朱 琳，任 清*，徐笑穎

（北京工商大學(xué)食品學(xué)院，食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京 10004 8）

高速逆流色譜分離純化苦蕎中蘆丁、槲皮素

朱 琳，任 清*，徐笑穎

（北京工商大學(xué)食品學(xué)院，食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京 10004 8）

利用乙醇溶液提取苦蕎麩皮中總黃酮，將得到的苦蕎黃酮粗提物用DA-201大孔樹脂進(jìn)行初步純化。以得到的黃酮初步純化產(chǎn)物為原料，應(yīng)用高速逆流色譜對其中的蘆丁和槲皮素進(jìn)行分離、純化。所用兩相溶劑體系為乙酸乙酯-正丁醇（4∶1∶5，V/V），上相為固定相，下相為流動相，流速2 mL/min，轉(zhuǎn)速850 r/min，檢測波長254 nm。所得產(chǎn)物經(jīng)高效液相色譜檢測，結(jié)果表明得到蘆丁純度為99%，槲皮素純度為94%。表明該法分離制備苦蕎麩皮中蘆丁、槲皮素簡便，所得產(chǎn)物純度高。

苦蕎；蘆??；槲皮素；高速逆流色譜

蕎麥又名烏麥、花麥或三角麥，有甜蕎和苦蕎兩個(gè)可食品種。俄羅斯是蕎麥種植第一大國，我國第二，但我國的苦蕎種植面積和產(chǎn)量均居世界第一位[1]。蕎麥營養(yǎng)豐富[2-3]，其中生物類黃酮是苦蕎最為重要的生物活性物質(zhì)之一，賦予苦蕎多種生理功能，主要有抗氧化[4]、抑菌[5]、降血糖[6]、降血脂、抗腫瘤等多種藥理活性?？嗍w麩皮是苦蕎麥片和苦蕎制粉生產(chǎn)過程中的副產(chǎn)品，研究表明苦蕎麥麩皮中總黃酮含量可達(dá)6%～7%[7]，主要成分有槲皮素、山柰酚和蘆丁等，而其中蘆丁含量高達(dá)70%～90%[8]。從苦蕎麥中提取黃酮類化合物作為保健食品或藥品的原料具有較好的前景。

高速逆流色譜（high-speed counter-current chromatography，HSCCC）是一種液-液分配色譜技術(shù)。HSCCC不用任何固體載體或支撐體作為固定相，避免了樣品的不可逆性吸附和樣品組分的化學(xué)變性等，使樣品的完全回收成為可能，同時(shí)還具有應(yīng)用范圍廣、儀器操作簡單、分離量大等優(yōu)點(diǎn)[9]，因而近年來在天然產(chǎn)物領(lǐng)域得到了較為廣泛的關(guān)注和應(yīng)用[10]。而將HSCCC應(yīng)用于分離苦蕎麩皮中的黃酮類物質(zhì)在國內(nèi)外鮮見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以苦蕎籽粒為原料，研究苦蕎麩皮總黃酮的提取及分離純化工藝，運(yùn)用HSCCC分離苦蕎麩皮中的黃酮類物質(zhì)，以期得到分離苦蕎麩皮中黃酮的快速簡便的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苦蕎籽粒 山西農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所。

蘆丁對照品（98%） 百靈威科技有限公司；槲皮素對照品（98%） 上海同田生物技術(shù)股份有限公司；DA-201大孔樹脂 江蘇蘇青水處理工程集團(tuán)有限公司；乙腈、甲醇（色譜純） 美國Fisher公司；亞硝酸鈉、硝酸鋁等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

T6新世界紫外-可見光分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；2-4 LSC真空冷凍干燥機(jī) 德國 Christ公司；1100高效液相色譜系統(tǒng)（配有DAD檢測器） 美國Agilent公司；Ultimate XB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱月旭材料科技（上海）有限公司；TBE-300A半制備型高速逆流色譜儀（柱體積280 mL；配有S-1007型微機(jī)單缸泵；TBD-23UV Detector紫外檢測器；N2000雙通道色譜工作站） 浙江大學(xué)智達(dá)信息工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1 苦蕎預(yù)處理及總黃酮的提取

1.3.1.1 苦蕎預(yù)處理工藝路線

苦蕎籽?！磧舾稍铩鬯闄C(jī)粉碎→過100目篩（除去淀粉）→過40目篩得到苦蕎麩皮。

1.3.1.2 溶液的制備

對照品溶液[11]：準(zhǔn)確稱取真空干燥至恒質(zhì)量的蘆丁對照品0.010 0 g，用體積分?jǐn)?shù)30%乙醇水浴微熱溶解，并完全轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中，用30%乙醇定容，制成0.100 0 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。

樣品溶液[12]：準(zhǔn)確稱取過40目篩的苦蕎麩皮10.000 g，按料液比1∶10加入體積分?jǐn)?shù)60%乙醇溶液，在80 ℃水浴中攪拌提取，提取2次，每次提取2 h。將提取液減壓抽濾，得到待測樣品溶液。將樣品溶液真空濃縮，冷凍干燥，得到苦蕎黃酮粗提物。

1.3.1.3 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[13]

精密吸取0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL上述蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別 置于6支10 mL刻度試管中，加30%乙醇至5 mL，加5% NaNO2溶液0.30 mL，搖勻后放置5 min，加10% Al(NO3)3溶液0.30 mL，搖勻后放置6 min，加4% NaOH溶液2.00 mL，再用30%乙醇稀釋至刻度，搖勻后放置10 min，置l cm比色皿中在510 nm波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，以蘆丁質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)得標(biāo)準(zhǔn)曲線y＝0.150 2x＋0.002 4，R2＝0.999 9，表明蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性好。

1.3.1.4 樣品總黃酮含量及粗提物純度的測定

將黃酮樣品溶液稀釋適當(dāng)?shù)谋稊?shù)，取3 mL稀釋溶液加2 mL 30%乙醇，處理方法同1.3.1.3節(jié)，根據(jù)吸光度從標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程求出苦蕎中總黃酮的含量，為4.30%。稱取一定量的黃酮粗提物，用30%乙醇溶解，用相同方法得出其中總黃酮的量并計(jì)算純度，為40.2%。

1.3.2 苦蕎麩皮黃酮的初步純化

1.3.2.1 DA-201大孔樹脂預(yù)處理[14]

取一定量的樹脂，用95%的乙醇浸泡24 h，然后用乙醇洗滌，直到洗出液中加適量蒸餾水無白色渾濁現(xiàn)象，再用蒸餾水洗至無醇。依次用4% NaOH溶液、5% HCl溶液浸泡2～4 h，分別用蒸餾水洗至中性，將預(yù)處理好的DA-201樹脂濕法裝入20 mm×300 mm玻璃層析柱中。

1.3.2.2 DA-201大孔樹脂純化工藝[15]

將提取液真空（60 ℃，0.09 MPa）濃縮，加水制成0.75 mg/mL的黃酮溶液100 mL，以2 mL/min流速通過DA-201樹脂柱，用蒸餾水洗至無色，再用150 mL 70%的乙醇以2 mL/min洗脫并收集洗脫液，真空濃縮，冷凍干燥，制得初步純化苦養(yǎng)麩皮黃酮，并測定其純度。

1.3.3 苦蕎麩皮黃酮的純化物的高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）分析

1.3.3.1 HPLC色譜條件

色譜柱：Ultimate XB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；波長：375 nm；流動相A：0.05%（V/V）冰醋酸溶液；流動相B：乙腈；流速：0.8 mL/min；進(jìn)樣量：20 ?L；梯度洗脫：0～8 min、18% B，8～18 min、18%～28% B，18～28 min、28% B，28～35 min、28%～100% B，35～40 min、100% B，40～45 min、18% B。

1.3.3.2 蘆丁、槲皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線制作及樣品測定

混合對照品溶液制備[16]：分別精密稱取對照品蘆丁100 mg、槲皮素2.5 mg于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，再將溶液稀釋10倍，配成質(zhì)量濃度分別為1.00 mg/mL和0.025 mg/mL的混合對照品貯備液。

樣品溶液制備：精密稱取純化的樣品10 mg于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，配成質(zhì)量濃度1 mg/mL的樣品溶液。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：將混合對照品溶液分別進(jìn)樣10、15、20、25、30 ?L，以對照品的質(zhì)量（mg）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品溶液的測定：取樣品溶液進(jìn)樣20 ?L，按上述HPLC方法進(jìn)行測定，記錄峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算樣品中蘆丁和槲皮素的含量。

1.3.4 苦蕎麩皮黃酮的HSCCC純化

1.3.4.1 溶劑體系的選擇[17]

溶劑體系的選擇對分離效果至關(guān)重要。研究表明，一個(gè)好的溶劑系統(tǒng)應(yīng)滿足下列要求：固定相要有較高的保留率；兩相溶劑系統(tǒng)的分層時(shí)間小于30 s；分配系數(shù)K應(yīng)盡量符合0.5＜K＜2[18]。

參照Ito溶劑體系選擇方法[19]，對比氯仿-甲醇-水體系，本實(shí)驗(yàn)選用毒性較小的乙酸乙酯-正丁醇-水體系，所選用的3種溶劑的配比分別為：2∶3∶5、3∶2∶5、4∶1∶5、5∶0∶5以及正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水1∶5∶1∶5、2∶5∶2∶5、3∶5∶3∶5，利用HPLC分別測定在不通過溶劑體系中蘆丁和槲皮素的分配系數(shù)。

分配系數(shù)的測定方法[20]：取約4 mg苦蕎黃酮純化物于10 mL玻璃試管中，加入預(yù)先達(dá)到平衡的兩相溶劑系統(tǒng)的上相和下相各4 mL于此試管中，超聲振蕩混勻，使黃酮純化物充分溶解。待達(dá)到分配平衡后，分別取上相和下相各1 mL，水浴蒸干后用1 mL色譜純甲醇溶解，經(jīng)HPLC檢測后得到上相中化合物的峰面積A1和下相中化合物的峰面積A2，則分配系數(shù)K＝A1/A2。

1.3.4.2 HSCCC分離苦蕎麩皮黃酮中蘆丁、槲皮素

在分液漏斗中按比例配制兩相溶劑系統(tǒng)，充分振搖后靜置，使用前分取上下相，超聲脫氣后泵入逆流色譜儀。先將HSCCC分離管中充滿上相，調(diào)整主機(jī)轉(zhuǎn)速為850 r/min，再以2 mL/min流速泵入下相，待流動相從柱出口流出，表明兩相在分離管中建立了動態(tài)平衡。取初步純化黃酮樣品80 mg溶于8 mL流動相中，由進(jìn)樣閥進(jìn)樣，流出液用紫外檢測器在254 nm波長處進(jìn)行檢測，同時(shí)記錄色譜圖，根據(jù)色譜圖接收各流分[21]。

1.3.4.3 HPLC檢驗(yàn)純度

按1.3.3.1節(jié)的HPLC條件，對收集到的各流分中蘆丁、槲皮素含量進(jìn)行測定，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程得到經(jīng)HSCCC純化后的蘆丁與槲皮素的純度。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC分析蘆丁、槲皮素對照品標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

圖1 蘆丁、槲皮素混合標(biāo)品HPLC圖譜Fig.1 HPLC profiles of mixed standards of rutin and quercetin

由圖1可知，蘆丁保留時(shí)間為15.023 min，槲皮素保留時(shí)間為33.476 min。按照1.3.3.2節(jié)方法，繪制得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線：y＝1×106x－27 935，R2＝0.999 9；槲皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線：y＝1×106x＋56 786，R2＝0.999 5。

2.2 大孔樹脂初步純化的黃酮中蘆丁、槲皮素含量的HPLC測定

圖2 大孔樹脂純化物的HPLC圖譜Fig.2 HPLC profiles of the products purified by macroporous resin chromatography

利用吸光度法得，經(jīng)大孔樹脂純化所制得的樣品中總黃酮含量為88.4%。對經(jīng)大孔樹脂初步純化的樣品進(jìn)行HPLC分析，得出樣品中蘆丁、槲皮素含量分別為80.5%與3.01%。

2.3 HSCCC分配系數(shù)的測定

表1 不同溶劑體系中蘆丁、槲皮素的分配系數(shù)Table1 Partition coefficients of rutin and quercetin in solvent systems with different proportions

組分在HSCCC達(dá)到良好的分離，需滿足分配系數(shù)0.5＜K＜2，且組分的分配系數(shù)有較大的差距，從表1可以看出，乙酸乙酯-正丁醇-水（4∶1∶5）的蘆丁分配系數(shù)在0.5～2，但槲皮素分配系數(shù)較大，會出現(xiàn)出峰時(shí)間較長，峰形變寬，本實(shí)驗(yàn)采用反推洗脫模式，在蘆丁出峰結(jié)束后，將槲皮素組分反推出來，可縮短分離時(shí)間。而正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（3∶5∶3∶5）體系中蘆丁分配系數(shù)較小，槲皮素分配系數(shù)較為合適，會造成蘆丁出峰時(shí)間過早，不易分離，但有利于蘆丁、槲皮素的一次分離，所以本實(shí)驗(yàn)選用乙酸乙酯-正丁醇-水（4∶1∶5）與正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（3∶5∶3∶5）體系進(jìn)行HSCCC分離純化，并分別檢驗(yàn)其純度。

2.4 初步純化苦蕎黃酮的HSCCC分離

按1.3.4.2節(jié)的方法對經(jīng)大孔樹脂純化的苦蕎黃酮進(jìn)行HSCCC分離純化，溶劑體系選用乙酸乙酯-正丁醇-水（4∶1∶5）與正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（3∶5∶3∶5），固定相保留率分別為50%、66.7%。洗脫時(shí)間分別為4、5 h。在乙酸乙酯-正丁醇-水（4∶1∶5）體系的180 min時(shí)采用反推模式，主機(jī)調(diào)為反轉(zhuǎn)，將流動相換成固定相。兩體系的高速逆流圖譜如圖3、4所示。

圖3 乙酸乙酯-正丁醇--水（4∶1∶5）體系高速逆流色譜圖Fig.3 HSCCC profiles of flavonoids in ethyl acetate-n-butyl alcoholwater (4:1:5, V/V)

圖4 正己烷-乙酸乙酯-甲醇--水（3∶5∶3∶5）體系高速逆流色譜圖Fig.4 HSCCC profiles of flavonoids in n-hexane-ethyl acetatecarbinol -water (3:5:3:5, V/V)

收集圖3中的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ各組分以及圖4中的1、2、3、4組分按1.3.3.1節(jié)的HPLC條件進(jìn)行分析，結(jié)果如圖5所示。

圖5 乙酸乙酯-正丁醇--水44∶1∶5體系組分Ⅱ（A）和Ⅳ（B）HPLLCC色譜圖Fig.5 HPLC profile of flavonoid componentⅡin ethyl acetate-nbutyl alcohol-water (4:1:5, V/V) and that of component Ⅳ in the same solvent mixture

圖5 為乙酸乙酯-正丁醇-水（4∶1∶5）體系中組分Ⅱ和組分Ⅴ的HPLC圖譜。對照保留時(shí)間可知組分Ⅱ?yàn)樘J丁，組分Ⅴ為槲皮素，質(zhì)量分別為53.6、1.9 mg。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程得到蘆丁和槲皮素純度分別達(dá)99%和94%，且分離時(shí)間較短，僅為4 h。而在正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（3∶5∶3∶5）體系中，由于蘆丁分配系數(shù)<<1，出峰時(shí)間太短，與其他組分沒有得到很好的分離，得到純度較低，但是槲皮素純度較高，綜合考慮選用乙酸乙酯-正丁醇-水（4∶1∶5）體系進(jìn)行苦蕎黃酮中蘆丁和槲皮素的分離。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用乙醇提取方法，以較優(yōu)的提取條件：料液比1∶10、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、溫度80 ℃、攪拌提取、時(shí)間2 h、提取兩次，測得苦蕎麩皮中總黃酮含量為4.30%，粗提物純度為40.2%。選用DA-201大孔樹脂對提取得到的黃酮粗提物進(jìn)行了初步純化，得到純化產(chǎn)物純度為88.4%。運(yùn)用HPLC外標(biāo)法對苦蕎麩皮初步純化產(chǎn)物中的蘆丁、槲皮素進(jìn)行了定量測定，得出蘆丁、槲皮素含量分別為80.5%與3.01%。以經(jīng)初步純化的苦蕎麩皮黃酮為原料，進(jìn)行了高速逆流的分離純化，選用兩相溶劑體系：乙酸乙酯-正丁醇-水（4∶1∶5），上相為固定相，下相為流動相，進(jìn)樣速率2 mL/min，轉(zhuǎn)速850 r/min。于140 min收集到蘆丁，在180 min時(shí)進(jìn)行反推，于220 min時(shí)收集到槲皮素。經(jīng)高效液相測定蘆丁、槲皮素純度分別為99%、94%。表明本研究采用的提取分離方法可以簡便、有效的分離苦蕎麩皮中的蘆丁、槲皮素，為今后進(jìn)一步的功效研究奠定了一定的基礎(chǔ)。

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Isolation and Preparation of Flavones from the Bran of Tartary Buckwheat Using High Speed Counter Current Chromatography

ZHU Lin, REN Qing*, XU Xiao-yin g
(Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients, School of Food and Chemical Engi neering, Beijing Technology and Business University, Be ijing 100048, China)

The bran of tartary buckwheat was extracted with 60% ethanol. A DA-201 macroporous resin column was applied in the purification of flavonoids from the extract. High speed counter current chromatography (HSCCC) method was used for preparative isolation and purification of rutin and quercetin from the preliminarily purified extracts. A two-phase solvent system composed of ethyl acetate, n-butyl alcohol and water (4:1:5, V/V) was used at a flow rate of 2.0 mL/min for HSCCC separ ation at a rotation speed of 850 r/min and the pooled eluates were detected at 25 4 nm. The purity of rutin and quercetin obtained was 99% and 94%, respectively, as detected by high performance liquid chromatography (HPLC). These results indicate that this method is convenient and effective and can be used to extract and purify rutin and quercetin from tartary buckwheat bran.

tartary buckwheat; rutin; quercetin; high speed counter current chromatography (HSCCC)

TS207.3

A

1002-6630（2014）02-0047-04

10.7506/spkx1002-6630-201402009

2013-05-17

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（CARS-08-D-3）

朱琳（1988—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：happy.sure@hotmail.com

*通信作者：任清（1969—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)樯锘钚猿煞值姆蛛x提取及功能。E-mail：renqing@th.btbu.edu.cn