方國珊，張 磊，張端麗，周 敏，劉 雄,

（1.西南大學食品科學學院，重慶 400715；2.重慶師范大學生命科學學院，重慶 401331）

花椒為蕓香科（Rutaceae）花椒屬植物Zanthoxylum bungeanum的果皮，是我國傳統(tǒng)的“八大調味品”之一，主要含有揮發(fā)油、生物堿、酰胺類物質、香豆素等多種化學成分，對心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、神經系統(tǒng)、免疫機能、凝血功能等都有重要作用[1-6]?；ń仿樗厥且活愭湢畈伙柡椭舅狨０奉愇镔|，具有強烈的刺激性[7-9]，目前已鑒定出22 種[10]，主要有α-山椒素、β-山椒素、γ-山椒素、δ-山椒素及其羥基同系物等，其檢測方法主要有高效液相色譜法、液相色譜-質譜聯(lián)用法、薄層層析法、近紅外檢測法、紫外分光光度計法等[11-15]。國內外對花椒麻素在生物樣品中檢測方法的研究報道較少，有文獻報道，采用液相色譜-質譜聯(lián)用法測定大建中湯中羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素及γ-山椒素在血漿、尿液中的含量[16]，前處理簡便、靈敏度高，但設備昂貴、檢測成本高，Munekage等[17]采用高效液相色譜測定大建中湯中羥基-α-山椒素及羥基-β-山椒素在血漿中的濃度，所需樣品量少，分離效果好，但組織樣品中干擾雜質較多，已報道的檢測方法效果并不理想，而目前組織樣品中花椒麻素的檢測方法尚未見報道，故本實驗旨在建立組織樣品中花椒麻素含量的檢測方法，以期為花椒麻素進一步研究提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花椒麻素標品（純度＞97%） 實驗室自制；五味子醇甲（純度＞98%） 南通飛宇生物科技有限公司；甲醇 美國Spectrum公司。

1.2 儀器與設備

LC-20A高效液相色譜儀（配有LC-20AD泵、SPDM20A檢測器、SIL-20A全自動進樣器、CTO-10AS柱溫箱及LCsolution工作站） 日本島津公司；XW280A旋渦混合器 上海醫(yī)科大學儀器廠；Eppendorf Centrifuge 5810型離心機 德國Eppendorf公司；1-15 PK冷凍離心機 德國Sigma公司；JA2003A電子天平 上海精天電子儀器有限公司；Cole Parmer手持勻漿機 美國Cole-Parmer儀器公司；HH-4水浴鍋 常州澳華儀器有限公司；DHG-9070電熱恒溫鼓風干燥箱 上海齊欣科學儀器有限公司；Milli-Q Biocel超純水器 美國密理博公司。

1.3 動物

SD大鼠，雄性、體質量（220±20）g、SPF級，購于重慶騰鑫比爾實驗動物銷售有限公司，動物許可證號：SCXK（渝）2007-0008。大鼠單籠飼養(yǎng)，室溫保持（25±1）℃，12 h明暗輪換（8∶00～20∶00），基礎飼料喂養(yǎng)適應一周后，按照40 mg/kg體質量的劑量灌胃大鼠，15、30、45、60、90、180、360 min及12 h后斷頭處死，立刻解剖取樣，胃和小腸需剪開洗出內容物，皮膚需刮凈，其余組織直接用冰冷的生理鹽水洗去表面血液，草紙輕輕吸干后稱量，鋁箔紙包裹后置于－80 ℃待測。同樣的方法采集未灌胃的正常大鼠的組織樣品作為空白組織。

1.4 花椒麻素測定方法的建立

1.4.1 色譜條件

色譜柱：島津Interstil ODS-SPC18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇∶水=70∶30（V/V）；進樣量：20 μL；流速：0.5 mL/min；柱溫：35 ℃；檢測波長：254 nm。

1.4.2 標準溶液的制備

花椒麻素標準溶液的配制：精密稱取花椒麻素適量，用甲醇溶解配制成2 mg/mL的儲備液。分別精密量取該儲備液適量，用流動相逐級稀釋成質量濃度為1、2、5、10、20、50、100 μg/mL和200 μg/mL的花椒麻素系列標準溶液，置冰箱（4 ℃）備用。

內標液：精密稱取五味子醇甲0.006 0 g，用甲醇溶解配制成60 μg/mL備用。

1.4.3 生物樣品的處理方法

取組織樣品（腦、心、胃、脾、肺、腎、胰腺、皮膚、平滑肌、脂肪、睪丸和前列腺）加入5 mL甲醇和20 μL內標五味子醇甲（60 μg/mL），肝和小腸加入30 mL甲醇和20 μL五味子醇甲（60 μg/mL）。勻漿，靜置4 h，8 000 r/min離心10 min，合并兩次組織勻漿液于65 ℃烘干。加入1 mL甲醇，渦旋混合30 s，10 000 r/min冷凍離心10 min，過0.45 μm有機濾膜進樣。

1.4.4 生物樣品中標準曲線的制備

用空白組織勻漿液配制質量濃度分別為0.1、0.2、0.5、1、5、10、20、50、100 μg/mL 9 個梯度的花椒麻素標準液樣品，按上述方法進行處理測定，建立標準曲線。以待測物質量濃度為橫坐標，待測物峰面積與內標峰面積的比值為縱坐標，用加權最小二乘法進行回歸運算，求得直線回歸方程，即為標準曲線。

1.4.5 回收率的測定

用大鼠空白組織勻漿液配制質量濃度分別為1、5、10 μg/mL的組織樣品，加入內標20 μL，按1.4.3節(jié)操作，每添加量進行5樣本分析。與相應質量濃度的純品溶液加入內標，對比。測定提取樣品峰面積Ax和純品峰面積As，按下式計算樣品提取回收率（R/%）：

1.4.6 方法的精密度

用大鼠空白組織勻漿液配制1、5、10、50、100 μg/mL 5個質量濃度的組織樣品，按1.4.3節(jié)處理，每個質量濃度進行樣本分析，連續(xù)測定3 d，并與標準曲線同時進行。根據當日標準曲線計算組織樣品的質量濃度，計算方法的精密度。方法的精密度用日內相對標準偏差（RSD）和日間RSD表示。

1.4.7 穩(wěn)定性考察

取潔凈的離心管，加入空白大鼠組織勻漿液，加標準品使質量濃度分別為1、5、10、50、100 μg/mL，分別放置－20 ℃冰箱冷藏1月；－20 ℃和室溫反復凍融3次，每個過程12 h；室溫20 ℃擺放12、24 h，同1.4.3節(jié)處理，測定藥物含量。

2 結果與分析

2.1 方法專屬性考察

取大鼠空白組織勻漿液1 mL，加入內標溶液，按1.4.3節(jié)方法操作，獲得空白樣品色譜圖1A；將一定質量濃度的花椒麻素標準溶液和內標溶液加入空白組織勻漿液，依同法操作，獲得相應的色譜圖1B；取大鼠給藥后的組織勻漿液，依法操作，可得給藥后大鼠組織樣品的色譜圖1C（以肝為例）?？梢姡ń仿樗氐谋Ａ魰r間約為23.1、24.2 min和25.5 min，內標的保留時間約為17.3 min，組織中的內源性物質不干擾花椒麻素及內標的測定。

圖1 花椒麻素在肝組織中的色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of alkylamide from Sichuan pepper in rat liver samples

2.2 組織樣品的標準曲線

按1.4.3節(jié)組織樣品處理方法提取樣本，得到大鼠組織樣品的標準曲線，由表1可知，花椒麻素在大鼠不同組織中的線性范圍略有不同，心臟、脾臟、肺、腦、肌肉、皮膚、睪丸及前列腺的線性范圍為0.1～10 μg/mL，腎臟和脂肪的線性范圍為0.1～20 μg/mL，肝臟和小腸的線性范圍為0.1～50 μg/mL，胃中花椒麻素的線性范圍為0.1～100 μg/mL，定量限（RSN=3）均為0.1 μg/mL。

2.3 加標回收實驗

表2 花椒麻素在大鼠組織樣品中的提取回收率（n=5）Table 2 Recovery rates of alkylamide from Sichuan pepper in spiked samples of rat tissues (n=5)

續(xù)表2

表2表明：肝臟、脾臟、腎臟及肺中的回收率大于82%，其余組織樣品中的回收率均大于85%，RSD均小于9%，本方法在低、中、高3個添加水平上的回收率最低為78.79%，能滿足生物樣品的定量分析要求[18]。

2.4 精密度

本實驗通過日內、日間變異考察了方法的精密度，由表3可知，方法的日內RSD小于7%，日間RSD小于11%，完全符合目前生物分析方法指導原則質控樣品批內及批間RSD值不超過15%的要求[19]。

表3 花椒麻素精密度（n=5）Tabbllee 3 Precision of the method (n=5)

2.5 穩(wěn)定性

表4 穩(wěn)定性結果（n=5）Table 4 Stability of alkylamide from Sichuan pepper during storage at room temperaturree (n=5)

由表4可知，短期室溫放置穩(wěn)定性中，組織樣品中花椒麻素測定均值與加入值之間的RSD小于6%，表明組織樣品處理后室溫條件下至少可穩(wěn)定24 h；－20 ℃室溫反復凍融3次后，組織樣品的RSD小于10%，表明組織樣品在冷凍-融溶循環(huán)3次實驗中無明顯降解；貯藏1個月的組織樣品RSD小于8%，1 μg/mL的組織樣品貯藏1個月后，質量濃度與初始樣品存在顯著性差異，而樣品質量濃度在5～100 μg/mL時，無顯著性變化，說明低質量濃度的樣品不宜貯藏，樣品處理后應盡快測定。

3 討論及結論

3.1 試驗方法的選擇

花椒麻素的檢測方法包括紫外分光光度計法、近紅外檢測法、薄層層析法、高效液相色譜法等[11-15]。高效液相色譜具有分析成本低、靈敏度高、層析時間短、試驗方法簡便等優(yōu)點，對一些高熔點、低揮發(fā)、極性強以及對熱不穩(wěn)定的物質具有良好的分離效果，并能在室溫中操作，安全簡便[20]，故本研究采用此種方法。

3.2 色譜條件的確定

本實驗選擇島津I n t e r s i l O D S-S P C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）為分析柱，在一定比例范圍內考察甲醇-水流動相對檢測色譜峰的影響。以峰面積為指標，對比不同流速（0.50、0.55、0.60、0.65、0.70、0.75、0.80、0.90、1.00 mL/min）及不同比例（55∶45、60∶40、62∶38、65∶35、68∶32、70∶30、72∶28、75∶25）的流動相的色譜圖，結果表明，隨著流速的提高，出峰時間不斷提前，峰面積逐漸減小，難以與內標及內源性雜質分離，而隨著有機相比例的提高，峰面積先增后減，當甲醇和水比例70∶30、流速0.5 mL/min時，峰形對稱，花椒麻素和內標均達到基線分離，組織樣品中的其他成分不干擾樣品的測定。

3.3 樣品的處理方法

花椒麻素醇溶性強，在選取萃取溶劑時，曾采用乙醚、氯仿、氯仿-丙酮（1∶1、2∶1）、氯仿-甲醇（1∶1、1∶2、2∶1）、甲醇8種，乙醚等極性小的溶劑對其萃取率雖然高，但乙醚易揮發(fā)，從而造成提取后質量濃度的誤差，不便于操作，且對呼吸道有強烈刺激作用，氯仿和丙酮或甲醇不同比例的提取溶劑，僅對個別組織的提取效率高，故選用甲醇為提取溶劑，成本低，提取率高，提純后雜質少，操作十分方便。

本實驗建立了以五味子醇甲為內標，高效液相色譜法測定大鼠組織樣品中花椒麻素的含量方法，簡便快速、重復性好、靈敏度高，在一定質量濃度范圍內，線性關系良好，回收率高，無干擾，適用于大鼠組織樣品中花椒麻素含量的測定。

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