秦緒偉

狐貍支氣管敗血波氏桿菌的分離與鑒定

秦緒偉

（齊魯動(dòng)物保健品有限公司 山東 濟(jì)南 250100）

本試驗(yàn)是從山東菏澤某狐貍養(yǎng)殖場發(fā)病狐貍分離到一株細(xì)菌，經(jīng)生化試驗(yàn)、PCR、16sRNA測序最終確定為支氣管波氏桿菌，經(jīng)動(dòng)物試驗(yàn)確定為致病性波氏桿菌，經(jīng)藥敏試驗(yàn)選擇阿奇霉素作為理想的藥物，最終取得良好的治療效果。

狐貍 支氣管波氏桿菌 分離 藥敏試驗(yàn) 鑒定

支氣管敗血波氏桿菌屬于波氏桿菌屬，普遍存在于多種動(dòng)物，常會(huì)引起兔子的波氏桿菌性鼻炎、豬的萎縮性鼻炎[1]，特別是兔子感染率、死亡率都較高[2]，給養(yǎng)殖場帶來極大的損失。兔子、豬、犬波氏桿菌病有人報(bào)道，但是狐貍的波氏桿菌少見報(bào)道，毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)這幾年發(fā)展迅速，許多動(dòng)物的下腳料都成為了毛皮動(dòng)物的肉類食物，盲目擴(kuò)群但環(huán)境衛(wèi)生管理不善，引起各種疾病發(fā)生，本實(shí)驗(yàn)從山東菏澤一狐貍養(yǎng)殖場發(fā)病狐貍分離到一株細(xì)菌，經(jīng)一系列生化試驗(yàn)、PCR、基因測序、毒力試驗(yàn)確定為支氣管敗血波氏桿菌，經(jīng)藥敏試驗(yàn)，采取加強(qiáng)管理、藥物注射方式取得了良好的效果，控制了疫情。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株 山東菏澤一800只狐貍養(yǎng)殖場。發(fā)病狐貍精神沉郁，食欲減退，咳嗽、甩鼻、流涕，發(fā)病狐貍經(jīng)解剖無菌條件分離肺臟、氣管，獲得一株細(xì)菌。

1.1.2 其他材料 營養(yǎng)瓊脂、SS瓊脂、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基等購自青島海博生物技術(shù)有限公司；微量生化試劑管購自北京路橋技術(shù)有限責(zé)任公司；藥敏紙片購自杭州天和微生物試劑公司；PCR試劑購自大連寶生物工程有限公司；實(shí)驗(yàn)室其他常規(guī)試劑。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng) 對發(fā)病狐貍解剖，無菌條件下取肺和氣管環(huán)內(nèi)容物，接種于血清營養(yǎng)瓊脂，在37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h，培養(yǎng)出的細(xì)菌挑取單個(gè)菌落進(jìn)行純化，同時(shí)接種麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，觀察菌落形態(tài)。

1.2.2 細(xì)菌的生化試驗(yàn) 血清平板挑取單個(gè)菌落，接種于馬丁肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)，在37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h，分別取0.2ml接種于乳糖、葡萄糖、水楊苷、甘露醇、木糖、蔗糖、肌醇、山梨醇等微量生化反應(yīng)試管，24h后觀察生化反應(yīng)結(jié)果。

1.2.3 細(xì)菌的分子生物學(xué)鑒定 （1）16S rRNA：無菌挑取平板上的菌落加入到1ml無菌水中，震蕩混勻后沸水浴7min，冰浴5min，離心上清作為基因擴(kuò)增的模板，設(shè)計(jì)引物：F1-5’AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’，R1-5’ACG GCT ACC TTG TTG TTA CGA CTT-3’，PCR反應(yīng)體系(50ml)：10*PCR Buffer(含MgCl215mmol/L，KCl500 mmol/L)5ml，2.5mmol/L dNTP 4ml，引物(20umol/L)各1ml，模板2ml，ddH2O36.8ul，Taq酶(5U/ml)0.25ml。PCR反應(yīng)條件：94℃ 5min；94℃ 1min，56℃ 30s，72℃ 1.5min，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10min。取PCR產(chǎn)物5ml用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR產(chǎn)物送交上?；驕y序公司進(jìn)行測序，將測序結(jié)果提交Genbank進(jìn)行比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，判定細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育地位，以97%相似性為界限判定為何種菌。（2）種特異性PCR。根據(jù)支氣管敗血波氏桿菌鞭毛蛋白基因設(shè)計(jì)引物Fla1：TGG CGC CTG CCC TAT，F(xiàn)la2：AGG CTC CA AGA GAG AAA GGC TT進(jìn)行PCR擴(kuò)增。細(xì)菌DNA提取用熱裂解法。PCR反應(yīng)體系(50ml)：10*PCR Buffer(含MgCl215mmol/L，KCl500mmol /L)5ml，2.5mmol/L dNTP 4ml，引物(20umol/L)各1ml，模板2ml，ddH2O36.8ml，Taq酶(5U/ml)0.25ml。PCR反應(yīng)條件：94℃ 3min；94℃ 1min，56℃ 45s，72℃ 1.5min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10min。取PCR產(chǎn)物5ml用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察擴(kuò)增出的片段大小。

1.2.4 細(xì)菌的藥敏試驗(yàn) 使用藥敏紙片法對分離的細(xì)菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，培養(yǎng)過夜后量取抑菌圈的直徑，判定該菌的耐藥性。。

1.2.5 細(xì)菌的毒力試驗(yàn) 在營養(yǎng)瓊脂平板無菌取單個(gè)菌落，接種于馬丁肉湯培養(yǎng)基，37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h，分別取培養(yǎng)液原液和100倍稀釋液注射18g~22g小白鼠各3只，0.3ml/只，腹腔注射，注射后觀察7d，對照組3只，若有死亡對死亡的小白鼠解剖再進(jìn)行細(xì)菌分離。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果

無菌分離病狐貍的氣管、肺，血清平板上37℃溫箱48h培養(yǎng)可見圓形、稍微隆起、奶油樣灰白色菌落，轉(zhuǎn)接后在麥康凱上37℃溫箱48h培養(yǎng)可見圓形藍(lán)灰色、光滑、隆起的菌落，周圍有狹窄的紅色環(huán)；馬丁肉湯震蕩培養(yǎng)24h可見液體混濁，圖片鏡檢可見革蘭氏染色陰性，桿狀或者球桿狀，形態(tài)較小，有莢膜無芽孢。

2.2 細(xì)菌的生化結(jié)果

將分離菌進(jìn)行了微量生化試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果表明該菌對乳糖、葡萄糖、水楊苷、甘露醇、木糖、蔗糖、肌醇、山梨醇、阿拉伯糖等糖醇類都為陰性，氧化酶、脲酶、利用檸檬酸、還原硝酸鹽、運(yùn)動(dòng)性都為陽性。具體結(jié)果見表1。

表1 分離菌生化鑒定結(jié)果

注：“—”表示陰性，“+”表示陽性

2.3 細(xì)菌的分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

2.3.1 16S rRNA結(jié)果 根據(jù)上海測序公司的測序結(jié)果，采用Bioedit軟件參照正反向序列圖譜對序列進(jìn)行人工校對，然后輸入Genbank用Blastn軟件進(jìn)行相似性比較，最后利用構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，與支氣管波氏桿菌相似性為99.9%，最終確定為支氣管波氏桿菌。

2.3.2 種特異性PCR結(jié)果 電泳后擴(kuò)增出了237bp左右的片段，符合支氣管波氏桿菌的相應(yīng)大小的片段。

2.4 細(xì)菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

將波氏桿菌涂布于血清營養(yǎng)瓊脂平板，把標(biāo)記好的藥敏片貼于血清平板，最終根據(jù)抑菌圈的大小判定藥物的敏感程度，其中阿奇霉素、頭孢噻呋、左氧氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星高度敏感；壯觀霉素、慶大霉素、鏈霉素、復(fù)方新諾明、林可霉素、萬古霉素、磷霉素不敏感。最終選擇阿奇霉素作為治療藥物。具體藥敏結(jié)果見表2。

表2 分離菌的藥敏結(jié)果 （mm）

2.5 毒力試驗(yàn)結(jié)果

無菌挑取單個(gè)菌落接種于馬丁肉湯培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)24h后進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)為25億/ml，將細(xì)菌原液和100倍稀釋液分別注射小白鼠3只，注射原液組第3日全部死亡，100倍稀釋液注射后7d無死亡，即7.5億細(xì)菌對小白鼠有致死性毒力，750萬細(xì)菌對小白鼠沒有毒力，分離菌屬于中等毒力。

3 討論

3.1 狐貍波氏桿菌的分離

波氏桿菌初次分離生長緩慢，此次細(xì)菌分離培養(yǎng)18h未見明顯的菌落，在培養(yǎng)36~48h可見針尖大小的透明的菌落。在分離細(xì)菌時(shí)不能過夜后沒有見到細(xì)菌就放棄分離，那樣會(huì)錯(cuò)過分離到波氏桿菌的機(jī)會(huì)。此次細(xì)菌分離經(jīng)解剖、生化試驗(yàn)、PCR等方法最終診斷為支氣管敗血波氏桿菌，毒力屬于中等毒力。

3.2 狐貍波氏桿菌的診療

此次病例養(yǎng)殖場狐貍以咳嗽、甩鼻、流涕為主要特征，發(fā)病較快、發(fā)病率高、死亡率較低，解剖后可見肺部出血、氣管環(huán)內(nèi)大量膿性粘液，通過一系列的細(xì)菌分離、生化試驗(yàn)、PCR、基因測序等實(shí)驗(yàn)室診斷最終確診為支氣管敗血波氏桿菌，根據(jù)藥敏試驗(yàn)選擇了阿奇霉素作為治療的首選藥物，通過連續(xù)3d的治療取得了良好的效果，咳嗽、甩鼻的狐貍明顯減少，最終控制了疫情。狐貍的波氏桿菌報(bào)道的很少，一般不作為致病主因，在臨床上也不容易確診，發(fā)現(xiàn)咳嗽、甩鼻、流涕為主要特征時(shí)一般按照普通的感冒治療，有時(shí)候效果不理想，咳嗽增多、食欲下降、生長緩慢，在臨床上發(fā)現(xiàn)多例類似病例，特別是秋冬交替的季節(jié)發(fā)病較多，按照藥敏試驗(yàn)選擇敏感的藥物，另外配合止咳、平喘、化痰的藥敏治療效果比較明顯，按照療程治療一般死亡率都較低。

3.3 狐貍波氏桿菌的預(yù)防

波氏桿菌主要侵害呼吸道，特別是應(yīng)激的條件下多發(fā)，季節(jié)交替、天氣變化、陰雨連綿、轉(zhuǎn)群等條件下經(jīng)常可以見到，表現(xiàn)為咳嗽、流涕，在實(shí)際的生產(chǎn)中我們要降低各種應(yīng)激，在可以預(yù)見的應(yīng)激來臨之前可以使用電解多維、葡萄糖、VC等藥物來降低應(yīng)激，另外要保持環(huán)境衛(wèi)生、清理糞便、定期消毒，控制病原菌的傳播。兔子有波氏桿菌的疫苗，但還是時(shí)有發(fā)生，狐貍沒有波氏桿菌的疫苗預(yù)防，還要從環(huán)境等因素進(jìn)行預(yù)防，防止疾病的發(fā)生。

[1] 陸承平. 獸醫(yī)微生物學(xué)第5版[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2013, 155-157.

[2] 謝三星. 獸醫(yī)全攻略兔病[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2009, 128-132.

（2014–01–21）

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