劉沛毅，鄧澤元，楊建遠(yuǎn)，李 靜*

（南昌大學(xué)高等研究院，食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047）

粗壯脈紋胞菌復(fù)合多菌種發(fā)酵茶粕產(chǎn)纖維素酶的研究

劉沛毅，鄧澤元，楊建遠(yuǎn)，李 靜*

（南昌大學(xué)高等研究院，食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047）

用粗壯脈紋胞菌分別復(fù)合東方伊莎酵母、里氏木霉、綠色木霉、乳酸桿菌固態(tài)發(fā)酵已去除茶皂素的茶粕，通過(guò)測(cè)定發(fā)酵產(chǎn)物中3種纖維素酶：外切葡聚糖酶（C1）、內(nèi)切葡聚糖酶（Cx）、β-葡萄糖苷酶（β-G）及總酶濾紙酶（filter paper activity，F(xiàn)PA）的酶活力來(lái)探討其分解粗纖維素的協(xié)同作用。粗壯脈紋胞菌和綠色木霉混合發(fā)酵產(chǎn)生的C1酶酶活力較粗壯脈紋胞菌單菌發(fā)酵提高了51.09%，粗壯脈紋胞菌和綠色木霉復(fù)合發(fā)酵較單菌發(fā)酵延長(zhǎng)了其纖維素酶分泌的周期，96 h時(shí)FPA酶活力達(dá)到2.782 U/g；粗壯脈紋胞菌復(fù)合里氏木霉、綠色木霉混合發(fā)酵組在發(fā)酵10 d后對(duì)茶粕粗纖維的最終降解率分別達(dá)到了64.19%和61.59%；接種量對(duì)單菌和混合菌發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶影響總體趨勢(shì)是隨著接種量增加酶活力提高，但粗壯脈紋胞菌單菌發(fā)酵纖維素酶酶活力在接種量超過(guò)9 mL/100 g后開(kāi)始下降。表明粗壯脈紋胞菌復(fù)合里氏木霉、綠色木霉混合發(fā)酵降解纖維素具有協(xié)同作用。

粗壯脈紋胞菌；纖維素酶；混合菌發(fā)酵；固態(tài)發(fā)酵；茶粕

近年來(lái)，隨著我國(guó)農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，大量的各類農(nóng)產(chǎn)品加工廢棄物堆積，如何高效利用農(nóng)副產(chǎn)品成為研究熱點(diǎn)。茶粕是油茶籽經(jīng)過(guò)壓榨提取茶油后剩下的殘?jiān)?，約為油茶籽質(zhì)量的65%，是茶油生產(chǎn)過(guò)程中的一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高的榨油工業(yè)副產(chǎn)品。我國(guó)年產(chǎn)茶油約15萬(wàn)t，茶籽粕約50萬(wàn)t[1]。由于茶粕含較高濃度的茶皂素、味苦，所以基本上用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的清塘劑和肥料，沒(méi)有高值化利用，造成了很大的資源浪費(fèi)。由于茶皂素具有較大的抑菌作用[2-3]，若利用微生物對(duì)茶粕進(jìn)行發(fā)酵，須先將茶粕中的抑菌性物質(zhì)茶皂素去除。因此，本實(shí)驗(yàn)采用實(shí)驗(yàn)室超聲波提取茶皂素專利技術(shù)將茶粕中的茶皂素去除；提取茶皂素后的茶粕，可溶性糖、蛋白質(zhì)和礦物元素含量都較豐富[4]，可作為動(dòng)物飼料或食品的良好原料，但其含較高的纖維素，通過(guò)高產(chǎn)纖維素酶的微生物生長(zhǎng)，降解纖維素，可大大提高其利用價(jià)值。

降解纖維素需要3種酶如內(nèi)切、外切和/或β-糖苷酶的密切配合。自然界很難通過(guò)一種菌將纖維素徹底降解為纖維二糖或單糖，因此常采用產(chǎn)不同纖維素酶的復(fù)合菌進(jìn)行降解?；旌暇腆w發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶在菌株的選擇上，通常采用的是真菌，包括部分腐生菌、反芻動(dòng)物瘤胃菌、青霉屬等，例如，當(dāng)曲霉和酵母進(jìn)行聯(lián)合發(fā)酵時(shí)，曲霉屬菌株常選用木霉，酵母則可用產(chǎn)朊假絲酵母[5]。本課題組篩選的粗壯脈紋胞菌（Neurospora crassa）所產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶活性較高[6]，綠色木霉、里氏木霉產(chǎn)外切葡聚糖酶酶活力較高，在發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶酶系上可以互補(bǔ)，使所產(chǎn)纖維素酶體系較全面，且它們均為絲狀真菌，適合固態(tài)發(fā)酵[7-8]。乳酸桿菌可以利用上述菌分解的低聚糖或纖維二糖，而產(chǎn)生有益動(dòng)物健康的變化[9]，酵母菌與產(chǎn)纖維素酶菌多是共生和互生關(guān)系[10]。此外，有報(bào)道稱固態(tài)發(fā)酵農(nóng)副產(chǎn)品產(chǎn)纖維素酶的效果要優(yōu)于液體發(fā)酵，所產(chǎn)酶系也較液體發(fā)酵更全面，固態(tài)發(fā)酵更適合產(chǎn)纖維素酶的絲狀真菌的生長(zhǎng)[11]。因此，本研究試圖通過(guò)發(fā)酵過(guò)程中各纖維素酶活性的變化、發(fā)酵前后各粗纖維素組分的變化，篩選能與粗壯脈紋胞菌復(fù)合共生或協(xié)同作用的多種菌種，以降解茶粕中的纖維素來(lái)提高其利用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與菌種

茶粕由江西省綠源油脂有限公司提供，原料粉碎過(guò)40目篩。

粗壯脈紋胞菌（Neurospora crassa）、東方伊莎酵母菌（Issatchenkia oriental）、乳酸桿菌（NCU116）和綠色木霉（Trichoderma vivide） 本實(shí)驗(yàn)室篩選并保藏；里氏木霉（CICC 13052） 國(guó)家工業(yè)微生物菌種保藏中心。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 液體種子培養(yǎng)基

東方伊莎酵母培養(yǎng)基：酵母浸粉0.5g/L、葡萄糖2g/L、蛋白胨1 g/L。

綠色木霉培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉7.5 g/L、蛋白胨5 g/L、CaCl20.3 g/L、KH2PO44 g/L、MgSO40.3 g/L，pH值自然。

里氏木霉培養(yǎng)基：可溶性淀粉10 g/L、葡萄糖10 g/L、蛋白胨10 g/L、(NH4)2SO42 g/L、KH2PO43 g/L、MgSO45 g/L、CaCO35 g/L。

MRS培養(yǎng)基，用于乳酸桿菌培養(yǎng)。

Mandel Weber營(yíng)養(yǎng)液[13]：（NH4）2SO41.4 g/L、KH2PO42.0 g/L、CaCl2·2H2O 0.3 g/L、MgSO4·7H2O 0.3 g/L、FeSO4·7H2O 5.0 mg/L、MnSO4·H2O 1.6 mg/L、ZnSO41.4 mg/L、CoCl2·6H2O 2.0 mg/L、蛋白胨0.1 g/L、吐溫-80 0.1 g/L。

1.2.2 固體種子培養(yǎng)基

取10g純豆渣，25mL無(wú)菌水，用于粗壯脈紋胞菌培養(yǎng)。

1.3 試劑與儀器

微晶纖維素、纖維二糖 美國(guó)Aladdin公司；羧甲基纖維素鈉 廣東西隴化工有限公司。

DFT-200粉碎機(jī) 溫嶺市大德中藥機(jī)械有限公司；KL-UP-III-10超純水制備機(jī) 臺(tái)灣艾柯（成都）實(shí)驗(yàn)專業(yè)純水設(shè)備廠；HG101-5型電熱鼓風(fēng)干燥箱 南京實(shí)驗(yàn)儀器廠；RE52-99型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；DSX-280B型不銹鋼手提式滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；HD-650桌上型超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；HWS-150型恒溫恒濕培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；PHS-2酸度計(jì) 上海雷磁儀器廠；15R型高速冷凍離心機(jī) 江西省立康科技公司；SJC-Ⅱ多功能溢流循環(huán)超聲波生物萃取儀 無(wú)錫市上佳生物科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 茶粕中茶皂素殘留率的測(cè)定

采用本課題組超聲波提取茶皂素專利技術(shù)（公開(kāi)號(hào)CN101289473A），采用香草醛硫酸法[12]對(duì)提取茶皂素后的茶粕進(jìn)行殘留茶皂素量的測(cè)定，計(jì)算出其茶皂素殘留率。

1.4.2 種子培養(yǎng)

分別取100 mL上述液體種子培養(yǎng)基置于250 mL錐形瓶中，將經(jīng)活化的綠色木霉、里氏木霉和東方伊莎酵母分別接種至錐形瓶中，28℃恒溫振蕩（180 r/min）培養(yǎng)，綠色木霉和里氏木霉培養(yǎng)時(shí)間為48 h，酵母菌培養(yǎng)時(shí)間為24 h，乳酸桿菌于28℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 h；取10 g豆渣置于250 mL的發(fā)酵瓶中，接種粗壯脈紋胞菌，加入25 mL無(wú)菌水，30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，取孢子配成約1×108CFU/mL的孢子懸浮液，備用。

1.4.3 混合菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶

將10g經(jīng)過(guò)預(yù)處理的茶粕置于250mL發(fā)酵瓶中，加入9mL Mandel Weber營(yíng)養(yǎng)液，保持總接種量10mL/100g，粗壯脈紋胞菌與各菌種接種量體積之比均為2∶1，30℃恒溫培養(yǎng)，控制相對(duì)濕度70%，研究不同發(fā)酵時(shí)間48、60、72、84、96h對(duì)各種纖維素酶酶活性的影響。此外選擇發(fā)酵96h，改變菌種接種量，研究當(dāng)粗壯脈紋胞菌和復(fù)合菌接種量為3、6、9、12 mL/100 g時(shí)對(duì)各種纖維素酶酶活性的影響。

1.4.4 粗酶液的提取

稱取發(fā)酵培養(yǎng)物1g，加入0.1mol/L HAc-NaAc（pH 5.2）緩沖液20 mL，加入玻璃珠，30℃搖床上振蕩提取1 h。4℃離心，取上清液（即為粗酶液），備用。

1.4.5 纖維素酶的測(cè)定[14-15]

還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線：取0.125 g葡萄糖溶于250 mL蒸餾水中，配成0.5 g/L的葡萄糖溶液，再分別取0、5、10、15、20、25 mL 0.5 g/L葡萄糖溶液于25 mL的容量瓶，定容后各取1 mL，加2.5 mL 3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）試劑，5 min沸水浴后立即流水冷卻，加水至5 mL，于550 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

1.4.5.1 濾紙酶（filter paper activity，F(xiàn)PA）酶活力

向試管中各加入1 cm×6 cm的Whatman No.1定性濾紙，2 mL酶液在50℃水浴中保溫30 min，取出后立即加入2.5 mL DNS試劑終止反應(yīng)。加熱、檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液定容5 mL，在550 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

1.4.5.2 外切葡聚糖酶（C1）酶活力

取0.5 mL粗酶液，加入10 mg微晶纖維素，50℃水浴中反應(yīng)30 min后，加入2.5 mL DNS沸水浴5 min終止反應(yīng)，檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液定容5.0 mL，在550 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

1.4.5.3 內(nèi)切葡聚糖酶（Cx）酶活力

取0.5 mL粗酶液，加入1.5 mL 1 g/100 mL羧甲基纖維素鈉鹽溶液，50℃水浴中反應(yīng)30 min后，加入2.5 mL DNS沸水浴5 min終止反應(yīng)，如上法測(cè)定吸光度。

1.4.5.4 β-葡萄糖苷酶（β-G）酶活力

取0.5 mL適當(dāng)稀釋的粗酶液，加入1.0 mL 15.0 mmol/L纖維二糖溶液，50℃水浴中反應(yīng)30 min后，加入2.5 mL DNS沸水浴5 min終止反應(yīng)。如上法測(cè)定吸光度。

上述4種酶的酶活力單位定義：在50℃、pH 5.2，恒溫30 min的條件下，以反應(yīng)中1 min水解底物形成1 μmol葡萄糖的酶量為一個(gè)酶活力單位，換算成每克干物料含有的酶活力，用U/g表示[16]。

1.4.6 粗纖維素組分的測(cè)定

將10 g經(jīng)過(guò)預(yù)處理的茶粕置于250 mL發(fā)酵瓶中，加入9 mL Mandel Weber營(yíng)養(yǎng)液，保持總接種量10 mL/100 g，各菌種與粗壯脈紋胞菌接種體積比均為2∶1，在經(jīng)過(guò)96 h發(fā)酵后，用Soest法[17]測(cè)定各實(shí)驗(yàn)組及原料中各粗纖維組分的含量，探尋纖維素酶酶活力與不同種類纖維素降解的關(guān)聯(lián)。

1.4.7 原料與發(fā)酵產(chǎn)物中粗纖維含量的測(cè)定

將10 g經(jīng)過(guò)預(yù)處理的茶粕置于250 mL發(fā)酵瓶中，加入9 mL Mandel Weber營(yíng)養(yǎng)液，保持總接種量10 mL/100 g，各菌種與粗壯脈紋胞菌接種體積比均為2∶1，在經(jīng)過(guò)10 d發(fā)酵后，測(cè)定各組復(fù)合菌培養(yǎng)基中粗纖維含量（GB/T 6434—2006《飼料中粗纖維測(cè)定方法》），以期得到對(duì)茶粕纖維素降解效果最佳的復(fù)合菌搭配。

1.4.8 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為了證實(shí)乳酸桿菌和酵母菌對(duì)粗壯脈紋胞菌產(chǎn)纖維素酶的影響是由其次級(jí)代謝產(chǎn)物造成的，本研究設(shè)計(jì)以下驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

1.4.8.1 乳酸桿菌復(fù)合厭氧實(shí)驗(yàn)

將10 g經(jīng)過(guò)預(yù)處理的茶粕置于250 mL發(fā)酵瓶中，加入9 mL Mandel Weber營(yíng)養(yǎng)液，接種6 mL/100 g的粗壯脈紋胞菌，發(fā)酵72 h后接種3 mL/100 g，經(jīng)過(guò)28℃恒溫培養(yǎng)72 h的乳酸桿菌，放置無(wú)氧環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，測(cè)定各纖維素酶酶活力。

1.4.8.2 酵母菌復(fù)合實(shí)驗(yàn)

將10 g經(jīng)過(guò)預(yù)處理的茶粕置于250 mL發(fā)酵瓶中，加入9 mL Mandel Weber 營(yíng)養(yǎng)液，接種6 mL/100 g的粗壯脈紋胞菌，發(fā)酵72 h后接種3 mL/100 g的同樣經(jīng)過(guò)72 h培養(yǎng)的東方伊莎酵母，28℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，測(cè)定各纖維素酶酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶皂素殘留率

經(jīng)過(guò)超聲波提取后的茶粕中茶皂素的殘留率達(dá)到0.917%，對(duì)微生物正常生長(zhǎng)沒(méi)有影響[18]。

2.2 復(fù)合菌發(fā)酵中纖維素酶的酶活力

2.2.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)纖維素酶活力的影響

圖1 各種菌在不同復(fù)合方式下的發(fā)酵時(shí)間對(duì)纖維素酶活力的影響Fig.1 Effect of fermentation time on the cellulose activities

各種菌不同復(fù)合方式在不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)纖維素酶酶活力的影響結(jié)果見(jiàn)圖1。發(fā)酵時(shí)間對(duì)混合菌發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶影響較大。粗壯脈紋胞菌單菌發(fā)酵各纖維素酶酶活力隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而提高，其總酶活力（FPA）、內(nèi)切酶（Cx）及β-糖苷酶（β-G）在72～84 h時(shí)間段中酶活力迅速上升并達(dá)到峰值（分別為2.980、16.588、8.438 U/g），且均高于其他實(shí)驗(yàn)組；里氏木霉+粗壯脈紋胞菌復(fù)合發(fā)酵組與粗壯脈紋胞菌+綠色木霉復(fù)合發(fā)酵組96h后4種纖維素酶酶活力仍處于上升趨勢(shì)，在粗壯脈紋胞菌+綠色木霉復(fù)合發(fā)酵組中C1酶的酶活力最高值出現(xiàn)在96h，達(dá)到16.688U/g，Cx酶的酶活力在96 h為15.548 U/g，超過(guò)同時(shí)期粗壯脈紋胞菌單菌發(fā)酵組。酵母菌和乳酸桿菌對(duì)粗壯脈紋胞菌發(fā)酵茶粕產(chǎn)纖維素酶有一定的抑制作用，各酶活在各個(gè)發(fā)酵時(shí)間段相比于粗壯脈紋胞菌單菌發(fā)酵均有較大幅度的下降，這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組中各纖維素酶酶活總體趨勢(shì)是先升后降，基本上與粗壯脈紋胞菌單菌發(fā)酵同步。

2.2.2 各種復(fù)合菌接種量對(duì)纖維素酶活力的影響

圖2 各種菌不同復(fù)合方式的接種量對(duì)各纖維素酶活力的影響Fig.2 Effects of inoculum size on the cellulose activities

各菌種不同復(fù)合方式在不同接種量時(shí)發(fā)酵96h后，纖維素酶測(cè)定結(jié)果如圖2所示。各實(shí)驗(yàn)組中各種纖維素酶酶活基本上都隨著接種量的增加而提高，粗壯脈紋胞菌單菌發(fā)酵組中當(dāng)接種量從9 mL/100 g增加至12 mL/100 g時(shí)，總酶酶活力（FPA）和C1酶酶活力都有一定程度的下降，分別從2.587 U/g和11.141 U/g下降至2.536 U/g和10.612 U/g。粗壯脈紋胞菌+綠色木霉復(fù)合發(fā)酵組和粗壯脈紋胞菌+里氏木霉復(fù)合發(fā)酵組在接種量達(dá)到12 mL/100 g時(shí)各纖維素酶酶活力均到達(dá)最高值，其中FPA酶、C1酶酶活力超過(guò)粗壯脈紋胞菌單菌相應(yīng)接種量的酶活力，分別為2.881、2.979 U/g和17.033、16.965 U/g。

2.3 原料與發(fā)酵產(chǎn)物纖維素組分含量的對(duì)比

表1 不同復(fù)合菌發(fā)酵對(duì)產(chǎn)物粗纖維素各種組分的影響Table 1 Effect of single- and mixed-strain fermentation on lignin, cellulose and hemicelluloses in tea seed cake

由表1可知，粗壯脈紋胞菌單菌發(fā)酵對(duì)半纖維素降解效果比其他混合菌種發(fā)酵組要好，降解率達(dá)到45.05%，可能是由于半纖維素對(duì)粗壯脈紋胞菌產(chǎn)纖維素酶有一定的底物誘導(dǎo)作用或是粗壯脈紋胞菌所產(chǎn)纖維素酶酶系對(duì)半纖維素有特異性[19]；東方伊莎酵母、綠色木霉、里氏木霉與粗壯脈紋胞菌復(fù)合發(fā)酵降解纖維素的能力均較粗壯脈紋胞菌單菌發(fā)酵高，可能是復(fù)合菌C1酶酶活力相比于粗壯脈紋胞菌單菌發(fā)酵有所提高，纖維素酶酶系更加完整，微生物菌群結(jié)構(gòu)更合理等；由于該實(shí)驗(yàn)所選用的不是產(chǎn)木質(zhì)素酶顯著的微生物，所以各實(shí)驗(yàn)組對(duì)木質(zhì)素的降解效果均不理想，最好的是粗壯脈紋胞菌+里氏木霉復(fù)合發(fā)酵組，木質(zhì)素含量從6.85%下降至5.30%。

2.4 原料與發(fā)酵產(chǎn)物粗纖維含量對(duì)比

表2 原料與發(fā)酵產(chǎn)物粗纖維含量的對(duì)比Table 2 Comparison of cellulose content between raw and fermented materials

由表2可知，粗壯脈紋胞菌和里氏木霉復(fù)合發(fā)酵組對(duì)茶粕中粗纖維降解效果最明顯，粗纖維降解率達(dá)到64.19%，其次是粗壯脈紋胞菌和綠色木霉發(fā)酵組、粗壯脈紋胞菌單菌發(fā)酵組、粗壯脈紋胞菌+東方伊莎酵母菌組，粗壯脈紋胞菌+乳酸桿菌組降解粗纖維效果最差。

2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5.1 乳酸桿菌復(fù)合粗壯脈紋胞菌厭氧發(fā)酵對(duì)產(chǎn)纖維素酶的影響

圖3 乳酸桿菌復(fù)合粗壯脈紋胞菌對(duì)產(chǎn)纖維素酶酶活力的影響Fig.3 Effect of co-fermentation with L. plantarum and Neurospora crassa on the cellulase activities

由圖1、3可知，48～72 h時(shí)間段，粗壯脈紋胞菌產(chǎn)纖維素酶酶活力正常，上升趨勢(shì)明顯，在72 h加入乳酸桿菌后，本應(yīng)處于快速增長(zhǎng)期的各纖維素酶酶活力卻在這時(shí)大幅下降，培養(yǎng)96 h后Cx酶活力相比于粗壯脈紋胞菌單菌發(fā)酵的同期下降了66.11%，其酶活變化趨勢(shì)與之前實(shí)驗(yàn)結(jié)果契合。乳酸桿菌對(duì)粗壯脈紋胞菌產(chǎn)纖維素酶有抑制作用。

2.5.2 東方伊莎酵母復(fù)合粗壯脈胞菌發(fā)酵對(duì)產(chǎn)纖維素酶的影響

圖4 東方伊莎酵母復(fù)合粗壯脈紋胞菌對(duì)產(chǎn)纖維素酶酶活力的影響Fig.4 Effect of co-fermentation with Issatchenkia oriental and Neurospora crassa on the cellulase activities

由圖4可知，F(xiàn)PA、Cx和C1這3種酶活均在接種東方伊莎酵母后開(kāi)始下降，且下降幅度較圖1中更為明顯。此外，發(fā)酵96 h后產(chǎn)物中酒精度達(dá)3.2 mL/100 g。β-糖苷酶下降趨勢(shì)較平緩，可能是由于乙醇不是其主要的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的緣故。

3 結(jié)論與討論

3.1 單菌發(fā)酵和混合菌發(fā)酵所產(chǎn)纖維素酶酶活力的變化

本實(shí)驗(yàn)的目的是尋找能與粗壯脈紋胞菌協(xié)同降解纖維素或?qū)Υ謮衙}紋胞菌生長(zhǎng)有促進(jìn)作用的復(fù)合菌，以便提高農(nóng)副產(chǎn)物的利用價(jià)值。由于粗壯脈紋胞菌自身所產(chǎn)纖維素酶中Cx酶活力較高，而里氏木霉和綠色木霉產(chǎn)C1酶活力較高[20-21]，但其相對(duì)于粗壯脈紋胞菌產(chǎn)酶高峰來(lái)的較晚，產(chǎn)酶周期長(zhǎng)。粗壯脈紋胞菌單菌發(fā)酵達(dá)到產(chǎn)酶高峰一般在發(fā)酵后的60～84 h，而其與綠色木霉或里氏木霉復(fù)合后，產(chǎn)酶高峰出現(xiàn)延后，一般在96 h才達(dá)到較高水平。發(fā)酵84h時(shí)，粗壯脈紋胞菌單菌發(fā)酵的Cx（16.588U/g）、FPA（2.980U/g）、β-G（8.438U/g）酶活力均高于各復(fù)合菌發(fā)酵，但發(fā)酵96h后，粗壯脈紋胞菌單菌產(chǎn)各種纖維素酶酶活力均降低Cx（15.111U/g）、FPA（2.547U/g）、β-G（8.222 U/g），而各復(fù)合菌發(fā)酵產(chǎn)各纖維素酶酶活力保持增勢(shì)，粗壯脈紋胞菌+綠色木霉復(fù)合發(fā)酵組的C1酶活力在96 h達(dá)到了16.688 U/g（84 h時(shí)為13.125 U/g）。結(jié)合粗纖維素降解數(shù)據(jù)，經(jīng)過(guò)10 d充分發(fā)酵后，本實(shí)驗(yàn)觀察到菌體基本停止生長(zhǎng)，這時(shí)基料中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)基本上利用完全，粗壯脈紋胞菌+里氏木霉組和粗壯脈紋胞菌+綠色木霉組對(duì)茶粕中粗纖維的降解效果更好、更徹底。這可能是由于里氏木霉和綠色木霉的產(chǎn)酶周期長(zhǎng)，C1酶活力較高（與Cx酶活基本一致），正好互補(bǔ)了粗壯脈紋胞菌所產(chǎn)C1酶活力較低這一不足。粗壯脈紋胞菌+里氏木霉組和粗壯脈紋胞菌+綠色木霉組對(duì)纖維素組分的降解效率要高于粗壯脈紋胞菌單菌組，可能是由于纖維素組分作為碳源對(duì)綠色木霉和里氏木霉的誘導(dǎo)效果優(yōu)于對(duì)粗壯脈紋胞菌的誘導(dǎo)效果，導(dǎo)致纖維素酶水解效率提高；此外，還可能是綠色木霉、里氏木霉復(fù)合粗壯脈紋胞菌所產(chǎn)纖維素酶酶系更完整，C1酶活力高，對(duì)打斷纖維素復(fù)雜的結(jié)晶區(qū)有所幫助，導(dǎo)致其降解效果提高[22]。綜上所述，粗壯脈紋胞菌與綠色木霉和里氏木霉的混合發(fā)酵組相比于粗壯脈紋胞菌單菌發(fā)酵，其所產(chǎn)纖維素酶周期長(zhǎng)，酶系更完整，酶效率更高，降解纖維能力更強(qiáng)。

3.2 接種量對(duì)復(fù)合菌各纖維素酶酶活力的影響

接種量的增加對(duì)粗壯脈紋胞菌+綠色木霉組和粗壯脈紋胞菌+里氏木霉組所產(chǎn)纖維素酶影響較大，當(dāng)接種量達(dá)到9 mL/100 g后，粗壯脈紋胞菌+綠色木霉組C1（15.672 U/g）、Cx（15.569 U/g）酶活力超過(guò)粗壯脈紋胞菌單菌（分別為11.141 U/g和12.229 U/g）；粗壯脈紋胞菌+里氏木霉組在接種量達(dá)到12 mL/100 g時(shí)，其FPA（2.979 U/g）和C1（16.965 U/g）酶活力優(yōu)于同接種量的粗壯脈紋胞菌單菌發(fā)酵組（分別為2.536 U/g和10.612 U/g）。粗壯脈紋胞菌+酵母菌組隨著接種量的增加各纖維素酶酶活力均穩(wěn)步上升，但總體酶活力較低，結(jié)合表1，可以發(fā)現(xiàn)雖然在酶活上沒(méi)有升高，但對(duì)纖維素的降解率相對(duì)于粗壯脈紋胞菌單菌發(fā)酵提高了12.15%，可能是由于酵母菌將無(wú)機(jī)氮轉(zhuǎn)換成菌體蛋白后，分泌B族維生素、生物活性物質(zhì)等[23]促進(jìn)了粗壯脈紋胞菌的生長(zhǎng)的原因。粗壯脈紋胞菌單菌發(fā)酵的β-G酶活力高于其他各實(shí)驗(yàn)組，并且隨著接種量的增加而提高，在接種量到12 mL/100 g時(shí)達(dá)到了8.742 U/g?？赡苁怯捎谇捌诎l(fā)酵產(chǎn)生的Cx和C1兩種纖維素酶的作用導(dǎo)致發(fā)酵物中纖維二糖含量劇增，通過(guò)反饋誘導(dǎo)機(jī)制刺激β-G大量分泌，而后期β-G酶活力呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，是由于葡萄糖含量增加，競(jìng)爭(zhēng)性抑制了β-G酶活力[24]。此外，β-G的變化趨勢(shì)和FPA變化趨勢(shì)是契合的，表明β-G可能是總酶活的一個(gè)關(guān)鍵控制酶。總體來(lái)說(shuō)，當(dāng)接種量達(dá)到12 mL/100 g時(shí)，粗壯脈紋胞菌單菌發(fā)酵所產(chǎn)酶酶活力呈下降趨勢(shì)，可能是過(guò)多的接種量導(dǎo)致基料消耗快，在未達(dá)到產(chǎn)酶高峰前，基料中的營(yíng)養(yǎng)成分就耗盡，不能滿足如此大量的菌同時(shí)生長(zhǎng)；而綠色木霉、里氏木霉對(duì)基料中營(yíng)養(yǎng)成分要求更低，與粗壯脈紋胞菌復(fù)合，纖維素酶系更齊全，對(duì)纖維素的利用效率更高[25]。

通過(guò)本實(shí)驗(yàn)可以得出如下結(jié)論：乳酸菌在發(fā)酵茶粕產(chǎn)纖維素酶上對(duì)粗壯脈紋胞菌沒(méi)有促進(jìn)作用，在發(fā)酵后期，對(duì)粗壯脈紋胞菌的產(chǎn)酶還有抑制作用，導(dǎo)致該組在發(fā)酵96 h后FPA酶活力只有0.629 U/g，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)組中FPA酶活力只有0.85 U/g?？赡苁怯捎谠诎l(fā)酵后期發(fā)酵瓶中的氧氣含量較低，乳酸桿菌大量生長(zhǎng)，分泌對(duì)真菌生長(zhǎng)有抑制作用的乳酸類、酚酸類物質(zhì)[26-27]，降低了粗壯脈紋胞菌的作用。有研究表明[28]，酵母菌復(fù)配真菌發(fā)酵能產(chǎn)生較好的效果。但本實(shí)驗(yàn)中，東方伊莎酵母對(duì)粗壯脈紋胞菌發(fā)酵茶粕產(chǎn)纖維素同樣沒(méi)有促進(jìn)作用。結(jié)合驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，本研究認(rèn)為可能是酵母菌在發(fā)酵中期開(kāi)始利用粗壯脈紋胞菌降解纖維素產(chǎn)生的可溶性糖迅速生長(zhǎng)并分泌次級(jí)代謝產(chǎn)物——酒精，對(duì)粗壯脈紋胞菌的生長(zhǎng)產(chǎn)生了干擾，導(dǎo)致發(fā)酵后期纖維素酶酶活力顯著下降。

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Cellulase Production from Tea Seed (Camellia oleifera) Cake Using Neurospora crassa Mixed with Other Bacteria

LIU Pei-yi, DENG Ze-yuan, YANG Jian-yuan, LI Jing*
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Institute for Advanced Studies, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

The production of cellulaes from tea seed (Camellia oleifera) cake with a minimized content of residual tea saponin of 0.917% as obtained by ultrasonic extraction method was studied in solid-state fermentation by mixed strains of Neurospora crassa with Issatchenkia oriental, Trichoderma reesei, Trichoderma vivide or L. plantarum. The activities of cellobiohydrolase 1 (C1), β-1,4-endoglucanase (Cx) and β-glucosidase (β-G) and filter paper activity (FPA) in fermentation supernatants were determined to explore their synergistic action on enzymatic hydrolysis of cellulose. The enzyme activity of C1from Neurospora crassa combined with Trichoderma vivide was increased by 51.09% compared with that obtained from single-strain fermentation by Neurospora crassa; meanwhile, the combination of both strains resulted in prolonged secretion of cellulases, and the FPA activity reached 2.782 U/g after 96 h. The cellulose was degraded by 64.19% and 61.59% in tea seed cake fermented for 10 days by Neurospora crassa mixed with Trichoderma reesei and Trichoderma vivide, respectively. The overall tendency of the enzyme activities was an increase with increasing the inoculum size irrespective of fermentation with Neurospora crassa alone or combined with other strains. However, the cellulase activities were declined at higher inoculum sizes surpassing 9 mL/100 g of Neurospora crassa when inoculated alone. These results indicate that Neurospora crassa is able to cooperate with Trichoderma reesei and Trichoderma vivide respectively to degrade cellulose.

Neurospora crassa; cellulases; mixed-bacteria fermentation; solid-state fermentation; tea seed

TS209

A

1002-6630(2014)01-0174-06

10.7506/spkx1002-6630-201401034

2013-06-30

食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室基金項(xiàng)目（SKLF-QN-201105；SKLF-ZZA-201303）；江西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2010BN1301104）

劉沛毅（1990—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程。E-mail：602634617@qq.com

*通信作者：李靜（1982—），女，副教授，博士，研究方向?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)學(xué)。E-mail：jingjingbailu@hotmail.com