曾 駿，陳安均,2,*，蒲 彪,2，付莎莉，郭雙霜

（1.四川農(nóng)業(yè)大學食品學院，四川 雅安 625014；2.四川省農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程重點實驗室，四川 雅安 625014）

傳統(tǒng)四川泡菜中酵母菌的動態(tài)變化規(guī)律

曾 駿1，陳安均1,2,*，蒲 彪1,2，付莎莉1，郭雙霜1

（1.四川農(nóng)業(yè)大學食品學院，四川 雅安 625014；2.四川省農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程重點實驗室，四川 雅安 625014）

為研 究傳統(tǒng)四川泡菜發(fā)酵過程中酵母菌的動態(tài)變化規(guī)律，對傳統(tǒng)四川泡菜自然發(fā)酵過程中的酵母菌進行分離、鑒定和計數(shù)。從自制四川泡菜樣品中共分離到5株不同菌落特 點的酵母 菌，采用26S rDNA D 1/D2區(qū)序列分析法鑒定，釀酒酵母（Kazachstania exigua）4株、膜璞畢赤酵母（Pichia membranefaciens）1株。結(jié)果表明：2種酵母菌都存在于 泡菜發(fā)酵前期，初始數(shù)量為104～106CFU/mL，隨著發(fā)酵進行，泡青菜中2種酵母菌數(shù)量持續(xù)減少，泡蘿卜中2種酵母菌數(shù)量先增加后減 少，泡白菜中沒有檢測到膜璞畢赤酵母，釀酒酵母數(shù)量先增加后減少。2種酵母菌在泡菜主 要發(fā)酵時期的第3～5天減少最快，5 d后消失，不同發(fā)酵原料和鹽水中pH值變化是影響2種酵母菌動態(tài)變化的重要原因。

四川泡菜；酵母菌；變化規(guī)律

傳統(tǒng)四川泡菜是利用一定濃度鹽水泡制蔬菜，經(jīng)乳酸發(fā)酵為主、兼有醋酸發(fā)酵、酒精發(fā)酵等過程制成的食品。其發(fā)酵原理是：蔬菜在5%～10%的高濃度食鹽溶液中，借助于天然附著在蔬菜表面的有益微生物（主要是乳酸菌），發(fā)酵產(chǎn)酸，降低pH值，同時利用食鹽的高滲透壓，共同抑制其他有害微生物的生長。其精華在于結(jié)合了陳年的“老鹽水”、具有密閉和通氣功能的土陶泡菜壇等特色元素，制成四川泡菜獨有的風味和口感，其原料豐富多樣，以青菜、蘿卜、白菜等時令蔬菜為原料發(fā)酵后形成的泡菜 風味獨特，不僅是佐餐佳品，而且還具有刺激食欲，健胃消食，改善腸道環(huán)境，促進胃腸健康，通便緩瀉，調(diào)節(jié)血脂等功能[1-4]。

乳酸菌、酵母菌、醋酸菌是四川泡菜微生物學研究的主要對象，一直以來，學者對泡菜中起主要作用的乳酸菌研究較為全面[5-9]，而酵母菌的研究較少，已有研究主要集中在對泡菜和發(fā)酵蔬菜中酵母菌的分離、鑒定和菌種篩選上，關(guān)于四川泡菜發(fā)酵過程中酵母菌動態(tài)變化規(guī)律的研究鮮有報道。然而，酵母菌對發(fā)酵蔬菜的風味質(zhì)地以及發(fā)酵后貯藏有著重要影響，且在泡菜的不同發(fā)酵階段，酵母菌的種類和數(shù)量不同，其發(fā)酵性能差異較大，對泡菜風味品質(zhì)的影響也不盡相同[10-11]。因此，研究整個泡菜發(fā)酵過程中，酵母菌的菌相構(gòu)成及動態(tài)變化對進一步揭示傳統(tǒng)四川泡菜微生態(tài)系統(tǒng)動態(tài)變化過程與風味品質(zhì)形成的內(nèi)在聯(lián)系十分必要，可為規(guī)?；a(chǎn)優(yōu)質(zhì)的傳統(tǒng)四川泡菜提供依據(jù)。本實驗通過按40%的比例加入品質(zhì)優(yōu)良的傳統(tǒng)四川泡菜“老鹽水”制作泡菜，分離鑒定其中的酵母菌，并通過菌落計數(shù)研究整個發(fā)酵過程中酵母菌的數(shù)量變化規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

泡菜老鹽水：從四川民間采集2年以上優(yōu)質(zhì)泡菜“老鹽水”10份，通過感官和風味評價，篩選出Y1、Y2、Y33份優(yōu)質(zhì)“老鹽水”用于實驗。

蔬菜：從蔬菜市場采購新鮮的大白菜、紅皮蘿卜、青菜等。

調(diào)料：從蔬菜市場采購的生姜、紅辣椒、花椒、食鹽、冰糖、白酒等。

1.2 儀器與設(shè)備

DNP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；WH-2旋渦振蕩器 上海滬西分析儀器廠有限公司；SW-CJ-1F無菌操作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；CX21FS1顯微鏡 上海光學儀器一廠；PHS-4C精密pH計 成都世紀方舟科技有限公司；BT124S電子天平北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；SYQ-DSX-280B高壓滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；DYY-10C電泳儀 北京六一儀器廠；PCR儀 德國Eppendorf公司。

1.3 培養(yǎng)基

YPD瓊脂培養(yǎng)基[12]：葡萄糖20 g、蛋白胨20 g、酵母膏10 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL，121℃滅菌20 min。

馬鈴薯（PDA）瓊脂培養(yǎng)基[12]：馬鈴薯（去皮）200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL。馬鈴薯切成小塊放入燒杯中，煮沸30 min，紗布過濾，加糖和瓊脂，補水至1 000 mL，121℃滅菌20 min。

孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基：購于杭州微生物試劑有限公司，按說明配制，121℃滅菌20 min。

1.4 泡菜制作工藝

配料（食鹽、花椒、辣椒、生姜、冰糖、白酒）

配方：采用3種優(yōu)質(zhì)泡菜“老鹽水”分別泡制3種蔬菜，將泡制后的鹽水用于研究。泡菜的主要原料及“老鹽水”配方見表1，再分別向壇中加入食鹽160 g、花椒5 g、辣椒50 g、生姜20 g、冰糖10 g、白酒20 mL制作泡菜。

表1 傳統(tǒng)四川泡菜的制作配方Table 1 The recipes for traditional Sichuan kimchi

1.5 酵母菌分離、純化及鑒定

樣品為按1.4節(jié)制成的傳統(tǒng)四川泡菜鹽水，每天取樣1次，分離其中的酵母菌。無菌操作下取泡菜鹽水25 mL，加入225 mL無菌水中，漩渦振蕩器振蕩30 s，再取1 mL稀釋液加入9 mL無菌水中，依次稀釋成10-1，10-2、10-3、10-4、10-5倍稀釋液，分別取0.3 mL稀釋液接種到3種培養(yǎng)基（孟加拉紅、PDA、YPD瓊脂培養(yǎng)基）上，每個處理3次重復(fù)，置于恒溫培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落長出時間、菌勢強弱和菌落形態(tài)，無菌操作下取不同形態(tài)的酵母菌單菌落于孟加拉紅培養(yǎng)基上劃 線純化[13]，3次純化后的單菌落用于顯微鏡鏡檢和分子鑒定。

分子鑒定方法采用26S rDNA D1/D2區(qū)序列分析法。對不同菌落特點的菌落隨機取樣2～3個用作PCR模板；PCR引物：NL1 5’-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3’，NL2 5’-GGT CCG TGT TTC AAG ACG G-3’；PCR體系（總體積50 μL）：引物1 μL×2，模板1 μL，Mix 25 μL，ddH2O 22 μL；PCR 反應(yīng)程序：94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸55 s，36個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物由北京華大中生科技發(fā)展有限公司測序。將測序結(jié)果輸入 www.NCBI.nlm.nih.gov，利用BLAST軟件，將測得的基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫的序列進行同源性比較。

1.6 菌落計數(shù)方法

通過不同酵母菌在培養(yǎng)基上表現(xiàn)出的不同菌落特點來分別計數(shù)[14-15]：按1.5節(jié)的取樣方法，將樣品接種于3種培養(yǎng)基（孟加拉紅、YPD和PDA培養(yǎng)基）。觀察選取最容易區(qū)分菌落特點和便于計數(shù)的培養(yǎng)基。對不同菌落特點的酵母菌分別編號、計數(shù)、劃線純化、鑒定；對相同菌落特點的菌隨機取2～3個，劃線純化、鑒定。根據(jù)計數(shù)結(jié)果與鑒定結(jié)果相結(jié)合得出每種酵母菌的數(shù)量，例如：有幾個菌落特點不同的菌種經(jīng)鑒定屬于同種酵母菌，就將之前的分別計數(shù)結(jié)果相加得出最終數(shù)量。

1.7 傳統(tǒng)四川泡菜發(fā)酵過程中酵母菌的動態(tài)變化規(guī)律

按照1.4節(jié)所述泡菜制作工藝，用3種“老鹽水”（編號為Y1、Y2、Y3）分別泡制蘿卜、白菜、青菜，形成9個泡菜樣品。在泡制第0、1、2、3、4、5、6、7、9、11、13、15天分別從9個樣品中取樣，對其中不同菌落特點的酵母菌分別計數(shù)，同時用精密pH計測定鹽水中的pH值，得到不同發(fā)酵時間泡菜發(fā)酵液中的pH值變化情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌的分離鑒定

從平板上分離得到5株酵母菌，菌株編號分別為CP-A、CP-C、CP-J、CP-K、CP-L，經(jīng)分子鑒定，其中4株為釀酒酵母，另1株為膜璞畢赤酵母，鑒定結(jié)果見表2。

表2 5株酵母菌26S rDNA鑒定結(jié)果Table 2 Identification of five yeast strains based on 26S rDNA

2.2 菌落計數(shù)結(jié)果

在YPD培養(yǎng)基上，2種酵母菌的菌落特點鮮明，長勢最好，便于分別計數(shù)，圖1為2種菌在YPD培養(yǎng)基上的菌落差異。2株酵母菌最佳的計數(shù)濃度梯度為10-3、10-4、10-5，最佳的計數(shù)時間為發(fā)酵后48～60 h。結(jié)合上述鑒定結(jié)果，將最初對CP-A、CP-J、CP-K、CP-L的計數(shù)結(jié)果相加得到釀酒酵母的數(shù)目，CP-C的計數(shù)結(jié)果為膜璞畢赤酵母的數(shù)目。

圖1 YPD培養(yǎng)基上釀酒酵母（a）和膜璞畢赤酵母（b）的菌落差異Fig.1 Comaprative colony morphology between Kazachstania exigua and Pichia membranefacienson (a) in YPD medium (b)

2.3 傳統(tǒng)四川泡菜發(fā)酵過程中酵母菌的動態(tài)變化規(guī)律

2.3.1 釀酒酵母的動態(tài)變化規(guī)律

選取菌落數(shù)為30～300 CFU的平板計數(shù)，以1 mL泡菜鹽水中菌落數(shù)的常用對數(shù)為縱坐標、發(fā)酵時間為橫坐標進行統(tǒng)計，得到泡青菜、泡蘿卜和泡白菜過程中釀酒酵母的動態(tài)變化規(guī)律，如圖2A～C所示。發(fā)酵剛開始，釀酒酵母數(shù)量為104～106CFU/mL。泡青菜中，釀酒酵母的數(shù)量持續(xù)減少，發(fā)酵第3～4天減少最快，在第5天左右消失（圖2A）；泡蘿卜中，釀酒酵母的數(shù)量先增加后減少，發(fā)酵后2 d，釀酒酵母的數(shù)量最大，達到107CFU/mL，之后快速減少，第5天左右消失（圖2B）；泡白菜中，釀酒酵母的數(shù)量先增加，發(fā)酵后1 d達到最大值，之后快速減少，4 d后消失（圖2C）。

圖2 3種“老鹽水”樣品泡制青菜（A）、蘿卜（B）、白菜（C）過程中釀酒酵母的動態(tài)變化規(guī)律Fig.2 Dynamic growth curves of Kazachstania exigua during pickling of bok choy (A), radish (B) and Chinese cabbage (C) with three different brines (Y1, Y2and Y3)

2.3.2 膜璞畢赤酵母的動態(tài)變化規(guī)律

泡白菜中沒有檢測出膜璞畢赤酵母，泡青菜和泡蘿卜過程中膜璞畢赤酵母的動態(tài)變化規(guī)律如圖3所示。

圖3 3種“老鹽水”樣品泡制青菜（A）、蘿卜（B）過程中膜璞畢赤酵母的動態(tài)變化規(guī)律Fig.3 Dynamic growth curves of Pichia membranefaciens during pickling of bok choy (A), radish (B) and Chinese cabbage (C) with three different brines (Y1, Y2and Y3)

由圖3A可知，在泡青菜中，其初始數(shù)量為104～105CFU/mL，隨發(fā)酵進行，其數(shù)目持續(xù)減少，在發(fā)酵第3～4天減少最快，4 d后消失；由圖3B可知，在泡蘿卜中，膜璞畢赤酵母的初始數(shù)量為5×104CFU/mL左右，隨發(fā)酵進行，其數(shù)目呈先增加后減少的趨勢，2 d后達到最大值，超過106CFU/mL。之后采用Y2老鹽水、Y3老鹽水的發(fā)酵液中膜璞畢赤酵母的數(shù)目開始緩慢減少，5 d后消失；而采用Y1老鹽水的發(fā)酵液中，其數(shù)目一直維持在105CFU/mL左右，發(fā)酵11 d后開始減少，同時發(fā)現(xiàn)，采用Y1老鹽水泡制蘿卜10 d后，泡菜表面出現(xiàn)白膜（俗稱“生花”），這可能與Y1發(fā)酵液中酸度上升緩慢，后期酵母菌較多有關(guān)。

2.4 不同發(fā)酵時間發(fā)酵液中pH值的變化

表3 不同發(fā)酵時間下3種“老鹽水”泡制3種蔬菜過程中鹽水pH值的變化Table 3 Changes in the pH of three different brines during pickling of bok choy, radish and Chinese cabbage

如表3所示，采用老鹽水Y1泡制不同原料時，pH值變化范圍為2.9～6.0，采用老鹽水Y2和Y3時，pH值變化范圍為2.8～4.0。利用3種“老鹽水”泡制蔬菜過程中，pH值都隨發(fā)酵的進行呈下降趨勢，且在發(fā)酵3～6 d下降較快，后期pH值維持在3左右。Y1老鹽水泡制白菜時，pH值下降最快，第4天下降到3.5以下，而低pH值會抑制酵母菌的生長[16-17]，與上述關(guān)于酵母菌在泡白菜中存在時間更短相吻合。Y1老鹽水泡制蘿卜時，鹽水的pH值在發(fā)酵后10 d才下降到4以下，較高的pH值可能是該發(fā)酵液中膜璞畢赤酵母存在時間較長的重要原因。

3 結(jié)論與討論

本實驗分離得到2種酵母菌：釀酒酵母（Kazachstania exigua）和膜璞畢赤酵母（Pichia membranefaciens），數(shù)量為104～107CFU/ mL，僅存在于泡菜發(fā)酵前期。與之前文獻[10-11,18]報道從泡菜中分離得到酵母菌種類多、數(shù)量大、持續(xù)時間長有較大不同，原因可能有以下兩點：一是樣品來源不同，之前研究大多是腌制蔬菜，其半封閉的發(fā)酵方式與厭氧發(fā)酵的傳統(tǒng)四川泡菜差別較大；二是本研究采用40%“老鹽水”制作泡菜，鹽水中本身乳酸菌較多，環(huán)境中pH值快速降低至3以下，多數(shù)酵母菌難以生長，尤其在發(fā)酵后期。

2種酵母菌都存在于泡菜發(fā)酵前期，初始數(shù)量約為104～106CFU/mL，隨著發(fā)酵進行，泡青菜中酵母菌數(shù)量持續(xù)減少，泡蘿卜和泡白菜中酵母菌數(shù)量先增加后減少，在泡菜主要發(fā)酵時期的第3～5天減少最快，5 d后消失。這與楊瑞[19]研究認為泡菜發(fā)酵過程中酵母菌的濃度會經(jīng)歷“先上升，達到最高點再下降”的結(jié)果一致。而泡菜中酵母菌的數(shù)量與pH值、酸度密切相關(guān)[20]，結(jié)合泡菜發(fā)酵液中的pH值變化，可以推測，傳統(tǒng)四川泡菜在發(fā)酵的3～6 d是泡菜發(fā)酵的最主要時期，是乳酸菌大量繁殖，大量產(chǎn)酸，逐漸抑制酵母菌而成為泡菜優(yōu)勢菌群的時期。本實驗利用3種不同的“老鹽水”發(fā)酵3種常見蔬菜，其變化趨勢基本一致，研究結(jié)果具有一定代表性，并發(fā)現(xiàn)采用不同原料，鹽水中酵母菌的數(shù)量變化差異較大。

四川泡菜發(fā)酵是一個多種微生物共同發(fā)揮作用的混合發(fā)酵體系，通過實驗發(fā)現(xiàn)：發(fā)酵前期，酵母菌數(shù)量較多，其既可以有效利用可發(fā)酵糖，抑制雜菌生長，又能產(chǎn)生一定的醇香和酯類物質(zhì)，因此，在泡菜工業(yè)化生產(chǎn)時，可以選擇在前期加入更多的酵母菌，數(shù)量以106CFU/mL左右為宜，發(fā)酵3～6 d是乳酸菌大量產(chǎn)酸時間，應(yīng)加入更多的乳酸菌，保證鹽水pH值的快速降低。而發(fā)酵后期酵母菌較多，會使泡菜“生花”和產(chǎn)生不愉快的風味，影響泡菜風味和品質(zhì)[21-22]。因此，應(yīng)嚴格控制后期發(fā)酵液中的酵母菌數(shù)量。已有研究[23-26]表明：環(huán)境中鹽濃度變化、pH值降低、其他微生物的積累以及香辛料逐漸溶于泡菜水，都會導(dǎo)致酵母菌種類和數(shù)量的變化，可通過這些措施來促進和抑制其生長和繁殖。然而，酵母菌的動態(tài)變化是如何對四川泡菜風味和口感產(chǎn)生作用的，它們之間的關(guān)聯(lián)還有待進一步研究。

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Dynamic Changes of Yeasts during the Fermentat ion of Traditional Sichuan Kimchi

ZENG Jun1, CHEN An-jun1,2,*, PU Biao1,2, FU Sha-li1, GUO Shuang-shuang1
(1. College of Food Science, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China; 2. Sichuan Key Laboratory of Agricultural Product Processing and Storage Engineerin g, Ya’an 625014, China)

This study was designed to explore the dynamic changes of yeasts during the spontaneous fermentation of traditional Sichuan kimch. Five yeast strains from kimchi juice were isolated and identifi edby sequence analysis of the D1/D2 region of 26S rDNA as 4 Kazachstaniaexi gua strains and 1 Pichia membranefaciens strain. The results indicated that the initial quantities of both yeast species were 104－106CFU/mL at the early fermentation stage. As the fermentation proceeded, the two yeast species showed a continuous decline in pickled bok choy and tended to increase initially and then decrease in pickled radish; however, Pichia membranefaciens was not detected in pickled Chinese cabbage, while Kazachstania exigua showed an initial increase followed by an opposite trend. The quantities of both yeast species exhibited the fastest decline from day 3 until day 5, that is the main fermentation period, to reach undetectable levels. These observed changes may be due to changes in the pH of fermentation substrates and pickle brine.

Sichuan kimchi; yeast; change

TS255.54

A

1002-6630（2014）07-0081-05

10.7506/spkx1002-6630-201407017

2013-05-07

國家自然科學基金面上項目（31171726）

曾駿（1986—），男，碩士，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏。E-mail：189595565@qq.com

*通信作者：陳安均（1970—），男，副教授，博士，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏。E-mail：591919465@qq.com