葉 雷，陳慶森*，李 偉，閻亞麗，趙 培，龐廣昌，胡志和

（天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134）

乳源酪蛋白糖巨肽對(duì)小鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群的影響

葉 雷，陳慶森*，李 偉，閻亞麗，趙 培，龐廣昌，胡志和

（天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134）

目的：酪蛋白糖巨肽（caseino-glycomacropeptide，CGMP）是κ-酪蛋白經(jīng)凝乳酶和胃蛋白酶酶解后形成的含有64個(gè)氨基酸的不同種類肽段，具有多種生物學(xué)活性和獨(dú)特的營(yíng)養(yǎng)特性，探討CGMP對(duì)小鼠外周血 T淋巴細(xì)胞亞群的影響。方法：以健康小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，利用流式細(xì)胞儀分別檢測(cè) 長(zhǎng)期和短期灌胃不同劑量的CGMP（30、60、120μg/d）后，小鼠外周血 淋巴細(xì)胞亞群的變化。結(jié)果：乳源CGMP干預(yù)后的結(jié)果表明，在短期灌胃實(shí)驗(yàn)中，灌胃不同劑量后CD3+淋巴細(xì)胞數(shù)比例均顯著降低，12h后恢復(fù)灌胃前水平；C D3+CD4+和CD3+CD8+淋巴細(xì)胞比例在灌胃30μg和120μg CGMP 4h后均顯著降低，而60μg組則無(wú)明顯變化；長(zhǎng)期灌胃實(shí)驗(yàn)中，在第2天和第4天，外周血中CD3+淋巴細(xì)胞和CD3+CD4+比例與對(duì)照組相比顯著升高（P＜0.05）；120μg/d劑量組的小鼠外周血中CD3+CD8+淋巴細(xì)胞比例與對(duì)照組相比顯著升高（P＜0.05），而30μg/d 劑量組在2、4、6、8d與對(duì)照組相比無(wú)顯著變化（P＞0.05）；在第2天，30μg/d和120μg/d劑量組外周血中CD3+CD4+/ CD3+CD8+比例與對(duì)照組 相比顯著升高（P＜0.05）。結(jié)論：乳源CGMP能夠引起正常小鼠的外周血淋巴細(xì)胞亞群發(fā)生變化，調(diào)節(jié)機(jī)體T淋巴細(xì)胞亞群的平衡，由此提示CGMP可作為功能性食品對(duì)外周血T淋巴細(xì)胞亞群的失衡有緩解作用。

酪蛋白糖巨肽；淋巴細(xì)胞亞群；CD4+細(xì)胞；CD8+細(xì)胞；功能性食品

生物活性肽（biological active peptides，BAP）是指能夠調(diào)節(jié)生物機(jī)體生命活動(dòng)或具有某些生理活性作用的，一類20種天然氨基酸以不同的組成和排列方式構(gòu)成的從二肽到復(fù)雜的線性、環(huán)形結(jié)構(gòu)的不同多肽的總稱。它們是涉及生物體內(nèi)多種細(xì)胞功 能的生物活性物質(zhì)，是機(jī)體完成分子識(shí)別、信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞分化、免疫功能及個(gè)體發(fā)育等多種復(fù)雜的生理活動(dòng)必不可少的參與者[1]。牛乳中含有豐富的蛋白質(zhì)，包括酪蛋白、乳清蛋白、乳白蛋白、乳球蛋白、乳鐵蛋白和一些具有重要生理功能的酶類，其中酪蛋白約占80%，是牛乳蛋白的主體。目前，來(lái)源于酪蛋白的生物活性肽主要有：酪啡肽（c asomorphins）、酪激肽（casokinins）、酪新素（casoxins）和來(lái)自于κ-酪蛋白的酶解產(chǎn)物酪蛋白糖巨肽（CGMP）等[2]。乳源CGMP是1965年Delfour等[3]發(fā)現(xiàn)κ-酪蛋白的特定位點(diǎn)經(jīng)凝乳酶切斷，生成可溶于三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）的部分多肽產(chǎn)物，因該多肽含有較多的糖鏈，于是被稱為糖巨肽（glycomacropeptide，GMP），而酪蛋白來(lái)源的此類肽都統(tǒng)稱為酪蛋白糖巨肽（caseino-glycomacropeptide，CGMP）。CGMP是乳清中重要的一種活性多肽，由64個(gè)氨基酸殘基組成，含有較多的BCAA（是指亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸的總和）序列，而缺少芳香族氨基酸，包括苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸。通過(guò)對(duì)CGMP的結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)糖鏈主要有以O(shè)-糖苷型結(jié)合的2種中性糖鏈和3種酸性糖鏈，90%以上的結(jié)合糖鏈都含唾液酸[4]。構(gòu)效鑒定結(jié)果顯示，如果將CGMP中的唾液酸消化掉，則許多生物學(xué)活性就會(huì)減弱或消失。到目前為止，含有乳源CGMP的功能性食品或添加劑已經(jīng)應(yīng)用到人們的生活中，日本雪印乳業(yè)株式會(huì)社開發(fā)了一種含CGMP乳制品[5]，用來(lái)促進(jìn)人體B淋巴細(xì)胞的增殖；近期的研究發(fā)現(xiàn)CGMP可用于炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）患者的保健營(yíng)養(yǎng)食品，來(lái)改善腸內(nèi)微生態(tài)平衡或調(diào)節(jié)免疫功能，從而達(dá)到治療效果[6-11]。

大量的研究報(bào)道已經(jīng)表明，生物活性肽的免疫調(diào)節(jié)作用主要有兩種方式：一種是免疫刺激活性，另一種就是調(diào)節(jié)微生態(tài)活性[12-15]。通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，CGMP確實(shí)能夠調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)區(qū)系，促進(jìn)益生菌的生長(zhǎng)，抑制有害菌，使腸道的菌群的數(shù)量和分布更加合理。T淋巴細(xì)胞主要包括CD4＋和CD8＋細(xì)胞亞群，CD3是成熟T淋巴細(xì)胞的標(biāo)志，CD4＋代表T輔助細(xì)胞，是免疫反應(yīng)的中心細(xì)胞，根據(jù)分泌細(xì)胞因子的不同，又可以分為Th1、Th2和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，當(dāng)激活后，通過(guò)分泌不同的細(xì)胞因子來(lái)調(diào)節(jié)機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫；而CD8＋淋巴細(xì)胞代表T抑制性細(xì)胞和T殺傷性細(xì)胞，是免疫反應(yīng)的效應(yīng)細(xì)胞。目前研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，CD4＋和CD8＋細(xì)胞在功能上相互協(xié)作，相互制約，維持著正常的動(dòng)態(tài)平衡，調(diào)節(jié)機(jī)體正常的免疫功能。一旦這個(gè)平衡被打破，就會(huì)導(dǎo)致機(jī)體的免疫功能紊亂而致病。例如：腹瀉型腸易激綜合癥（D-IBS）就會(huì)引起外周血中T淋巴細(xì)胞亞群的失衡，CD4+細(xì)胞和CD4+/CD8+比值顯著降低，引起免疫調(diào)節(jié)異常[16]。

目前，調(diào)節(jié)人體免疫功能的食品研發(fā)是食品行業(yè)的熱點(diǎn)之一。人們關(guān)注的焦點(diǎn)已經(jīng)轉(zhuǎn)向營(yíng)養(yǎng)免疫學(xué)領(lǐng)域[17]，特別是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)是否既具有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，也具有免疫調(diào)節(jié)功能[6,18-19]。事實(shí)證明，生物體內(nèi)和體外研究的作用機(jī)理并不相同，在體內(nèi)由于有各種消化酶和腸道微生物群系的存在，使得CGMP體內(nèi)免疫作用變得更為復(fù)雜，甚至可能得出與體外作用相反的結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)CGMP對(duì)外周血淋巴細(xì)胞亞群的影響作用，為尋找并力求開發(fā)治療機(jī)體免疫功能紊亂方面功能性食品提供科學(xué)的理論依據(jù)。綜上所述，尋找并研究一些食源性生物活性物質(zhì)，對(duì)于促進(jìn)機(jī)體內(nèi)淋巴細(xì)胞亞群的平衡，維持機(jī)體正常的免疫功能以及新藥的創(chuàng)制具有重要價(jià)值[20-22]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

7周齡昆明雌性小鼠120只，SPF級(jí)，平均體質(zhì)量為（25.53±1.65）g，購(gòu)自中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

乳源CGMP 新西蘭Tatua公司；CD3-FITC、CD4-Percp、CD8α-PE 美國(guó)Becton Dickinson公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FACSCalibur流式細(xì)胞儀 美國(guó)Becton Dickinson公司；PHS-3B pH計(jì) 上海雷磁儀器廠；3K15高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司；FA2004A電子分析天平 上海精天有限公司。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組

短期灌胃CGMP的實(shí)驗(yàn)，將24 只昆明小鼠隨機(jī)分為3 個(gè)劑量組，每組8 只，分別為30 μg組、60 μg組、120 μg組，實(shí)驗(yàn)期間小鼠自由進(jìn)食和飲水。

連續(xù)灌胃CGMP的實(shí)驗(yàn)，將小鼠隨機(jī)分為3 組，每組32 只，分別為0.9%生理鹽水對(duì)照組，30 μg/d劑量組和120 μg/d劑量組，期間各組小鼠自由進(jìn)食和飲水。

1.3.2 樣本采集

短期灌胃CGMP的研究中分別在未灌胃以及灌胃后4、8、12、24 h眼眶取血；連續(xù)灌胃CGMP的研究中分別在灌胃后2、4、6、8 d眼眶取血；將血液放入含有肝素的1 mL離心管內(nèi)，混勻，4 ℃保存。

1.3.3 三色熒光標(biāo)記

CD3-FITC、CD4-Percp單抗試劑按1∶9的比例用PBS緩沖液進(jìn)行稀釋，CD8α-PE稀釋比為1∶4；10×溶血素與蒸餾水按照1∶9的比例進(jìn)行稀釋。吸取100 μL的抗凝血加入流式管中，分別加入稀釋后的CD3-FITC、CD4-Percp、CD8α-PE單抗各5 μL；另取4 管血樣，按照相同劑量加入同型抗體和單抗組合，作為陰性對(duì)照和用于調(diào)節(jié)流式細(xì)胞儀熒光電壓。渦旋混勻，避光室溫孵育30 min。加入稀釋后的溶血素2 mL，渦旋混勻，避光孵育10 min。1 200 r/min離心5 min，棄上清，用2 mL PBS緩沖液洗滌一次，加入含1%多聚甲醛的PBS溶液0.5 mL混勻，放于4 ℃冰箱中待測(cè)。

1.3.4 流式細(xì)胞儀分析

淋巴細(xì)胞亞群用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，首先通過(guò)調(diào)整熒光電壓，使陰性群體位于散點(diǎn)圖的左下角。根據(jù)前向光（forward scatter，F(xiàn)SC）和側(cè)向光（side scatter，SSC）圈定淋巴細(xì)胞群體。其中CD3＋細(xì)胞、CD4＋細(xì)胞和CD8+細(xì)胞分別用FL1、FL2和FL3通道進(jìn)行獲取，每管獲取104個(gè)細(xì)胞。結(jié)果用CD3＋細(xì)胞、CD3＋CD4＋雙陽(yáng)性細(xì)胞和CD3＋CD8＋雙陽(yáng)性細(xì)胞分別占門內(nèi)淋巴細(xì)胞的百分比表示。利用BD CellQuest Pro數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)十字門內(nèi)細(xì)胞的比例進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用SPSS16對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和配對(duì)t檢驗(yàn)分析；P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01差異極顯著；數(shù)值利用±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群分群情況的流式細(xì)胞術(shù)分析

由圖1可知，不同劑量CGMP灌胃后CD3+CD8+雙陽(yáng)性淋巴細(xì)胞亞群和CD3+CD4+雙陽(yáng)性淋巴細(xì)胞亞群均可明顯地分群。

圖1 CGMP對(duì)小鼠外周血淋巴細(xì)胞亞群影響的流式細(xì)胞分析點(diǎn)圖Fig.1 Dot plots representing effects of CGMP on the peripheral blood lymphocytes

2.2 短期灌胃CGMP后外周血T淋巴細(xì)胞亞群的變化

2.2.1 短期灌胃不同劑量的CGMP后外周血CD3+淋巴細(xì)胞亞群的變化

圖2 不同劑量的CGMP灌胃后外周血CD3+淋巴細(xì)胞的變化Fig.2 Effect of different dosages of CGMP on CD3+ cells in peripheral blood after oral administration

由圖2可知，30 μg組在灌胃4 h后，CD3+淋巴細(xì)胞數(shù)比例顯著降低（P＜0.01），8 h后降至最低水平，12、24h CD3+淋巴細(xì)胞數(shù)比例有所回升但與灌胃前相比差異仍極顯著；60μg組在灌胃4 h后，CD3+淋巴細(xì)胞顯著減少（P＜0.05），8、12、24 h與灌胃前相比并無(wú)顯著差異；而120 μg/d組在灌胃4、8 h后CD3+淋巴細(xì)胞數(shù)量與對(duì)照組相比顯著減少（P＜0.01），12 h恢復(fù)至灌胃前水平，24 h后與灌胃前相比顯著減少（P＜0.01）。

2.2.2 短期灌胃不同劑量的CGMP后外 周血CD3+CD4+淋巴細(xì)胞的變化

圖3 不同劑量的CGMP灌胃后外周血CD3+CD4+淋巴細(xì)胞的變化Fig.3 Effect of different dosages of CGMP on CD3+CD4+ cells in peripheral blood after oral administration

由圖3可知，30 μg組在灌胃4 h后CD3＋CD4＋淋巴細(xì)胞開始顯著下降，8 h降至最低，12 h后回升至與灌胃前無(wú)顯著差異的水平，24 h后又顯著降低（P＜0.01）；60 μg組在灌胃后4、8、12、24 h CD3＋CD4＋淋巴細(xì)胞數(shù)量與灌胃前相比均沒(méi)有顯著變化；120 μg組在灌胃后4 h，CD3＋CD4＋淋巴細(xì)胞顯著降低（P＜0.01），12 h后回升至與灌胃前無(wú)顯著差異，24 h后降至最低值。

2.2.3 短期灌胃不同劑量的CGMP后外周血CD3＋CD8＋淋巴細(xì)胞的變化

圖4 不同劑量的CGMP灌胃前后24h外周血CD3+CD8+淋巴細(xì)胞的變化Fig.4 Effect of different dosages of CGMP on CD3+CD8+ cells in peripheral blood after oral administration

由圖4可知，30 μg組在灌胃4 h后，CD3+CD8+細(xì)胞比例顯著降低（P＜0.05），8 h后降至最小值，12 h后回升，與灌胃前水平差異不顯著（P＞0.05）；60 μg組在灌胃前后并無(wú)顯著差異（P＞0.05）；120 μg組在灌胃后4h外周血CD3＋CD8＋淋巴細(xì)胞數(shù)比例顯著下降（P＜0.01），隨后細(xì)胞數(shù)比例維持不變。

2.2.4 短期灌胃不同劑量的CGMP對(duì)CD3＋CD4＋/ CD3+CD8+比值的影響

圖5 不同劑量的CGMP灌胃前后24h外周血CD3+CD4+/CD3+CD8+的變化Fig.5 Effect of different dosages of CGMP on CD3+CD4+ /CD3+CD8+ in peripheral blood after oral administration

由圖5可知，所有劑量組在灌胃后4 h和8 h，與灌胃前相比CD3＋CD4＋/CD3＋CD8＋比值降低，但并無(wú)顯著性差異（P＞0.05），12 h后比值有所升高（P＞0.05），24h后又恢復(fù)到灌胃前水平。

2.3 連續(xù)灌胃CGMP后外周血T淋巴細(xì)胞亞群的變化

2.3.1 連續(xù)灌胃不同劑量CGMP后外周血CD3＋淋巴細(xì)胞亞群的變化

圖6 不同劑量組的CGMP對(duì)小鼠外周血CD3+淋巴細(xì)胞的影響Fig.6 Effects of different dosages of CGMP on peripheral blood CD3+ lymphocytes in mice

由圖6可知，在灌胃第2天和第6天，120μg/d組小鼠外周血中CD3+淋巴細(xì)胞比例與對(duì)照組相比顯著升高（P＜0.05）；30μg/d組在連續(xù)灌胃后CD3+淋巴細(xì)胞比例均無(wú)顯著變化（P＞0.05）。

2.3.2 連續(xù)灌胃不同劑量CGMP后外周血CD3+CD4+淋巴細(xì)胞的變化

由圖7可知，在第2天和第6天，120μg/d組的外周血中CD3+CD4+淋巴細(xì)胞比例與對(duì)照組相比顯著升高（P＜0.05）；30μg/d組在連續(xù)灌胃階段與對(duì)照組相比均無(wú)顯著變化（P＞0.05）。

圖7 不同劑量組的CGMP對(duì)小鼠外周血CD3+CD4+淋巴細(xì)胞的影響Fig.7 Effects of different dosages of CGMP on peripheral blood CD3+CD4+ lymphocytes in mice

2.3.3 連續(xù)灌胃不同劑量CGMP后外周血CD3+CD8+淋巴細(xì)胞的變化

圖8 不同劑量組的CGMP對(duì)小鼠外周血CD3+CD8+淋巴細(xì)胞的影響Fig.8 Effects of different dosages of CGMP on peripheral blood CD3+CD8+ lymphocytes in mice

由圖8可知，在灌胃第6天，120μg/d組外周血中CD3+CD8+淋巴細(xì)胞比例與對(duì)照組相比顯著升高（P＜0.05）；而30μg/d組在連續(xù)灌胃階段與對(duì)照組相比均無(wú)顯著變化（P＞0.05）。

2.3.4 連續(xù)灌胃不同劑量CGMP對(duì)CD3＋CD4＋/CD3＋

CD8＋比值的影響

圖9 不同劑量組的CGMP對(duì)小鼠外周血CD3+CD4+/CD3+CD8+比值的影響Fig.9 Effects of different dosages of CGMP on peripheral blood CD3+CD4+/CD3+CD8+ ratio in mice

由圖9可知，在灌胃第2天，30μg/d組和120μg/d組的小鼠外周血CD3＋CD4＋/CD3＋CD8＋比值與對(duì)照組相比均顯著升高（P＜0.05），隨后兩個(gè)劑量組小鼠外周血CD3＋CD4＋/CD3＋CD8＋比值與對(duì)照組相比均無(wú)顯著變化（P＞0.05）。

3 討 論

T淋巴細(xì)胞在機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫中起著極為重要的作用，具有免疫防御、免疫調(diào)節(jié)、免疫監(jiān)視等作用。研究資料表明，Th/Tc細(xì)胞的平衡在自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起重要作用[17,20]。CD4是T輔助/誘導(dǎo)細(xì)胞（Th/Ti）的表面標(biāo)志，CD4＋T細(xì)胞具有輔助T細(xì)胞轉(zhuǎn)變成效應(yīng)細(xì)胞、B細(xì)胞轉(zhuǎn)化成漿細(xì)胞以及活化巨噬細(xì)胞等功能，起輔助、誘導(dǎo)細(xì)胞及體液免疫的作用。CD8＋是T抑制/殺傷細(xì)胞（Ts/Tc）的表面標(biāo)志，CD8＋T細(xì)胞具有細(xì)胞毒效應(yīng)，它能抑制T細(xì)胞活化、抑制B細(xì)胞產(chǎn)生抗體，起抑制細(xì)胞及體液免疫的作用。Th細(xì)胞是機(jī)體免疫應(yīng)答的中心細(xì)胞，CD4＋/CD8＋T（Th/Tc）比例變化反應(yīng)機(jī)體的免疫功能狀況，比例升高表明免疫功能亢進(jìn)，比例降低表明免疫功能低下。T淋巴細(xì)胞亞群之間相互調(diào)節(jié)，在正常的生理狀態(tài)，CD3＋CD4＋/CD3＋CD8＋值相對(duì)穩(wěn)定，維持機(jī)體的正常免疫功能。醫(yī)學(xué)上T淋巴細(xì)胞亞群的測(cè)定是檢測(cè)機(jī)體細(xì)胞免疫功能的重要指標(biāo)。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)登革熱病毒感染者、冠心病患者、乙肝患者、胃癌患者等的外周血T淋巴細(xì)胞亞群都會(huì)發(fā)生異常。幾種血液病患者的T淋巴細(xì)胞亞群的測(cè)定結(jié)果表明，原發(fā)性粒細(xì)胞減少癥患者的T細(xì)胞亞群分布具有明顯的不均一性，主要為CD4＋細(xì)胞比例減少，CD8＋細(xì)胞比例增多[6]。

本實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)灌胃不同劑 量的CGMP后，通過(guò)在一天內(nèi)不同的時(shí)間點(diǎn)來(lái)檢測(cè)T淋巴細(xì)胞亞群的變化趨勢(shì)，盡管60μg的劑量不能夠引起CD4＋，CD8＋淋巴細(xì)胞的顯著變化，但低、高劑量CGMP4h后都能引起CD4＋、CD8＋淋巴細(xì)胞比例的顯著降低，12h后回升至灌胃前水平，與灌胃前相比差異不顯著（P＞0.05）；灌胃后一天內(nèi)不同階段CD4＋/CD8＋比值有所波動(dòng)，但是與灌胃前相比，差異不顯著（P＞0.05）；提示若引起CD4＋/CD8＋比例發(fā)生顯著變化，需要進(jìn)行延長(zhǎng)灌胃時(shí)間或者增加灌胃劑量，該現(xiàn)象需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。研究發(fā)現(xiàn)灌胃CGMP 4h就會(huì)引起正常小鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群顯著減少，因?yàn)槎唐趦?nèi)淋巴細(xì)胞增殖很少，可能原因是灌胃CGMP后，作為外來(lái)抗原的CGMP，引起腸道黏膜局部免疫，使外周血中的T淋巴細(xì)胞向外周免疫器官遷移，即淋巴細(xì)胞歸巢（lymphocyte homing），外周血中的T淋巴細(xì)胞選擇性的穿越毛細(xì)血管后微靜脈（HEV），向外周淋巴器官定向遷移，造成外周血中T淋巴細(xì)胞減少。體內(nèi)的淋巴細(xì)胞處于動(dòng)態(tài)循環(huán)狀態(tài)，由血液進(jìn)入組織，再?gòu)慕M織進(jìn)入血液；本實(shí)驗(yàn)室前期的研究結(jié)果顯示，CGMP作為抗原通過(guò)腸相關(guān)淋巴組織和血液循環(huán)進(jìn)入脾臟從而促進(jìn)脾臟和PP結(jié)以及MLN中CD3＋和CD3＋CD4＋、CD3＋CD8＋細(xì)胞的顯著增加[22]，這與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果和推斷相一致。因此，CGMP灌胃后，短期內(nèi)會(huì)引起外周血中淋巴細(xì)胞數(shù)量的減少；隨后，由于淋巴細(xì)胞的再循環(huán)，抗原刺激T淋巴細(xì)胞分化、增殖，使得外周血中T淋巴細(xì)胞亞群比例回升至正常水平。當(dāng)連續(xù)灌胃CGMP 2、4、6、8d的結(jié)果表明，到第2天，外周血T淋巴細(xì)胞亞群顯著升高，CD3＋CD4＋/CD3＋CD8＋的比值增加。這說(shuō)明CGMP對(duì)小鼠T細(xì)胞功能具有增強(qiáng)作用，隨著天數(shù)的增加，淋巴細(xì)胞亞群的平衡逐漸趨于正常。因此該結(jié)果提示，如果連續(xù)給T淋巴細(xì)胞亞群失衡的模型小鼠灌胃CGMP，可能會(huì)促進(jìn)外周血中CD3＋CD4＋/CD3＋CD8＋的比值處于正常的水平，但尚需進(jìn)一步的研究驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用口服CGMP干預(yù)健康小鼠的方法，流式細(xì)胞術(shù)分析短期和連續(xù)干預(yù)后對(duì)外周血T淋巴細(xì)胞亞群的變化，發(fā)現(xiàn)乳源CGMP能夠引起正常小鼠的外周血淋巴細(xì)胞亞群的變化，根據(jù)CGMP對(duì)外周血中T淋巴細(xì)胞亞群的影響，可以推斷出CGMP能夠改善免疫功能異常引起的疾病，調(diào)節(jié)機(jī)體T淋巴細(xì)胞亞群的平衡作用。如：腹瀉型腸易激綜合征或炎癥性腸病患者外周血中CD4＋細(xì)胞和CD4＋/CD8＋比值顯著降低。因此，CGMP可能對(duì)外周血T淋巴細(xì)胞亞群的失衡有緩解作用。

[1] GAUTHIER S F, POULIOT Y, SAINT-SAUVEUR D. Immunomodulatory peptides obtained by the enzymatic hydrolysis of whey proteins[J]. International Dairy Journal, 2006, 16(11): 1315-1323.

[2] 徐靜波, 張建友, 孫培龍. 乳蛋白源生物活性肽的研究現(xiàn)狀[J]. 中國(guó)釀造, 2007, 26(7): 8-11.

[3] DELFOUR A, JOLLES J, ALAIS C, et al. Caseino-glycopeptides: characterization of a methionine residue and of the N-terminal sequence[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 1965, 19(4): 452-455.

[4] 吳疆, 龐廣昌, 凌雪萍. 酪蛋白巨肽的生物特性及應(yīng)用前景[J]. 食品研究與開發(fā), 2003, 24(4): 9-11.

[5] Snow Brand Milk Products company. Human normal B lymphocyte accelerating agent: Japan, 96018997[P]. 1996.

[6] DEWITT R C, KUDSK K A. The gut’s role in metabolism, mucosal barrier function, and gut immunology[J]. Infectious Disease Clinics of North America, 1999, 13(2): 465-481.

[7] 賈玉臣, 陳慶森. 乳源酪蛋白糖巨肽改善小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的研究[J].食品科學(xué), 2010, 31(21): 365-368.

[8] 賈玉臣, 陳慶森, 馮毅楠, 等. 乳源酪蛋白糖巨肽對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠MUC2表達(dá)的影響[J]. 食品科學(xué), 2011, 32(15): 230-233.

[9] 王華, 陳慶森. 乳源酪蛋白糖巨肽抗細(xì)胞凋亡干預(yù)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎效應(yīng)研究[J]. 食品科學(xué), 2012, 33(1): 230-234.

[10] CHEN Q, WANG H, ZHU C, et al. Anti-apoptotic effects of milkderived casein glycomacropeptide on mice with ulcerative colitis[J]. Food and Agricultural Immunology, 2013: 1-14. doi:10.1080/0954010 5.2013.823912.

[11] 梁美艷, 陳慶森. 具有降低心血管疾病危險(xiǎn)的相關(guān)生物活性肽的研究現(xiàn)狀[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(19): 335-340.

[12] 龐廣昌. 食品免疫論-關(guān)于胃腸黏膜免疫和細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的科學(xué)[M].北京: 科學(xué)出版社, 2008: 70-71.

[13] BISWAS A, PETNICKI-OCWIEJA T, KOBAYASHI K S. Nod2: a key regulator linking microbiota to intestinal mucosal immunity[J]. Journal of Molecular Medicine, 2012, 90(1): 15-24.

[14] 曹晉宜, 陳慶森, 梁晨曦, 等. 酪蛋白糖巨肽 (CGMP) 對(duì)小鼠盲腸中微生物區(qū)系的影響[J]. 食品科學(xué), 2008, 29(10): 582-585.

[15] 任效東, 陳慶森, 李俊潔, 等. 酪蛋白糖巨肽和乳鐵蛋白灌胃對(duì)小鼠腸道微生物定殖抗力的影響[J]. 食品科學(xué), 2013, 34(9): 282-286.

[16] JIN H B, GU Z Y, ZHAO H W, et al. T lymphocyte subgroups and serum levels of trace elements in patients with diarrhea type of irritable bowel syndrome[J]. Journal of Zhejiang University: Medical Sciences, 2008, 37(6): 634-637.

[17] OWENS B M J, SIMMONS A. Intestinal stromal cells in mucosal immunity and homeostasis[J]. Mucosal Immunology, 2013, 6(2): 224-234.

[18] HANSON L A, KOROTKOVA M, TELEMO E. Human milk: its components and their immunobiologic functions[J]. Mucosal Immunology, 2005: 1795-1827.

[19] CALDER P C, KEW S. The immune system: a target for functional foods[J]. British Journal of Nutrition, 2002, 88(2): 165-176.

[20] CHO J H. The genetics and immunopathogenesis of inflammatory bowel disease[J]. Nature Reviews Immunology, 2008, 8(6): 458-466.

[21] NEPOM G T. Mucosal matters[J]. Nature Reviews Immunology, 2008, 8(6): 409-409.

[22] 李偉, 陳慶森. 酪蛋白糖巨肽對(duì)小鼠腸道免疫系統(tǒng)的影響[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(15): 240-243.

Effect of Milk-De rived Casein-G lycomacropeptide on Peripheral Blo od T Lympho cyte Subsets in Mice

YE Lei, CHEN Qing-sen*, LI Wei, YAN Ya-li, ZHAO Pei, PANG Gua ng-chang, HU Zhi-he
(Tianjin Key Laboratory of Fo od Biotechnology, College of Biotechnology and Food S cience, Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China)

Objective: Casein glycomacropeptide (CGMP) is a kind of peptide containing 64 amino acid residues, which has many physiological functions and unique nutritional properties. This study aimed to explore its effects on peripheral blood lymphocyte subsets in mice. Methods: After being by gavage given different doses of CGMP (30, 60, and 120 μg/d), healthy mice were tested for the changes of the peripheral blood lymphocyte by flow cytometry. Results: In the short-term gavage experiment, CGMP resulted in a significant decrease in the proporti on of CD3+, and after 12 h, it recovered to the level before oral administration; CGMP at 30 and 120 μg/d resulted in a significant decrease in the proportions of CD3+CD4+ lymphocytes and CD3+CD8+ lymphocytes in peri pheral blood after 4 h, while CGMP at 60 μg/d resulted in no significant change. In the long-term gavage experiment, CGMP resulted in a significant increase in CD3+ lymphocytes and CD3+CD4+ lymphocytes in peripheral blood at days 2 an d 4 (P ＜ 0.05). Com pared with the control group, CGMP at 120 μg/d resulted in a significant increase in CD3+CD8+ lymphocytes in peripheral blood (P ＜ 0.05), but at 30 μg/d caused no significant increase (P ＞ 0.05). Moreover, at day 2, CGMP at the two dosages resulted in a significant increase in CD3+CD4+/ CD3+CD8+ in peripheral blood (P ＜ 0.05). Conclusion: CGMP can cause peripheral blood lymphocyte subsets to change in mice, and regulate the balance of T lymphocyte subse ts in peripheral blood. Therefore, CGMP can be used as a functional food to relieve the imbalance of T lymphocyte in p eripheral blood.

case in glycomacropeptide (CGMP); lymphocyte subse ts; CD4+ cells; CD8+ cells; func tional food

TS201.4

A

1002-6630（2014）11-0209-06

10.7506/spkx1002-6630-201411042

2014-02-09

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（30771524；31071522）

葉雷（1989—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)樯锘钚晕镔|(zhì)與腸道健康。E-mail：yelei20081020@126.com

*通信作者：陳慶森（1957—），男，教授，碩士，研究方向?yàn)槭吃葱陨锘钚晕镔|(zhì)與腸道健康，蛋白質(zhì)（酶）資源。E-mail：chqsen@tjcu.edu.cn