劉建民 孫鵬

試驗研究

濰坊地區(qū)豬鏈球菌的分離及血清學鑒定

劉建民 孫鵬

（山東省濰坊市畜牧局 261021） （山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學院 山東 濰坊）

通過濰坊地區(qū)豬鏈球菌病的流行病學調查發(fā)現(xiàn)，濰坊地區(qū)規(guī)?；B(yǎng)殖場和散養(yǎng)戶豬鏈球菌病的發(fā)生普遍存在，且規(guī)?；B(yǎng)殖場的發(fā)病率和死亡率較低。通過對分離的豬鏈球菌的血清學鑒定發(fā)現(xiàn)，濰坊地區(qū)豬源鏈球菌血清群同樣以D群為主，占調查總數(shù)的45%。優(yōu)勢血清型仍為豬鏈球菌2型，其他常見的還包括SS1型、SS7型、SS9型和14型。為濰坊地區(qū)豬鏈球菌病的防治提供科學的依據(jù)和理論支持。

豬 鏈球菌 流行病學 血清型

豬鏈球菌病是由多種鏈球菌感染引起，多呈地方性暴發(fā)。由于發(fā)病急、死亡率高，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失[1]。豬感染鏈球菌后臨床癥狀以腦膜腦炎、敗血癥、后肢關節(jié)炎、心內膜炎及化膿性組織炎為特征。臨床調查發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)病例臨床上主要表現(xiàn)為關節(jié)炎型[2]。

豬鏈球菌病一年四季均可發(fā)生，以冬春季多發(fā)，不同年齡均可發(fā)病，病豬和病愈帶菌豬豬鏈球菌病病菌是本病的主要傳染源，主要經(jīng)消化道和損傷的皮膚感染。根據(jù)感染發(fā)病的種類不同，發(fā)病率及死亡率不同。不同國家和地區(qū)在正常豬體中檢出率也不一樣，高的達75%，而低的只有3%[3-4]，帶菌檢出率多數(shù)在50%以上[5]。我國自從吳碩顯報道首例豬敗血型鏈球菌病以來，廣東、福建、四川等省均有本病發(fā)生的報道。到目前為止，已有13個省、市(區(qū))相繼報道了豬鏈球菌病，并在華南、西南和華東地區(qū)造成大面積流行[6-8]。

隨著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，豬鏈球菌病的危害日趨嚴重，已成為制約養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的重要疾病之一。為摸清豬鏈球菌病在濰坊地區(qū)的流行狀況，掌握發(fā)病日齡及飼養(yǎng)管理等因素對豬鏈球菌病的影響，并制定合理的防制措施提供科學依據(jù)，本研究對規(guī)?；B(yǎng)豬場和有一定規(guī)模的養(yǎng)豬專業(yè)戶進行了豬鏈球菌病的流行病學調查。對濰坊地區(qū)豬鏈球菌分離株進行血清學分型，并對分離菌株的地域分布進行分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 豬鏈球菌病門診病例分析 2010年3月至2013年3月3年間，根據(jù)山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學院動物醫(yī)院門診資料(豬病)統(tǒng)計分析，送檢病豬、死豬均來自濰坊市濰城、寒亭、坊子、青州、諸城、安丘、昌邑、壽光、高密、臨朐、昌樂11個生豬養(yǎng)殖大市(縣、區(qū))，挑選具有疑似鏈球菌病癥狀的病例，共計262個，涉及205個發(fā)病豬群。對其臨床癥狀、剖檢變化、流行特點等進行分析。

1.1.2 養(yǎng)豬場(戶)豬鏈球菌病發(fā)病情況調查 2010年3月至2013年3月，調查8個規(guī)?；B(yǎng)豬場、19戶散養(yǎng)戶的豬鏈球菌病發(fā)病率、死亡率等。

1.1.3 試劑與藥品 鏈球菌乳膠凝集標準診斷試劑盒(批號786536601，法國bioMerieux SA公司生產(chǎn))；蘭氏(Lanc-efield)分群A~G的乳膠診斷試劑；改良馬丁氏培養(yǎng)基(購自北京雙旋微生物培養(yǎng)基廠)；微量發(fā)酵管(上海醫(yī)學化驗所試劑廠生產(chǎn))；THB液體培養(yǎng)基(購自青島海博生物技術有限公司)；豬鏈球菌1-34型和1/2型標準陽性血清(中國動物衛(wèi)生與流行病學中心)；各種糖發(fā)酵培養(yǎng)基，6.5%NaCL高鹽肉湯，馬尿酸鈉等生化培養(yǎng)基均為自行配制，試劑為分析純。5%綿羊鮮血瓊脂培養(yǎng)基為自行配制。

1..1.4 試驗動物 體重20~25g小白鼠，清潔級，購自青島市藥檢所。

1.2 方法

1.2.1 檢測樣品的采集 對送檢的豬鏈球菌病病例，迅速采取其淋巴結、脾、肝、腦或關節(jié)囊液(關節(jié)炎型)等部位病料，保存于-20℃。

1.2.2 細菌分離培養(yǎng) 對鏈球菌病死豬病料進行涂片，經(jīng)革蘭氏染色后鏡檢。另外，按照細菌常規(guī)方法分離，樣品接種于5%綿羊血瓊脂平板，放置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，挑取綿羊血平板上針尖大小、表面光滑、灰白色、圓形、半透明、邊緣整齊的單個菌落進行革蘭氏染色。菌體成對、短鏈、極少長鏈狀的革蘭氏陽性菌接種到THB液體培養(yǎng)基中，經(jīng)培養(yǎng)無雜菌生長者，置4℃冰箱備用，37℃震蕩培養(yǎng)過夜。

1.2.3 細菌的生化試驗 將60株命名的分離菌純培養(yǎng)物分別接種于5%乳糖、海藻糖、水楊苷、七葉苷、甘露醇、菊糖、山梨醇等糖發(fā)酵培養(yǎng)基，6.5%NaCl高鹽肉湯，馬尿酸鈉等生化培養(yǎng)基中，培育后記錄結果。

1.2.4 溶血試驗 以平板法(PA)和接觸法(CH)測定不同來源的鏈球菌。（1）PA法：將鏈球菌接種于5%綿羊鮮血平板，37℃培養(yǎng)48h后觀察，菌落周圍出現(xiàn)溶血圈者判為溶血陽性。（2）CH法：將鏈球菌接種于血清肉湯，37℃培養(yǎng)24h，取50μL菌液在“V”，形96孔微量滴定板上倍比稀釋后，與等體積1%綿羊紅細胞混合，37℃作用1h后觀察結果。

1.2.5 動物致病性試驗 將分離菌株接種到THB液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)24h后(含菌量約為2.0×108CFU/ ml)。動物試驗取分離菌株肉湯培養(yǎng)物，每株分離菌接種2只小鼠，每只腹腔接種0.1ml細菌培養(yǎng)物，同時取2只小鼠作對照，腹腔接種0.1ml生理鹽水。對注射后的小鼠分別隔離飼養(yǎng)，連續(xù)觀察7d。觀察其發(fā)病及死亡情況，對死亡的及時解剖，無菌采肝臟，脾臟病料，涂片，革蘭氏染色，鏡檢。并在鮮血瓊脂平板上劃線，分離培養(yǎng)。

1.2.6 蘭氏血清分群試驗 按鏈球菌乳膠凝集診斷試劑說明書的方法，將待檢分離菌株接種于7%綿羊血腦心湯瓊脂培養(yǎng)基，經(jīng)過37℃培養(yǎng)24h，然后每個菌株選取2~3個菌落接種到含有0.4ml專用提取酶的EP管中，混勻后放37℃溫箱中恒溫孵育10~15min。將C、D、E、R、S型乳膠混勻后，取1滴滴在反應卡的相應位置，再取消化好的菌液滴1滴于乳膠滴旁作凝集試驗，并設PBS空白對照，2 min后判定結果。出現(xiàn)明顯的凝集顆粒即為陽性，未出現(xiàn)凝集的為陰性。

1.2.7 血清學型診斷試驗 取自行分離的菌株接種于5%綿羊血平板培養(yǎng)物的菌體，用結晶紫染色，然后用常規(guī)方法以豬鏈球菌1-34型和1/2型的標準陽性血清作玻片凝集試驗，同時設PBS空白對照。在平片每格分別標上標準陽性血清的編號，每格分別滴加20μL待檢抗原；在每一格滴加等量相應的陽性血清；用槍頭混勻被檢抗原和相應血清，形成直徑2mm的液區(qū)，輕微晃動，室溫下4min內觀察結果,出現(xiàn)大顆粒沉淀者判為陽性。對已確定其血清型的菌株按照其地域來源進行分類，確定豬鏈球菌不同血清型在濰坊地方的分布狀況。

1.2.8 統(tǒng)計不同血清型菌株的地域分布狀況 對已確定其血清型的菌株按照其地域來源進行分類，確定豬鏈球菌不同血清型在濰坊地方的分布狀況。

2 結果

2.1 濰坊豬場的流行病學調查情況

規(guī)?；i場數(shù)和散養(yǎng)戶數(shù)的年度產(chǎn)仔數(shù)、豬鏈球菌病的發(fā)病率、死亡率等情況，詳見表1和表2。規(guī)?；i場鏈球菌病的發(fā)病率達1.99%~2.12%，散養(yǎng)戶豬場鏈球菌病的發(fā)病率達16.49%~22.91%，兩者之間差異極顯著(P<0.01)；規(guī)?；i場鏈球菌病的死亡率達0.23%~ 0.48%，散養(yǎng)戶豬場鏈球菌病的發(fā)病率達2.51%~2.81%，兩者之間差異極顯著(P<0.01)。不同年度之間規(guī)?；i場與散養(yǎng)戶豬場鏈球菌病的發(fā)病率、死亡率差異不顯著(P>0.05)。

表1 規(guī)模化養(yǎng)豬場發(fā)生豬鏈球菌病的情況 (個、頭、%)

表2 散養(yǎng)戶發(fā)生豬鏈球菌病的情況 (個、頭、%)

2.2 細菌分離

對鏈球菌病死豬淋巴結、脾、肝、腦或關節(jié)囊液(關節(jié)炎型)等部位病料進行涂片，經(jīng)革蘭氏染色后鏡檢，可見革蘭氏陽性球菌，多呈單個或成對排列，還可見多個相連的短鏈，偶見長鏈。無菌挑取5%綿羊血液瓊脂平板上典型菌落涂片，再次進行革蘭氏染色，可見成對、短鏈、極少長鏈狀的革蘭氏陽性菌。從疑似鏈球菌病病豬，分離出60株鏈球菌，敗血型、腦膜炎型、關節(jié)炎型和其他型病豬分別分離出25、12、15和8株鏈球菌。

2.3 豬源鏈球菌分離株來源及分布情況

在262份病例中，對其中比較清楚的病例分離到的60株分離株進行了豬源鏈球菌臨床癥狀類型分類。結果發(fā)現(xiàn)，來自濰坊市濰城區(qū)、坊子區(qū)、寒亭區(qū)，青州、諸城、安丘、昌邑、壽光、高密、臨朐、昌樂11個縣市豬鏈球菌病發(fā)病豬場，病豬表現(xiàn)為敗血型的占41.7%，腦膜炎型的占20%，關節(jié)炎型占25%，其他病型占13.3%，分布情況及菌株編號見表3。

表3 豬源鏈球菌分離株來源分布及編號

2.4 細菌的生化試驗

將60個分離菌株分別接種于乳糖、海藻糖、水楊苷、七葉苷、甘露醇、菊糖、山梨醇等糖發(fā)酵培養(yǎng)基，6.5%NaCl高鹽肉湯，馬尿酸鈉等生化培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)這些分離株均能發(fā)酵乳糖、海藻糖、水楊苷、七葉苷，不發(fā)酵甘露醇、山梨醇，菊糖反應緩慢，NaCl高鹽肉湯和馬尿酸鈉均為陰性。

2.5 溶血試驗

溶血試驗 PA、CH兩種方法檢測分離株以及對照株均為溶血陽性，溶血價在4~32之間。

2.6 致病性試驗

小鼠于攻毒后24h開始死亡，48h內部分死亡。臨床診斷，小鼠精神沉郁，厭食。皮膚有出血點，糞便干燥，小便呈黃褐色。死后剖檢可見肝、脾、腎腫大，胸腔積液，心包積液，心肌出血。用肝臟及脾臟涂片，革蘭氏染色鏡檢，發(fā)現(xiàn)有大量單個、成對或3~18個左右的短鏈革蘭氏陽性球菌。對照組小鼠未見異常。

2.7 蘭氏血清分群鑒定結果

蘭氏血清分群鑒定結果表明，來自濰坊市濰城區(qū)、坊子區(qū)、寒亭區(qū)，青州、諸城、安丘、昌邑、壽光、高密、臨朐、昌樂11個縣市豬源鏈球菌血清群以蘭氏分群R群為主，占調查總數(shù)的45%，其次為C群鏈球菌，占30%，S群3株，D群3株，E群4株，待定5株(見表4)。

表4 60株豬源鏈球菌分離株蘭氏分群鑒定結果

2.8 血清型鑒定結果

來自濰坊市11個縣市豬源鏈球菌血清型SS2型為主，占調查總數(shù)的46.67%、SS1占5%、SS7型占8.33%、SS9型8.33%、14型6.67%、待定25.00%，具體數(shù)據(jù)見表5。

表5 60株豬源鏈球菌分離株血清型鑒定結果分布

3 討論

SS在豬群中的感染相當普遍，各種年齡、性別和品種的豬都易感。20世紀60年代，豬鏈球菌病在我國大面積流行。廣東、廣西、四川、福建、江蘇、安徽等地相繼爆發(fā)。1976年，四川爆發(fā)豬鏈球菌病導致100多萬頭豬發(fā)病，死亡70多萬頭。1998~1999年，江蘇省南通地區(qū)豬群暴發(fā)豬鏈球菌病，發(fā)病率26.38%，病死率達47.21%[9]。豬鏈球菌病給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，因此積極開展本病的流行病學調查有著重要的意義。本研究發(fā)現(xiàn)，規(guī)模化養(yǎng)殖場和散養(yǎng)戶豬鏈球菌發(fā)病率均較高。而規(guī)?；B(yǎng)殖場的發(fā)病率和死亡率均極顯著低于散養(yǎng)戶，這應該與規(guī)?；i場飼養(yǎng)環(huán)境衛(wèi)生，消毒嚴格等降低了豬鏈球菌的感染幾率有關。豬鏈球菌病發(fā)生有一定季節(jié)性，10月份至次年4月份多發(fā)，說明此病的發(fā)生與氣候有關，且陰冷潮濕的冬春季節(jié)是本病的高發(fā)季節(jié)。而章紅兵報道，該病發(fā)病沒有明顯的季節(jié)性，一年四季都有發(fā)生。但以4~10月份的夏秋季節(jié)發(fā)病率高，春冬季發(fā)病較少。魏明奎等認為，豬鏈球菌病一年四季均可發(fā)生，但以5~11月份發(fā)生較多[10]。鄒以仁等認為，豬鏈球菌病的發(fā)生一般無非常明顯的季節(jié)性變化，但調查結果說明，6、7、8月份發(fā)病較少，這可能與氣候炎熱、病原菌生存困難有關。

傳統(tǒng)上我國豬鏈球菌病以C群流行為主，近幾年的流行趨勢，似正在發(fā)生一此轉變[11]。1993年，陳永林等發(fā)現(xiàn)國內19個省(市、區(qū))豬鏈球菌以C群占優(yōu)勢，約占72.22%，D群占7.14%，S和R群各占4.76%；E、H、T各占0.79%。2001年，徐滌平等發(fā)現(xiàn)湖北、湖南、河南、江西和遼寧等省豬源致病性鏈球菌C群40株、E群11株、D群8株、R群4株，各占63.49%、17.46%、12.7%和6.35%。2003年，張桂榮發(fā)現(xiàn)古林省鏈球菌D群占45%、C群25%、E群15%和A群5%，蘭氏分類法不能分群10%。2005年，馬增軍等發(fā)現(xiàn)河北秦皇島、唐山等地豬源鏈球菌以D群為主，其次為C群。2007年，李春玲等發(fā)現(xiàn)廣東各地豬場鏈球菌以D群為主，其后依次為C、G和F群，未能定群12株，各血清群菌株分布無明顯地域。相似的是，近兩年來濰坊市濰城區(qū)、坊子區(qū)、寒亭區(qū)，青州、諸城、安丘、昌邑、壽光、高密、臨朐、昌樂11個縣市地區(qū)豬源鏈球菌血清群同樣以R群為主，占調查總數(shù)的45%，其次為C群鏈球菌，占30%，A群3株，B群4株，待定8株。這與國內傳統(tǒng)上的報道以C群為主有些變化，而與國外有些報道相類似，如在美國、加拿大等國，從敗血癥和腦炎患豬中分離的鏈球菌主要是D群鏈球菌的某些血清型，只有少數(shù)C群類馬鏈球菌和L群引起心內膜炎和敗血癥。此外，盡管在國內見有S群或R群的1型或2型豬鏈球菌致病的報道，但目前發(fā)生和流行可能具有一定的地域性。

目前，我國用于該病免疫預防的疫苗仍以C群獸疫鏈球菌弱毒株為疫苗株的弱毒活疫苗為主，而與當?shù)氐呢i鏈球菌病流行菌株血清群并不完全相符，這可能是豬鏈球菌病不能得到有效控制的主要原因。因此，在對當?shù)刎i鏈球菌病進行血清學調查的基礎上，研制針對當?shù)亓餍芯暄迦?型)的豬鏈球菌病疫苗為控制該病的有效措施。

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（2014–01–23）

S852.61+1

A

1007-1733(2014)05-0001-04