張 穎，曾 艷，張麗姣，崔世茂，孫媛霞,*

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010； 2.中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308）

蛹蟲草菌糠多糖的分離純化及結(jié)構(gòu)組成分析

張 穎1，曾 艷2，張麗姣2，崔世茂1，孫媛霞2,*

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010； 2.中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308）

以蛹蟲草菌糠 為原料，利用纖維素酶酶解提取多糖，通過乙醇分級醇沉與Sevag法脫蛋白對所提多糖 進行初級分離純化，得到4種多糖（P1、P2、P3、P4）。利用凝膠色譜、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）對這4種多糖的分子質(zhì)量分布與單糖組成進行分析；進一步利用Superdex 200凝膠柱層析對P2進行純化精制，通過高碘酸鈉氧化、Smith降解、紅外光譜和核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）技術(shù)表征了精多糖P2的一級結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明：乙醇分級沉淀與Sevag脫蛋白方法的結(jié)合能滿足蛹蟲草菌糠多糖初級純化的要求，得到了較純的P 2、P3、P4組分，分子質(zhì)量分別為35.9、9.4、3.7 kD；其中P2是由葡萄糖組成的葡聚糖，其主鏈結(jié)構(gòu)主要為α-（1→4）吡喃葡聚糖。P3和P4是由甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成的雜多糖，且單糖組成均以葡萄糖為主。

蛹蟲草；菌糠多糖；分離純化；結(jié)構(gòu)分析

食用菌的菌絲殘體以及培養(yǎng)料殘渣被稱為食用菌菌糠，其含有豐富的多糖、氨基酸、微量元素及一些食用菌生長代謝產(chǎn)物。食用菌生產(chǎn)的平均生物轉(zhuǎn)化率約為100%，即每生產(chǎn)100 g食用菌干品需要消耗100 g干培養(yǎng)料。據(jù)中國食用菌協(xié)會統(tǒng)計2010年全國食用菌總產(chǎn)量為2 200萬 t，這也意味著至少有2 200萬 t的食用菌菌糠產(chǎn)生。已有研究表明食用菌菌糠多糖也具有抗氧化、抑菌等活性，如杏鮑菇菌糠多糖具有較強的抗氧化活性[1]，香菇菌糠 多糖對大腸桿菌有極強的抑菌性[2]。因此從菌糠中提取多糖，不僅可以延伸食用菌種植產(chǎn)業(yè)鏈，增加附加值，還可以減少環(huán)境污染，保證食用菌產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，具有顯著的經(jīng)濟和生態(tài)意義。

近幾年蛹蟲草作為冬蟲夏草的替代品在全國各地得以廣泛栽培[3]，一般生產(chǎn)6 g蛹蟲草子實體干品需要10 g干料，因此蛹蟲草栽培會產(chǎn)生大量菌糠。這些菌糠主要以大米為原料（輔料為含蠶蛹粉的營養(yǎng)液），來源與生產(chǎn)過程潔凈可控。蛹蟲草多糖作為一種特殊的免疫調(diào)節(jié)劑，具有降血糖[4]、抗慢 性腎衰[5]，抗氧化和增強人體免疫的作用[6]。學(xué)者們對蛹蟲草子實體、菌絲體及胞外多糖的分離純化、結(jié)構(gòu)與活性進行了大量研究[7-17]，結(jié)果表明蛹蟲草多糖的生物活性與其結(jié)構(gòu)有著密切關(guān)系，但對蛹蟲草菌糠多糖的相關(guān)研究卻仍有待深入。

本研究以大米為原料[18]（其中各組分質(zhì)量含量分別為大米82.3%、蠶蛹粉7.7%、蛋白胨3.8%、白糖5.4%、KH2PO40.8%）栽培蛹蟲草后的菌糠為材料，利用纖維素酶酶解提取蛹蟲草菌糠多糖，通過乙醇分級純化與Sevag脫蛋白環(huán)節(jié)，獲得4 種菌糠多糖，對其結(jié)構(gòu)組成進行分析比較，并對純化后的精多糖P2進行了一級結(jié)構(gòu) 表征。本研究對蛹蟲草菌糠多糖結(jié)構(gòu)的解析將為進一步確定多糖構(gòu)效關(guān)系、改性增強多糖生物活性提供參考，同時也為蛹蟲草菌糠多糖開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蛹蟲草菌糠 內(nèi)蒙古園藝研究院；Cellulase ACCF-4740 日本明治制果藥業(yè)株式會社；標(biāo)準(zhǔn)單糖及葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品 美國Sigma-Aldirch公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1200Series高效液相色譜、Agilent 7890A GC/7200 Q-TOF精確質(zhì)量四極桿飛行時間質(zhì)譜 美國安捷倫公司；AKTA purifier 100 蛋白純化儀 美國通用公司；VERTEX70型傅里葉變換紅外光譜儀、Bruker AVANCE III 600MHz NMR核磁共振儀 德國Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 菌糠多糖酶法提取

蛹蟲草菌糠干燥至恒質(zhì)量，粉粹，過80 目篩，按料液比1∶20（m/V）加入二次水，調(diào)節(jié)pH值為4，加入1%的纖維素酶（按樣品質(zhì)量計），在45 ℃酶解2 h。然后 95 ℃滅酶15 min，冷卻離心（6 000 r/min，15 min），取上清液，濃縮冷凍干燥。

1.3.2 菌糠多糖乙醇分級沉淀法精制

取所得冷凍干燥菌糠多糖，適量溶解。加乙醇至終體積分?jǐn)?shù)為20%，4 ℃冰箱過夜，12 000 r/min離心15 min，收集沉淀，凍干即P1；上清液中繼續(xù)加乙醇至體積分?jǐn)?shù)為40%，4 ℃冰箱過夜，上述條件離心，收集沉淀凍干即為P2；上清液中再繼續(xù)加乙醇至體積分?jǐn)?shù)為60%，4 ℃冰箱過夜，離心，收集沉淀凍干為P3；上清液中再繼續(xù)加乙醇至體積分?jǐn)?shù)為80%，4 ℃冰箱過夜，離心，收集沉淀凍干為P4。

1.3.3 菌糠多糖Sevag法脫蛋白

向分級醇沉多糖的溶液中加入1/5體積的Sevag試劑（V（氯仿）∶V（正丁醇） = 4∶1），劇烈攪拌30 min，7 500 r/min離心10 min后，除去水層和氯仿之間變性的蛋白，重復(fù)6 次。采用Lowry[19]檢測樣品中蛋白質(zhì)含量。

1.3.4 高效滲透凝膠色譜表征多糖分子質(zhì)量

凝膠滲透色譜（gel permeation chromatography，GPC）分析條件：色譜柱：Agilent PL aquagel-OH MIXED-H（300 mm×7.5 mm，8 ?m），柱溫30 ℃，洗脫液為超純水，流速0.8 mL/min，進樣量20 μL，色譜采集時間25 min。

葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：配制2.0 mg/mL的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品（分子質(zhì)量分別為5、25、50、80、150、410、670 kD）水溶液，根據(jù)上述凝膠色譜分析條件采集各標(biāo)準(zhǔn)品譜圖，以標(biāo)準(zhǔn)品分子質(zhì)量對數(shù)lgMr（y） 與出峰保留時間（x）作圖，并對曲線進行二次回歸擬合，得到葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y = －0.971 1x+14.228（R2 = 0.988 4），用于確定被測樣品中多糖分子質(zhì)量分布。

1.3.5 單糖組成分析

氣相色譜條件：色譜柱：RTX-225石英毛細血管柱（15 m×250 μm，0.25 μm），載氣為He，流速16.2 mL/min，進樣口溫度250 ℃，接口溫度280 ℃，進樣量1 μL，分流比10∶1。

準(zhǔn)確稱取待測菌糠多糖樣品10 mg置于安瓿瓶中，加入5 mL的 4 mol/L三氟乙酸，封管，120 ℃油浴中反應(yīng)6 h，使用氮氣吹干儀去除三氟乙酸；再加入0.5 mL吡啶、10 mg鹽酸羥胺和1 mg內(nèi)標(biāo)肌醇六乙酸酯，90 ℃加熱反應(yīng)30 min；取出冷卻后加入乙酸酐0.5 mL，繼續(xù)在90 ℃反應(yīng)30 min進行乙?；?；反應(yīng)結(jié)束后，采用氮氣吹干儀去除相關(guān)溶液，加入1 mL三氯甲烷溶解過膜，上機分析。

1.3.6 精多糖P2分離純化及其一級結(jié)構(gòu)測定

1.3.6.1 精多糖P2分離純化

利用凝膠柱Superdex 200 10/300GL分離純化粗多糖P2，上樣量20 mg，超純水洗脫，流速0.25 mL/min，收集速率0.25 mL/管，通過硫酸-苯酚法和示差檢測器分析監(jiān)控，獲得精多糖P2。

1.3.6.2 高碘酸鈉氧化與Smith降解[20]

高碘酸鈉氧化：稱取25 mg純化的P2置于25 mL容量瓶中，加入30 mmol/L的高碘酸鈉，定容，于4 ℃條件下避光氧化，按一定時間間隔吸取100 μL氧化液，250倍稀釋后測定其在223 nm波長處的吸光度，直至恒定，加入乙二醇終止反應(yīng)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算高碘酸鈉消耗量；同時移取2 mL的氧化液，以溴甲酚綠為指示劑，用0.01 mol/L的NaOH滴定甲酸生成量。

Smith降解：將上述乙二醇處理后的氧化液透析48 h，減壓濃縮，加入100 mg NaBH4暗處放置24 h；用50%的醋酸調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH值至6～7，透析除去過量的NaBH4，冷凍干燥得到多糖醇產(chǎn)物。采用1.3.5節(jié)的方法水解后，進行單糖分析。

1.3.6.3 紅外光譜分析

稱取充分干燥的精多糖P2樣品2 mg與150 mg KBr混合研磨后壓片，上機掃描分析，掃描范圍400～ 4 000 cm-1。

1.3.6.41H NMR和13C NMR的分析

用D2O溶解適量純化的P2，通過Bruker AVANCE III 600 MHz NMR測定分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛹蟲草菌糠多糖不同組分的蛋白質(zhì)含量

表1 Sevag法脫蛋白前后分級醇沉多糖的蛋白質(zhì)含量Table 1 The protein content in the alcohol precipitated polysaccharides before and after the deproteinization with Sevag reagent

由表1可知，隨著分級醇沉體系中乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，菌糠多糖組分的蛋白含量也在增加。這與Huang Qilin等[21]分級醇沉冬蟲夏草胞外多糖時的蛋白含量變化趨勢一致。重復(fù)6 次脫蛋白步驟后，Lowry法的檢測結(jié)果表明P1、P2的游離蛋白基本去除，P3含有少量蛋白，而P4蛋白去除率最差，由于Sevag法不易脫去結(jié)合蛋白，推測P3與P4含有結(jié)合蛋白。

2.2 蛹蟲草菌糠多糖分子質(zhì)量分布

圖1 蛹蟲草菌糠多糖（P1～P4）的凝膠色譜分析圖譜Fig.1 Gel permeation chromatograms of the polysaccharide fractions (P1 through P4)

由圖1可知，根據(jù)出峰時間與峰形可判斷，4 種多糖中，P1分子質(zhì)量較大，分布較寬。P2、P3、P4的主要成分則比較單一。根據(jù)葡聚糖分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別測得其分子質(zhì)量為35.9、9.4、3.7 kD，呈依次減小的關(guān)系。在乙醇分級醇沉中，大分子質(zhì)量的多糖在低體積分?jǐn)?shù)的乙醇中先被沉淀出來。4 種蛹蟲草菌糠多糖的分子質(zhì)量大小變化與這一原理相吻合。

圖2 單糖標(biāo)準(zhǔn)品及蛹蟲草菌糠多糖（P2～P4）氣相色譜Fig.2 GC chromatograms of monosaccharide standards and the monosaccharide composition of P2, P3 and P4

2.3 蛹蟲草菌糠單糖組成通過對圖2保留時間及質(zhì)譜碎片峰對比，發(fā)現(xiàn)P2僅含葡萄糖；P3和P4則含有甘露糖、葡萄糖、半乳糖。因此推斷P2為葡聚糖；P3和P4是由甘露糖、葡萄糖、半乳糖組成的雜多糖，其甘露糖、葡萄糖、半乳糖物質(zhì)的量比分別為8∶91∶6和1∶18∶1。于榮敏等[22]分離純化人工蛹蟲草菌絲體多糖后，得到1 個葡聚糖和5 個均由葡萄糖、半乳糖和甘露糖組成的雜多糖。吳鳳瑤[6]從蛹蟲草子實體多糖中也分離純化得到了4 個由上述3 種單糖組成的雜多糖。本研究結(jié)果顯示蛹蟲草菌糠的單糖組成成分與報道的蛹蟲草子實體多糖組成成分基本一致。

2.4 蛹蟲草菌糠多糖P2一級結(jié)構(gòu)的測定結(jié)果

2.4.1 高碘酸鈉氧化和Smith降解實驗由表2可知，P2的高碘酸鈉氧化有甲酸生成，說明其結(jié)構(gòu)中存在1→6糖苷，但是其消耗高碘酸鈉的量遠遠大于甲酸生成量的2倍，因此糖苷主要以1→2或1→4鍵型存在。Smith降解產(chǎn)物水解后產(chǎn)生的甘油、赤蘚糖醇、甘露糖物質(zhì)的量比為0.29∶3.66∶0.34。由于產(chǎn)生赤蘚糖醇的糖苷鍵型為1→4，產(chǎn)生甘露糖的為1→3，產(chǎn)生甘油的為

表2 蛹蟲草菌糠多糖P2高碘酸鈉氧化和Smith降解結(jié)果Table 2 The results of sodium periodate oxidation and Smith degradation for P2

1→6或1→2[23]。由此推斷P2主鏈以1→4糖苷為主，含有少量1→2、1→6和1→3糖苷鍵。

2.4.2 紅外光譜分析結(jié)果

圖3 蛹蟲草菌糠多糖P2紅外光譜Fig.3 FT-IR spectrum of P2

由圖3可知，3 325.32 cm-1的峰是－OH的伸縮振動吸收峰，2 931.47 cm-1是C－H的伸縮振動峰，1 652.45 cm-1是－OH的彎曲振動吸收峰，1 155.85、1 080.84、1 021.62 cm-1的吸收峰表示P2的葡萄糖殘基為吡喃糖環(huán)構(gòu)型（呋喃型糖環(huán)在此區(qū)間只有兩個強吸收峰）[24]。此外P2在850.82 cm-1處出現(xiàn)吸收峰，而890 cm-1附近無吸收，說明其不含β端基差向異構(gòu)，為α構(gòu)型[25-26]。

2.4.3 核磁共振圖譜

圖4 蛹蟲草菌糠多糖P2核磁共振圖譜Fig.4 NMR spectrum of P2

由圖4a可知，其C1上質(zhì)子 的化學(xué)位移為5.32。而C2～C6的質(zhì)子化學(xué)位移集中于4.0～4.8，受D2O的溶劑峰（化學(xué)位移4.71）干擾外，信號重疊嚴(yán)重，難以給出準(zhǔn)確的結(jié)構(gòu)信息。一般而言，α構(gòu)型糖苷C1的質(zhì)子化學(xué)位移大于4.95，β構(gòu)型的則小于4.95，而呋喃糖C1的質(zhì)子化學(xué)位移為5.4左右[27]。因此推斷P2糖苷為α-吡喃構(gòu)型。

13C NMR分析能同時提供多糖糖苷構(gòu)型與糖苷鍵連接方式的信息。α構(gòu)型吡喃糖殘基C1的化學(xué)位移為90～102，β構(gòu)型的為102～112[28]。呋喃糖的C3或C5在82～84之間有信號，而吡喃糖的C3或C5化學(xué)位移則小于80[29]。由圖4b可知，P2除在化學(xué)位移99.6出現(xiàn)13C NMR信號外，其余信號的化學(xué)位移均小于80， 因此，在紅外光譜與1H NMR分析基礎(chǔ)上，借助13C NMR可進一步確定P2的葡萄糖殘基為α構(gòu)型吡喃糖。Ranjini等[30]從Curcuma aeruginosa中獲得一種α-（1→4）葡聚糖，其非取代的C3、C2、C5、C6化學(xué)位移分別為73.2、71.9、71.6、60.5。在P2的13C MNR譜中，其非取代的C3、C2、C5、C6的化學(xué)位移分別為73.3、71.5、71.2、60.5，并且信號強度高于其他峰，說明P2的糖苷鍵以α-（1→4）為主。這與高碘酸鈉氧化和Smith降解實驗結(jié)果是印證的。

3 結(jié) 論

蛹蟲草菌糠多糖經(jīng)乙醇分級醇沉和Sevag脫蛋白后得到4種多糖（P1～P4），其中P2、P3、P4分子質(zhì)量分布較單一。通過GC-MS單糖組成分析表明P2為僅由葡萄糖聚合而成的葡聚糖，P3和P4是由甘露糖、葡萄糖和半乳糖聚合組成的雜多糖。凝膠柱Superdex 200分離純化P2后，結(jié)合高碘酸鈉氧化、Smith降解和紅外光譜、核磁共振方法對其一級結(jié)構(gòu)進行分析，初步推斷P2主鏈中為α-（1→4）吡喃葡糖，并含有少量的α-（1→2）、α-（1→6）和α-（1→3）糖苷鍵。

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Separation, Purification and Structural Analysis of Polysaccharides from Spent Mushroom Substrate of Cordyceps militaris

ZHANG Ying1, ZENG Yan2, ZHANG Li-jiao2, CUI Shi-mao1, SUN Yuan-xia2,*
(1. Agricultural College, Inner Mongolia Agricultural University, Huhhot 010010, China; 2. Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308, China)

Four polysaccharides (P1, P2, P3, and P4) were prepared from the spent mushroom substrate of Cordyceps militaris after the extraction with cellulase, fractional precipitation with ethanol and deproteinization with Sevag regent. Their molecular weight distribution and monosaccharide composition were analyzed by gel chromatography and gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). The polysaccharide P2 was further purified by Superdex 200 gel-filtration column and its primary structure was studied by sodium periodate oxidation, Smith degradation, infrared spectroscopy as well as nuclear magnetic resonance. The results showed that the fractional precipitation by ethanol in combination with deprote inization by Sevag regent could provide preliminary purification for the polysaccharides, resulting in 3 relatively pure polysaccharides (P2, P3, and P4) with molecular weight of 35.9, 9.4 and 3.7 kD, respectively. The structural analysis demonstrated that P2 was a glucan with a chain mainly comprised of α-(1→4) pyran glucan. Both P3 and P4 were heteropolysaccharides consisting of mannose, galactose and glucose with glucose being the main monosaccharide.

Cordyceps militaris; polysaccharides from spent mushroom substrate; separa tion and purification; structural analysis

TQ929.2

A

1002-6630（2014）13-0054-05

10.7506/spkx1002- 6630-201413010

2013-08-08

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（863計劃）項目（2012AA021403）；天津市科技計劃項目（12ZCZDSY12800）；中國科學(xué)院重點部署項目（KSZD-EW-Z-019）

張穎（1980—），女，助理研究員，博士研究生，研究方向為食用菌栽培及其多糖結(jié)構(gòu)與功能。

E-mail：yingzhang80@126.com

*通信作者：孫媛霞（1963—），女，研究員，博士，研究方向為功能糖與天然活性物質(zhì)。E-mail：syx0430@hotmail.com