰峰得到基線分離，陰性照品溶液在此處無(wú)色譜峰，說(shuō)明共存的其他藥味對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。

線性關(guān)系考察:精密稱取沒(méi)食子酸對(duì)照品1.36 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度(質(zhì)量濃度為27.02 μg/mL)，精密吸取2，5，10，15，20 μL，分別注入液相色譜儀中，按擬訂色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖。以進(jìn)樣量(X，μg)對(duì)峰面積積分值(Y)進(jìn)行回歸分析，得回歸方程Y=12 095 X-797 509，r=1.000 0(n=5)。結(jié)果表明，沒(méi)食子酸進(jìn)樣量在54.04 ～540.4 ng 范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

精密度試驗(yàn):取同一沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液(質(zhì)量濃度為27.02 μg/mL)，進(jìn)樣10 μL，連續(xù)測(cè)定5 次。結(jié)果峰面積平均值為2 188 165，RSD=1.35%(n=5)，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一供試品(批號(hào)為090701)溶液，分別于制備后0，2，4，6，8，12，24 h 時(shí)進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果的RSD=1.89%(n=7)，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn):取同一批(批號(hào)為090701)供試品6 份，每份取樣量約0.5 g，精密稱定，依法制備供試品溶液進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果平均含量為1.288 mg /g，RSD =1.90%(n =6)，表明方法重復(fù)性良好。

圖1 專屬性試驗(yàn)高效液相色譜圖

加樣回收試驗(yàn):取已知含量的供試品(批號(hào)為090701，沒(méi)食子酸含量為1.288 mg/g)粉末約0.25 g，精密稱定，共9 份，分別加入沒(méi)食子酸對(duì)照品0.259 4，0.324 2，0.389 1 mg，各3 份。分別按供試品溶液制備方法制備溶液，按擬訂色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 沒(méi)食子酸加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

2.4 樣品含量測(cè)定

取7 個(gè)批次的供試品各0.5 g，依法制備供試品溶液，進(jìn)樣10 μL，按擬訂色譜條件測(cè)定，計(jì)算含量。結(jié)果見(jiàn)表2?？梢?jiàn)，樣品中沒(méi)食子酸的含量為0.5344 ～1.349 mg/g，不同廠家之間存在差異，相同廠家的不同批次間也有差異。因此，對(duì)君藥全石榴中沒(méi)食子酸進(jìn)行含量測(cè)定具有現(xiàn)實(shí)意義。

3 討論

流動(dòng)相的選擇:2010 年版《中國(guó)藥典(一部)》[1]及文獻(xiàn)[2-3]測(cè)定沒(méi)食子酸所采用的流動(dòng)相為不同比例的甲醇-磷酸水溶液和乙腈-0.1%磷酸水溶液(含0.1%三乙胺)。經(jīng)試驗(yàn)篩選，選擇甲醇-0.1%磷酸水溶液(5 ∶95)為流動(dòng)相。

檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇:2010 年版《中國(guó)藥典(一部)》及文獻(xiàn)[4-7]中采用HPLC 法測(cè)定單藥材及成方制劑中沒(méi)食子酸的含量，所用檢測(cè)波長(zhǎng)有216，273，267，275 nm。本試驗(yàn)中，在200 ～800 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液進(jìn)行光譜掃描。結(jié)果光譜圖中有2 個(gè)吸收峰，波長(zhǎng)分別為220，273 nm?？紤]在220 nm 波長(zhǎng)為末端吸收、干擾較多，273 nm 波長(zhǎng)處的峰高且相對(duì)較銳，故選擇273 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果(n=2)

超聲時(shí)間的選擇:分別考察了不同超聲提取時(shí)間對(duì)沒(méi)食子酸含量的影響。結(jié)果表明，超聲30 min 與20 min 比較，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，含量明顯提高;超聲30 min 與40 min 比較，兩者含量沒(méi)有明顯的變化。故確定超聲時(shí)間為30 min。

萃取次數(shù)的選擇:該方由全石榴等10 味藥組方，全石榴為君藥，沒(méi)食子酸又為其主要成分[8]，故以沒(méi)食子酸為指標(biāo)性成分進(jìn)行含量測(cè)定[9]。但含量測(cè)定時(shí)干擾成分較多，故在前處理時(shí)增加了萃取步驟。選用乙酸乙酯進(jìn)行萃取并對(duì)萃取次數(shù)進(jìn)行考察，結(jié)果表明，隨著萃取次數(shù)的增加，沒(méi)食子酸含量增加;萃取5 次與萃取4 次的結(jié)果比較，前者的含量明顯增高，但與萃取6 次的結(jié)果比較時(shí)含量沒(méi)有明顯變化。故確定用乙酸乙酯萃取5 次。

柱耐用性試驗(yàn):為了考察不同ODS 柱(型號(hào)和柱效均不同)對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，選用3 種型號(hào)的色譜柱對(duì)同一供試品(批號(hào)為20100414)溶液進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，沒(méi)食子酸峰與相鄰峰均能達(dá)到基線分離，峰對(duì)稱性均好，且各柱含量測(cè)定結(jié)果之間沒(méi)有明顯差異，說(shuō)明色譜柱理論塔板數(shù)在3 000 以上時(shí)柱型號(hào)對(duì)結(jié)果沒(méi)有影響。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典(一部)[M]. 北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:173.

[2] 霍 文，劉占軍，張婷婷. 反相高效液相色譜法測(cè)定石榴皮中沒(méi)食子酸的含量[J]. 西北藥學(xué)雜志，2007，22(5):242 -243.

[3] 王克英. 石榴皮中沒(méi)食子酸定性定量方法研究[J]. 中國(guó)中藥雜志，2005，30(15):1 171 -1 172.

[4] 許 勇，郟征偉，諸艷蓉，等.HPLC 法測(cè)定扎沖十三味丸中沒(méi)食子酸的含量[J]. 中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2012，22(7):1 560 -1 561.

[5] 霍生青.HPLC 測(cè)定十三味菥冥丸中的沒(méi)食子酸[J]. 華西藥學(xué)雜志，2012，27(4):100 -101.

[6] 張朔生.HPLC 測(cè)定炮制前后石榴皮中沒(méi)食子酸的含量[J]. 藥物分析雜志，2010，30(6):137 -139.

[7] 林 夏，胡軍華，崔培超，等.HPLC 同時(shí)測(cè)定大花紅景天提取物中沒(méi)食子酸、紅景天苷、酪醇、對(duì)香豆酸的含量[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，10(19):102 -105.

[8] 張 倩，杜海云，陳令梅，等. 石榴化學(xué)成分及其生物活性研究進(jìn)展[J]. 落葉果樹(shù)，2010(6):17 -22..

[9] 劉 源，沈好文. 高效液相色譜法測(cè)定化痔靈片中沒(méi)食子酸含量[J].中國(guó)藥業(yè)，2013，22(8):56 -58.