呂艷芳，魏春嬌，王 嬌，馬春穎，勵建榮*

（渤海大學化學化工與食品安全學院，遼寧省食品安全重點實驗室，食品貯藏加工及質量安全控制工程技術研究中心，遼寧 錦州 121013）

南美白對蝦酚氧化酶的提取及生化特性

呂艷芳，魏春嬌，王 嬌，馬春穎，勵建榮*

（渤海大學化學化工與食品安全學院，遼寧省食品安全重點實驗室，食品貯藏加工及質量安全控制工程技術研究中心，遼寧 錦州 121013）

以南美白對蝦為研究對象，分析以Tris-HCl為提取緩沖液，研究提取液濃度、提取液pH值、浸提時間對酚氧化酶活力的影響，以L9（33）正交試驗方法優(yōu)化酚氧化酶提取條件，然后對南美白對蝦酚氧化酶生化特性進行研究。結果表明：提取液濃度為0.2 mol/L、提取液 pH值為8.0、浸提時間為20 min條件下提取的酶具有最大的活力；以鄰苯二酚為底物時，酚氧化酶最適pH值為8、最適溫度為40℃，在該條件下酶促反應動力學符合米氏方程，米氏常數(shù)Km為0.717 mol/L，Vmax為0.130 A/min。

南美白對蝦；酚氧化酶；正交試驗；提??；反應動力學

對蝦蛋白質含量高，口味鮮美，營養(yǎng)豐富，深受消費者喜愛，大部分的營養(yǎng)食譜已將其確定為合理膳食中不可缺少的一部分。蝦體內含有酚氧化酶（phenoloxidase，PO），這是一種含有銅離子的金屬酶，在活蝦中該酶以酶原的形式存在，不具有催化活性，當蝦死后，外來的一些微生物進入體內，體內的各種酶組分平衡被打破，酚氧化酶酶原被激活，催化體內的酪氨酸轉化為黑色素 類物質，因而蝦死后迅速變黑[1-2]。而且蝦體內的酚氧化酶在冷藏、冰藏過程中仍具有活性[3]，所以在貯藏 過程中也很容易黑變。冷凍后解凍的對蝦更容易黑變，主要是因為凍融過程使血細胞和消化腺里活性較低的酚氧化酶被釋放出來，遇到合適的底物、有氧存在的條件下迅速形成黑色素[4]。對蝦黑色素雖然對人體無害[5]，但對蝦黑變后，易造成其營養(yǎng)成分流失，營養(yǎng)價值降低，影響銷售價格。目前，一般使用焦亞硫酸鈉處理對蝦防止其黑變，但是焦亞硫酸鈉處理的蝦類產品中二氧化硫嚴重超標[6-7]，對人健康造成危害，隨著人們食品安全意識的提高，使用安全無毒的抑制劑的要求越來越強烈。許多天然抑制劑，如抗壞血酸、植酸等對酚氧化酶都具有抑制作用[8]；Nirmal等[9]將兒茶素和阿魏酸用于凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）黑變的抑制，二者對蝦的黑變均具有一定的抑制效果；Encarnacion等[10]將金針菇(Flammulinavelutipes)提取物作用于斑節(jié)對蝦（Penaeus monodon)和凡納濱對蝦，發(fā)現(xiàn)其可以抑制蝦的黑變。

已有研究發(fā)現(xiàn)，不同種屬的甲殼類水生動物酚氧化酶的生化特性有一定的區(qū)別。以L-多巴（L-3,4-二羥基苯丙氨酸）為底物時，粉紅對蝦（Penaeus duorarum)在pH值為8.0～9.0時酶活力達到最大值[11]，中國對蝦（Penaeus chinensis）的最適pH值為6.0左右，最適溫度為40℃[12]，日本對蝦（Penaeus japonicus）的最適pH值為6.5，最適溫度35℃[13]。所以在使用抑制劑時，各種對蝦的用量有所不同。本實驗選用遼寧渤海的南美白對蝦為研究材料，對其酚氧化酶的提取工藝進行優(yōu)化；以鄰苯二酚為底物，對其部分生化特性進行研究，為南美白對蝦的研究、開發(fā)和使用新型防黑變保鮮劑研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活南美白對蝦購于錦州市海鮮市場，清洗后，于－20℃冰貯藏備用。鄰苯二酚BR級、L-脯氨酸BR級 北京中生瑞泰科技有限公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris）、鹽酸等化學試劑均為分析純 天津市化學試劑三廠。

1.2 儀器與設備

UV-2550紫外-可見分光光度計 日本島津公司；Thermo Scientific高速冷凍離心機 美國熱電子公司；DK8D型電熱恒溫水槽 上海一恒科技有限公司；RL602-L電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酚氧化酶作用鄰苯二酚生成產物最大吸收波長的測定

實驗以鄰苯二酚為底物，采用分光光度法測定酚氧化酶的活性[14]。具體操作：在離心管內加入4.4 mL、0.2 mol/L的Tris-HCl（pH 8）緩沖溶液，0.4 mL、0.5 mol/L的L-脯氨酸溶液，0.4 mL、0.5 mol/L鄰苯二酚，和0.8 mL粗酶液混合，蓋上離心管蓋放37℃的水浴鍋中預熱10 min后，取出立即放入冰中，終止反應，倒入比色皿中，用紫外分光光度計在260～700 nm波長范圍內每隔2 nm進行掃描，確定PO作用產物的最大吸收波長（λmax）。

1.3.2 酚氧化酶酶活力測定

PO活力的測定，將離心管依次加入4.4 mL、0.2mol/L的Tris-HCl（pH 8）緩沖溶液，0.4 mL、0.5 mol/L的L-脯氨酸，0.4 mL、0.5 mol/L鄰苯二酚，置于37 ℃恒溫水浴5 min，然后加入預先37 ℃預熱2 min的粗酶液0.8 mL，該混合液作為酶反應體系，立即將該混合液置于比色皿中，選擇紫外-可見分光光度計動力學模塊，在產物的最大吸收波長（λmax）下測定反應液的吸光度，每隔10 s記錄1次吸光度，一共測定10 min，并計算PO活力，選取反應體系吸光度A直線上升區(qū)間數(shù)據計算酶活，由于此階段屬于酶促反應的初速率階段。

酶活力以酶反應的初速率表示，以在產物最大吸收波長（λmax）每分鐘增加0.001定義為一個酶活力單位，即單位體積酶液在單位時間使酶反應體系在525 nm波長處吸光度增加0.001定義為1個酶活力單位[15-16]，用A/（min·mL）表示。

式中：ΔA為吸光度變化量；t為反應時間/min；V為反應體系中加入的酶液體積/mL。

酶促反應速率（V）以單位時間內A的吸光度的增加量表示。

1.3.3 Tris-HCl提取酚氧化酶條件優(yōu)化

參考相關文獻[17-19]對南美白對蝦PO提取方法進行優(yōu)化。將凍藏于－20 ℃的對蝦置于4 ℃條件下解凍，冰浴下剪碎研磨成肉糜，稱取5 g加入20 mL Tris-HCl提取緩沖液（質量體積比1∶4），靜置于4 ℃條件下進行浸提，然后高速冷凍離心，4 ℃、12 000 r/min條件下冷凍離心30 min，取其上清液即為PO粗酶液。對提取緩沖液的濃度、pH值、浸提時間3個因素進行研究，確定其最適范圍。

1.3.3.1 單因素試驗

以Tris-HCl提取緩沖液濃度（0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mol/L）、提取液pH值（5、6、7、8、9）、浸提時間（20、40、60、80、100、120 min）為單因素，在其他條件一定的前提下，進行單因素試驗，以確定正交試驗的因素水平。

1.3.3.2 正交試驗

根據單因素試驗所確定的提取液濃度、提取液pH值、浸提時間進行L9（33）正交試驗，通過正交試驗確定PO的最佳提取條件。

1.3.4 硫酸銨分級沉淀酚氧化酶

采用硫酸銨分級沉淀法對1.3.3.2節(jié)正交試驗所得粗酶液進行初步純化濃縮，所有操作都在4 ℃條件下進行。取PO粗提液20 mL，邊緩慢攪拌邊加入固體硫酸銨，使飽和度達到10%，靜置30 min，12 000 r/min離心30 min，收集沉淀，將沉淀用去離子水溶解，透析，再凍干濃縮后置于－20 ℃冰箱中備用。重復上述步驟，分別進行飽和度為20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%的硫酸銨沉淀。

用10 mL、0.2 mol/L 的Tris-HCl（p H 8）緩沖液溶解以上各飽和度硫酸銨沉淀純化所得的酶蛋白，然后測其酶活力。選擇出沉淀PO的硫酸銨飽和度，以下實驗所用PO均用此飽和度硫酸銨沉淀后再凍干濃縮，溶解備用。

1.3.5 酚氧化酶最適pH值的測定

以不同pH值（6.2、6.8、7.4、8.0、8.6、9.2、9.8）的Tris-HCl緩沖液作為反應環(huán)境，酚氧化酶液用1.3.4節(jié)純化后的酶液，然后操作參考1.3.2節(jié)，測定酚氧化酶酶活力以確定最適pH值。

1.3.6 酚氧化酶最適溫度的測定

以pH 8.0的Tris-HCl緩沖液作為反應環(huán)境，加入0.4 mL、0.5 mol/L L-脯氨酸，0.4 mL、0.5 mol/L鄰苯二酚，然后加入0.8 mL純化后的酶液，該混合液作為酶反應體系，分別將反應體系置于10、20、30、40、50、60、70 ℃下反應10 min，取出立即放入冰中，終止反應，然后立即在產物最大吸收波長(λmax)下測定反應液的吸光度，并計算PO活力。

1.3. 7 底物濃度與反應速率的關系及酶促動力學常數(shù)Km值測定

在酚氧化酶最適溫度和最適pH值條件下，測定不同底物濃度（0.1、0.2、0.3、0.4、05、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mol/L的鄰苯二酚溶液）條件下PO的反應速率，然后采用Lineweaver-Burk 作圖法計算出學Km、Vmax值。操作步驟參考1.3.6節(jié)。

2 結果與分析

2.1 酚氧化酶作用生成產物的最大吸收波長

圖1 酚氧化酶與鄰苯二酚作用生成產物的最大吸收波長Fig.1 Maximum absorption wavelength of the reaction product between phenoloxidase and catechol

由圖1可知，以鄰苯二酚為底物，反應體系中有兩個吸收峰，在525 nm有一個很寬的吸收峰，289 nm有一個細窄的吸收峰。525 nm的吸收峰與鄭丹等[14]研究三疣梭子蟹酚氧化酶生化特性時選擇的吸收波長相近，這個可能是PO氧化鄰苯二酚產生的產物醌類物質。289 nm的吸收峰，可能是在525 nm波長處的產物進一步的反應或與滲透到提取液中的氨基酸發(fā)生反應生成了另外一種物質，或者是未參與反應的底物鄰苯二酚。由此可以確定酶作用生成產物的最大吸收波長為525 nm。所以本實驗選取525 nm為本實驗反應產物的吸收峰值。

2.2 提取液濃度對酚氧化酶酶活力的影響

圖2 提取液濃度對酚氧化酶活性的影響Fig.2 Effect of Tris-HCl concentration on PO activity

Tris-HCl在提取過程中主要作用是溶解細胞膜，使蛋白質溶解于溶液中。由圖2可以看出，在Tris-HCl的濃度為0.05～0.20 mol/L的范圍內，隨著提取液濃度的增加，所提酶液活力不斷增加，當濃度為0.20 mol/L時提取的酶液活力最高；提取液濃度再逐漸增加時，所提 酶液活性逐漸減小，可能是濃度進一步提高時，離子的水合作用，降低了蛋白質的溶解度。所以Tris-HCl提取液濃度選擇0.20 mol/L較好。

2.3 提取液pH值對酚氧化酶酶活力的影響

圖3 提取液pH值對酚氧化酶活性的影響Fig.3 Effect of Tris-HCl pH on PO activity

由圖3可以看出，當提取液pH值由5.0逐漸增到8.0時，所提取酶液酶活力隨pH值的增大而升高，可能是在低酸環(huán)境下蛋白質的結構發(fā)生了改變，同時破壞了蛋白質分子間的部分氫鍵，從而促使雜蛋白質分離，增加雜蛋白的沉淀，而酶蛋白溶解于溶液中，因此酶活性較強。但當pH值繼續(xù)升高時，所提酶液酶活力逐漸降低，可能是過強的堿性環(huán)境，會使酶蛋白質變性和水解，使酶活力降低。所以酶蛋白的提取液pH值應在8.0左右。

2.4 浸提時間對酚氧化酶活性影響

如圖4所示，浸提時間為20 min時，所提酶液酶活力最高，隨著提取時間的增加，所提酶液酶活力逐漸降低，可能是因為Tris-HCl這種提取液本身具有很好的溶解細胞膜的作用，提取過程中很快將細胞中的蛋白質溶解出來，但當提取時間過長有可能出現(xiàn)部分蛋白質凝聚沉淀。為了保證細胞中的酶蛋白質全部溶解出來，浸提時間也不應太短，所以選擇酶蛋白浸提時間為30 min。

圖4 浸提時間對酚氧化酶活性的影響Fig.4 Effect of extraction time on PO activity

2.5 正交試驗結果

表1 正交試驗設計及結果Table 1 Design and results of orthogonal array experiments

由表1可知，3個因素對PO提取的影響順序是B＞C＞A，由k值和極差值R可知，提取液pH值對所提的PO酶活性影響最大。選用Tris-HCl提取對蝦PO時，提取的最佳條件為A2B2C1，即Tris-HCl提取液濃度0.2 mol/L、pH 8.0、浸提時間20 min的條件下，提取的PO酶活性最大。重復3次平行實驗驗定此條件下的酶活力為46.80、47.08、47.65（A/（min·mL）），平均為47.18（A/（min·mL））。

2.6 硫酸銨逐級沉淀酚氧化酶結果

圖5 硫酸銨分級沉淀后的PO酶活力Fig.5 PO activities of ammonium sulfate fractions with different saturation degrees

用飽和度為10%～80%的硫酸銨對南美白對蝦粗酶液進行分級沉淀，其目的是有效地將酶蛋白和其他雜蛋白分離開，使南美白對蝦粗酶液達到初步的分離純化。由圖5可以看出，酚氧化酶的粗酶液經硫酸銨沉淀，酶活力集中在30%～50%，當硫酸銨飽和度為40%時，酶活性較高，這與Nirmal等[20]實驗中選用沉淀對蝦酚氧化酶的硫酸銨飽和度相一致。因此后續(xù)實驗所用PO酶均用40%硫酸銨沉淀后再凍干濃縮，溶解后使用。

2.7 反應溫度對酚氧化酶活性的影響

圖6 反應溫度對酚氧化酶活性的影響Fig.6 Effect of reaction temperature on PO activity

在一定的條件下，生物酶促反應存在一個最適溫度，由圖6可以看出，對蝦PO在反應溫度為40 ℃時活性最高；在20～70 ℃溫度范圍內，反應溫度從20～40 ℃期間，酶活力逐漸上升，40 ℃最高，隨后酶活力隨溫度的升高開始降低。溫度對酶活性有雙重影響，一方面，溫度升高加快酶催化反應速度；另一方面，當溫度升高到一定程度促使酶蛋白質熱變性、失活，所以酶促反應速率降低。因此，在對蝦貯藏過程中，采用冷藏方法可以抑制酚氧化酶的部分活力，對防止蝦的黑變有一定的作用。

2.8 反應體系pH值對酚氧化酶活性的影響

圖7 酚氧化酶最適pHFig.7 Optimum pH of PO

由圖7可以看出，對 蝦酚氧化酶對pH值非常敏感，在此反應條件下其最適pH值是8.0。酶活力在pH值為6.2～8.0區(qū)間不斷上升，pH值8時酶活力最高；然后隨著反應體系pH值的升高，酶活力開始下降，在pH值為9.2時酶活力出現(xiàn)升高，但仍然低于pH 8時的酶活力；pH值繼續(xù)升高，酶活力繼續(xù)降低。這可能是由于在pH值較低的酸性環(huán)境中，酶中銅離子因被解離而失活；在pH值較高的堿性環(huán)境中，銅與酶蛋白脫離，成為不溶性氫氧化銅，也會使酶失活[21]。因此，在對蝦貯藏中，控制pH值在一定范圍內可以抑制對蝦酚氧化酶的活性，對防止蝦的黑變有一定的作用。

圖8 底物濃度與酚氧化酶反應速度率的關系Fig.8 Relationship between catechol concentration and PO reaction rate

2.9 底物濃度與酚氧化酶活力的關系從圖8可以看出，底物鄰苯二酚溶液的濃度對酚氧化酶反應速率有直接影響，底物濃度較低時，產物生成的速率隨著底物濃度的增大而呈直線上升趨勢，符合一級反應和混合級反應曲線，直到反應速率達到最大值，底物濃度繼續(xù)增加，反應速率變化不明顯，符合反應進入零級反應，說明所有的酶蛋白已被底物飽和，進一步提高底物濃度也不能提高酶促反應速率。由此可見，底物濃度與酶促反應速度關系完全遵循米氏方程（Michaelis-Menten）的酶動力學性質。

2.10 米氏常數(shù)Km及最大反應速率Vmax

圖9 酚氧化酶的Lineweaver-Burk圖Fig.9 Lineweaver-Burk plot of PO

在最適溫度40 ℃、最適pH 8.0的條件下測定酚氧化酶的動力學常數(shù)，以Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法得到圖9，計算得到PO的動力學參數(shù)，Km為0.717 mol/L，Vmax為0.130 A/min。

3 結 論

不同種對蝦的酚氧化酶的生化特性存在一定的差異，本實驗研究了遼寧錦州渤海養(yǎng)殖南美白對蝦的酚氧化酶的提取及生化特性，為對蝦的研究及抑制劑使用提供參考。在4 ℃條件下，采用Tris-HCl提取液提取南美白對蝦PO時，提取緩沖液濃度為0.2 mol/L、pH8.0、浸提時間為20 min的條件下提取的酶活性最大。以鄰苯二酚為底物，南美白對蝦PO的最適溫度為40 ℃、最適pH值為8；在南美白對蝦PO的最適條件下，可得出南美白對蝦PO米氏方程的參數(shù)：Km為0.717 mol/L，Vmax為0.130 A/min。

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Extraction and Biochemical Characteristics of Phenoloxidase from Penaeus vannamei

Lü Yan-fang, WEI Chun-jiao, WANG Jiao, MA Chun-ying, LI Jian-rong*
(Food Safety Key Laboratory of Liaoning Province, Engineering and Technology Research Center of Food Preservation, Processing and Safety Control of Liaoning Province, College of Chemistry, Chemical Engineering and Food Safety, Bohai University, Jinzhou 121013, China)

The extraction of phenoloxidase from Penaeus vannamei with Tris-HCl buffer as a function of three experimental parameters includin g extractant concentration, pH and extraction time was optimized using an L9(33) orthogonal array design. The extracted enzyme was characterized. The highest phenoloxidase activity was obtained after 20 min of extraction with 0.2 mol/L Tris-HCl buffer at pH 8.0. This enzyme exhibited an optimal pH of 8 and temperature of 40 ℃ for catalyzing the oxidation of pyrocatechol as a substrate. Kinetic studies obeyed the Michaelis-Menten equation. The Kmand Vmaxwere calculated to be 0.717 m ol/L and 0.130 A/min, respectively.

Penaeus vann amei; phenoloxidase; orthogonal array design; extraction; kinetics

Q554

A

1002-6630（2014）07-0113-05

10.7506/spkx1002-6630-201407023

2013-06-13

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD29B06）；遼寧省食品質量與安全專業(yè)優(yōu)秀教學團隊大學生創(chuàng)新研究計劃項目（SPCX14）；遼寧省食品安全重點實驗室開放課題（LNSAKF2011033）

呂艷芳（1977—），女，講師，博士研究生，研究方向為水產品貯藏加工及食品生物技術。E-mail：lvyanfang2003@126.com *

勵建榮（1964—），男，教授，博士，研究方向為水產品和果蔬貯藏加工與質量安全控制。

E-mail：lijr6491@163.com