王苗利 田夫林 陳 靜 王貴升 孫圣福 李玉杰 徐 鴻 尹斐斐 劉麗平 王世榮

生物發(fā)酵法處理病死豬后肺炎克雷伯菌效果的監(jiān)測

王苗利 田夫林*陳 靜 王貴升 孫圣福 李玉杰 徐 鴻 尹斐斐 劉麗平 王世榮

（山東省動物疫病預(yù)防與控制中心 山東 濟南 250022）

本試驗利用細菌分離、培養(yǎng)、生化鑒定方法對臨沂沂水縣某豬場的病死豬生物發(fā)酵無害化處理堆的肺炎克雷伯菌進行了追蹤監(jiān)測，結(jié)果表明，在21d的追蹤監(jiān)測后，2組試驗中的肺炎克雷伯菌均已在7d后被殺滅，之后直至第21d均未再檢測到肺炎克雷伯菌。表明臨沂沂水縣某豬場采取的生物發(fā)酵法無害化處理病死豬對肺炎克雷伯菌的殺滅效果顯著。

細菌分離 生化鑒定 無害化處理 肺炎克雷伯菌

肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)是腸桿菌科常見的條件致病菌, 革蘭陰性,大小為0.3~1.5μm×0.6-6μm，單個成雙或短鏈排列，痰標(biāo)本直接涂片，菌體呈卵圓形或球桿菌，單個或成雙排列．莢膜染色外周可見透明、環(huán)狀莢膜。隨著第三代頭孢菌素等廣譜抗菌藥的廣泛使用，產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)菌株不斷增多，成為臨床治療的難題之一[2]。因此，如何消滅病死豬攜帶的肺炎克雷伯菌，消滅傳染源，成為養(yǎng)殖場持續(xù)發(fā)展面臨的難題。

病死畜禽的無害化處理是消滅傳染源最有效和最徹底的措施，特別是當(dāng)前正值重大動物疫病防控的重要階段和食用農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全水平全面提升的關(guān)鍵時期[3]。目前，養(yǎng)殖場對病死畜禽的處置方式主要有兩種，一是焚燒，無論用電或油均需要專門的設(shè)施設(shè)備，購置設(shè)備費用高，處理成本大，而且焚燒氣味大、有害成分多；二是深埋，多數(shù)養(yǎng)殖場(戶)對病死動物采用掩埋法，但掩埋的地點、深度和方法不符合有關(guān)規(guī)定。在夏季，被掩埋的動物尸體出現(xiàn)被雨水浸泡后溢出，還存在食肉動物扒出、被人偷掘挖出加工變賣等嚴重隱患，同時，多數(shù)掩埋地點不符合要求，容易污染周邊地下水源。因此，尋求有效、方便、環(huán)保的病死畜禽的無害化處理技術(shù)方法顯得尤為必要。

生物發(fā)酵床養(yǎng)豬技術(shù)起源于日本民間，在日本、韓國被大力推廣和廣泛應(yīng)用，是近年我國引進的一項新興養(yǎng)豬技術(shù)，又稱“自然養(yǎng)豬法”、“零排放養(yǎng)豬法”或“生物環(huán)保養(yǎng)法”[4]。生物發(fā)酵床養(yǎng)豬技術(shù)是根據(jù)微生態(tài)理論，利用自然界的微生物資源，即自然界中多種有益微生物，通過選擇、培養(yǎng)、檢驗、擴繁，形成有相當(dāng)活力的微生物母種，再按一定比例將其與鋸末、谷殼等輔助材料、活性劑等混合和發(fā)酵制成豬圈有機墊料。豬排泄出來的糞、尿被墊料掩埋，水分被發(fā)酵過程中產(chǎn)生的熱蒸發(fā)，使豬糞、尿中的有機物質(zhì)得到充分的分解和轉(zhuǎn)化，達到無臭、無味、無害化的目的，是一種無污染、無排放、無臭氣的環(huán)保養(yǎng)豬技術(shù)[5]。但是目前尚無有關(guān)生物發(fā)酵法無害化處理病死動物對微生物殺滅效果的有關(guān)試驗及數(shù)據(jù)，因此，對生物發(fā)酵法無害化處理病死畜禽技術(shù)進行殺滅各類細菌的效果追蹤監(jiān)測及評估勢在必行。

1 材料與方法

1.1 材料

法國科瑪嘉顯色定位培養(yǎng)基(批號LOT646)、麥康凱選擇培養(yǎng)基(批號1303271)、TSA培養(yǎng)基(批號20120829，青島高科園海博生物技術(shù)有限公司)、法國生物梅里埃ID32E生化反應(yīng)條(批號1002551050)

1.2 方法

1.2.1 樣品采集 本次實驗共對兩組堆體的樣品進行采集，分別為A組、B組，結(jié)合生產(chǎn)操作，于埋入病死豬前臟器病原菌分離、以及于0d、7d、14d、21d分別取樣。取樣位置按照堆體對角線至少布置3個點，每個采樣點分表層3~5cm、中心20~30cm、深部40~50cm進行取樣，每個樣品200g左右，塑料袋密封。試驗中，2組各采集12份樣品，每層采集4份。

在病死豬埋入前樣品的采集，遵循操作安全、無菌，采樣由小到大、病變與健康組織兼顧的原則。脾、腎、淋巴結(jié)可以采取完整的一個。肝、肺等可以采集病變和健康組織交界處，至少5×5cm大小。腸或氣管，采集帶病變部位至少5cm長。

1.2.2 細菌分離、鑒定 將2組病死豬的臟器樣品以及發(fā)酵堆每周采集的樣品按照細菌學(xué)無菌操作接種于麥康凱培養(yǎng)基和科瑪嘉顯色定位培養(yǎng)基上，將平板倒置放于37℃的溫箱培養(yǎng)18~24h，后拿出觀察菌落形態(tài)。肺炎克雷伯菌在麥康凱形成隆起、大而粘液樣融合一起的粉紅菌落，用接種環(huán)挑起呈絲狀粘連；在科瑪嘉顯色定位培養(yǎng)基上生長為藍色圓形菌落。挑取可疑菌落進行革蘭氏染色、鏡檢，若為革蘭陰性桿菌，單個成雙或短鏈排列，則初步判定為肺炎克雷伯菌。挑取可疑菌落接種在TSA固體培養(yǎng)基上，37℃的溫箱培養(yǎng)18~24h，純化出單菌落，按照無菌操作要求接種到法國生物梅里埃ID32E生化反應(yīng)條上，37℃的溫箱培養(yǎng)18~24h，進行生化試驗結(jié)果的判讀。

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌生化鑒定結(jié)果

將2組病死豬的臟器樣品以及發(fā)酵堆每周采集的樣品接種到麥康凱選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)18~24h后，形成隆起、大而粘液樣融合一起的粉紅菌落，用接種環(huán)挑起呈絲狀粘連，革蘭氏染色后鏡檢為革蘭氏陰性桿菌，在科瑪嘉顯色定位培養(yǎng)基上生長為藍色圓形菌落，疑似肺炎克雷伯菌。2組樣品的可疑菌落接種到法國生物 梅里埃ID32E生化反應(yīng)條上，經(jīng)37℃的溫箱培養(yǎng)18~24h后，讀取結(jié)果表明，2組發(fā)酵堆均分離到了肺炎克雷伯菌。生化結(jié)果見表1(A組)、表2(B組)。

表1 A組發(fā)酵堆分離出的肺炎克雷伯生化譜

表2 B組發(fā)酵堆分離出的肺炎克雷伯生化譜

2.2 肺炎克雷伯菌殺滅效果追蹤結(jié)果

通過對A組、B組不同采樣時期的樣品全部進行肺炎克雷伯菌檢測鑒定后，發(fā)酵堆對肺炎克雷伯菌的殺滅效果明顯，結(jié)果見表3。

表3 A組、B組發(fā)酵堆對肺炎克雷伯菌的殺滅效果

3 結(jié)論

由試驗結(jié)果可知，2組無害化處理后，肺炎克雷伯菌均已在7d后被殺滅，之后直至第21d均未再檢測到肺炎克雷伯菌。結(jié)果表明，臨沂沂水縣某豬場采取的生物發(fā)酵法無害化處理病死豬對肺炎克雷伯菌的殺滅效果顯著。

4 討論

被丟棄的病畜禽尸體其所帶的細菌、病毒會隨空氣或其他途徑迅速傳播擴散，如果是重大動物疫病或人畜共患病，會造成重大動物疫情或人畜共患病發(fā)生，人畜生命安全就會受到威脅，經(jīng)濟就會受到嚴重損失，影響畜牧養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[1]。

近年來，山東省省的養(yǎng)豬場雖然沒有發(fā)生重大動物疫情，但全省豬疫病病種多、病原復(fù)雜、污染面廣、隱性帶毒的現(xiàn)象仍然存在，重大動物疫情發(fā)生的風(fēng)險仍然很大，肺炎克雷伯等人畜共患病有出現(xiàn)局部散發(fā)乃至流行的可能，豬偽狂犬病等其他動物疫病也存在局部流行的風(fēng)險。隨著畜牧業(yè)生產(chǎn)規(guī)模不斷擴大，養(yǎng)殖密度不斷增加，豬感染病原機會增多，病原變異幾率加大，新發(fā)疫病發(fā)生風(fēng)險增加。因此，開展生物發(fā)酵法病死豬無害化處理是發(fā)展生態(tài)畜牧業(yè)的需求，追蹤監(jiān)測生物發(fā)酵無害化處理技術(shù)對病原微生物的殺滅效果，為開展病死豬無害化處理的研究提供理論依據(jù)。

生物發(fā)酵床養(yǎng)豬因其眾多的優(yōu)點受到國內(nèi)外廣大養(yǎng)殖戶喜愛，但在實際應(yīng)用過程中也存在一些不足的地方，例如夏季發(fā)酵舍內(nèi)溫度過高，若通風(fēng)不好，將會導(dǎo)致工作人員的工作環(huán)境較為惡劣，因此，相關(guān)的工作人員要做好相應(yīng)的防護。另外，如何進一步提高生物發(fā)酵無害化處理病死豬的微生物殺滅效果，并進行推廣，有待于進一步研究。

[1] 鄧敏, 劉瑩, 曾吉等. 肺炎克雷伯菌分布特征及耐藥性分析[J]. 中國抗感染化療雜志, 2001, 1(2): 98-99.

[2] 王聯(lián)芳, 朱新華. 病死畜禽無害化處理存在的問題及對策[J]. 醫(yī)學(xué)動物防制, 2008, 24(11): 876-877.

[3] 杜曉光，武俊海. 發(fā)酵床養(yǎng)豬PK農(nóng)村戶用沼氣[J]. 中國動物保健, 2008(5): 26-28.

[4] 武華玉, 喬木, 彭先文等. 對生物發(fā)酵床養(yǎng)豬技術(shù)的認識[J]. 畜牧與飼料科學(xué), 2009, 30(6): 101-102.

[5] 方煥森. 淺談對病死畜禽無害化處理過程中存在的問題及對策[J]. 中國畜牧獸醫(yī)文摘, 2011, 27(5): 2-2.

病死畜禽無害化處理技術(shù)推廣項目，豬產(chǎn)業(yè)體系創(chuàng)新團隊項目

（2014–02–12）

S818.9

A

1007-1733(2014)05-0012-02