陳 卓 侯俊杰 楊曉泉

米黑毛酶提高大豆分離蛋白泡沫穩(wěn)定性的研究

陳 卓 侯俊杰 楊曉泉

（華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院食物蛋白質(zhì)工程研究中心，廣州 510640）

通過測(cè)定不同水解pH條件、不同水解時(shí)間、不同攪打起泡pH條件下大豆分離蛋白（SPI）的泡沫穩(wěn)定性，結(jié)合SDS-PAGE分析，水解度分析及蛋白分子表面疏水性分析，為利用米黑毛酶水解大豆分離蛋白制備高泡沫穩(wěn)定性大豆蛋白制品提供一定的理論依據(jù)。顯示結(jié)果表明：SPI經(jīng)米黑毛酶在pH 3.5處水解45～60 min后，回調(diào)pH至5.0攪打起泡的泡沫穩(wěn)定性最優(yōu)；隨水解時(shí)間增長，SPI的泡沫穩(wěn)定性有不同程度提高。通過酶解作用，伴隨SPI的蛋白分子量減小，蛋白分子表面疏水性增加，泡沫的穩(wěn)定性顯著提高。

米黑毛酶 大豆分離蛋白 泡沫穩(wěn)定性

大豆分離蛋白具有高營養(yǎng)價(jià)值和良好功能性質(zhì)，在食品工業(yè)中的應(yīng)用日趨廣泛。大豆分離蛋白分子包含疏水性基團(tuán)和親水性基團(tuán)，因而具有表面活性，能降低水的表面張力［1］，在劇烈攪拌時(shí)形成泡沫，常用作食品中的乳化劑和界面穩(wěn)定劑。同時(shí)在攪打稀奶油、冰淇淋、巧克力等充氣食品中，蛋白質(zhì)的泡沫性能對(duì)食品的結(jié)構(gòu)起了重要的穩(wěn)定作用［2］。

改善蛋白泡沫性能的3個(gè)關(guān)鍵因素是：減小蛋白分子量，增大蛋白分子表面疏水性以及改變蛋白分子的微結(jié)構(gòu)［3］。相較于安全性不高的磷酸化法［4］，蛋白質(zhì)的酶法水解可以在不降低營養(yǎng)價(jià)值的前提下改善其理化和功能性質(zhì)，且反應(yīng)高效、溫和、安全，是改善蛋白功能特性的更優(yōu)手段?，F(xiàn)有酶法水解技術(shù)雖然可以顯著提高大豆蛋白的起泡能力，但同時(shí)也會(huì)降低其泡沫穩(wěn)定性［5-6］。一般來說，提高起泡特性既要提高其起泡能力又要提高其泡沫穩(wěn)定性，而對(duì)于蛋白質(zhì)來說，提高其泡沫穩(wěn)定性更有意義。

米黑毛酶能迅速、專一地打開 k-酪蛋白的Phe105-Met106鍵，作為凝乳酶廣泛應(yīng)用于制作干酪［7］，但其在植物蛋白方面的應(yīng)用報(bào)道較少。

在前人對(duì)米黑毛酶的高效凝乳作用機(jī)理的研究基礎(chǔ)上［8-9］，本研究試想利用米黑毛酶專一地打開SPI中某些化學(xué)鍵，使水解產(chǎn)物中親水性和疏水性側(cè)鏈基團(tuán)的存在狀態(tài)及分布發(fā)生變化，從而提高泡沫穩(wěn)定性。本試驗(yàn)對(duì)不同水解pH條件、不同水解時(shí)間、不同攪打起泡pH條件下，SPI水解產(chǎn)物的泡沫穩(wěn)定性進(jìn)行了試驗(yàn)分析，結(jié)合SDS-PAGE分析，水解度分析及蛋白分子表面疏水性分析，探討了利用米黑毛酶水解SPI制備高泡沫穩(wěn)定性大豆蛋白制品的理論依據(jù)。本研究旨在開發(fā)一種高泡沫穩(wěn)定性的大豆蛋白制品，實(shí)現(xiàn)更有目的性地對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行改性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

低溫脫脂大豆粕購于山東禹王有限公司，粉碎過80目篩后儲(chǔ)存于4℃下密閉容器中。豆粉蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（55.5±0.4）%，氮溶指數(shù)84.0%。所用化學(xué)試劑均為分析純。米黑毛酶（Marzyare 150MG）購于丹尼斯克有限公司。

UV2300紫外可見分光光度計(jì)、F-7000日立熒光光譜儀：日立（Hita chi）公司；pHs-3C數(shù)顯 pH計(jì)：上海雷磁儀器廠；APV-1000高壓均質(zhì)機(jī)：丹麥APV公司；rapid N cube杜馬斯定氮儀：法國Elementar公司；Alp Ha-4冷凍干燥機(jī)：德國 MATRIN CHRIST公司；PYCZ-30垂直板電泳儀：北京六一儀器廠。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 大豆分離蛋白的制備

采用堿溶酸沉法［10］制備大豆分離蛋白，杜馬斯定氮法測(cè)得蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（90.80±0.26）%，SDS-PAGE檢測(cè)純度可達(dá)90%以上。

1.2.2 水解產(chǎn)物的制備

系列1：1 g／mL SPI溶液 50 mL，90℃水浴 30 min，冷卻到室溫，調(diào) pH至3.5，加入0.2%米黑毛酶，于50℃水浴條件下反應(yīng)，每隔15 min進(jìn)行取樣。水浴過程中通過滴加 1 mol／L HCl（1 mol／LNaOH）保持反應(yīng)pH于3.5。樣品85℃水浴15 min滅酶。

系列2：酶的底物調(diào)pH至7.0，水解反應(yīng)保持pH于7.0，其他同系列1。

1.2.3 泡沫穩(wěn)定性的測(cè)定

1 g／mL SPI溶液及不同酶水解的產(chǎn)物分別調(diào)pH至5.0和7.0，每份樣品于轉(zhuǎn)速12 000 r／min均質(zhì)2 min。均質(zhì)后快速傾倒至量筒，記錄泡沫體積及泡液混合物總體積，計(jì)算泡液比。

1.2.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）

根據(jù)Laemmli［11］的方法進(jìn)行 SDS-PAGE分析，濃縮膠和分離膠質(zhì)量濃度分別為5 g／mL和12 g／mL，考馬斯亮藍(lán)R-250染色。樣品濃度為0.2，上樣量為7μL。每條帶的相對(duì)分子質(zhì)量使用 Sigmamarker（Mr 14 400～97 400）作為標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)定。

1.2.5 水解度的測(cè)定

根據(jù)Nielsen［12］的方法進(jìn)行水解度測(cè)定。OPA試劑：將7.620 g硼砂和200 mgSDS溶于重蒸水，然后定容至150 mL，搖勻配制成A液；160 mgOPA溶于4 mL乙醇制成B液；將B液加入A液，混合均勻，再加入176 mg DTT，定溶至200 mL，避光保存。樣品為水解液40μL，稀釋10倍后加入3 mLOPA試劑，混合均勻，37℃水浴2 min，在波長340 nm處測(cè)定吸光值。標(biāo)準(zhǔn)溶液為400μL絲氨酸溶液（質(zhì)量濃度0.1 mg／mL）加入3 mL OPA試劑?？瞻捉M為400μL去離子水加入3 mL OPA試劑。

式中：X為樣品中蛋白質(zhì)含量，P為樣品中蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)，α＝0.970，β＝0.342，htot＝7.8。

1.2.6 表面疏水性的測(cè)定（熒光探針ANS法）

表面疏水性是用1-苯氨基萘-8-磺酸（ANS）作為熒光探針進(jìn)行測(cè)定［13］。將 1 g／mL SPI酶解液稀釋成0.2 mg／mL酶解液樣品。將濃度為 2.5 mmol／L的10μL ANS溶液分10次（每次1μL）加入8 mL樣品溶液。使用熒光光譜儀分別在390 nm（激發(fā)波長）和470 nm（發(fā)射波長）下測(cè)定熒光強(qiáng)度。電壓600 mV。每個(gè)樣品平行測(cè)定5次。樣品的熒光強(qiáng)度值扣除試劑空白值即為蛋白的相對(duì)熒光強(qiáng)度值F。已加入樣品中的ANS的濃度記作L0。并以1／F和1／L0作回歸曲線，計(jì)算表面疏水性指數(shù)（PSH）。

式中：Fmax為最大熒光強(qiáng)度，Kd為表面電離常數(shù)；

式中：X＝0.2 mg／mL。

1.2.7 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析

除特殊說明外，每個(gè)試驗(yàn)均重復(fù)3次，每個(gè)測(cè)定均重復(fù)3次。結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。應(yīng)用SPSS 11.5軟件（SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）中的One-Way ANOVA對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，利用鄧肯式多重比較對(duì)差異顯著性進(jìn)行分析；應(yīng)用Pearson correlation test進(jìn)行變量之間的相關(guān)性分析。P＜0.05表示顯著，P＜0.01表示極顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 米黑毛酶對(duì)SPI水解度及組成的影響

2.1.1 水解度的分析

由圖1結(jié)果可知，隨著酶解時(shí)間增加，SPI的水解程度不斷加深。在pH 3.5水解條件下米黑毛酶的水解效率較高，酶解60 min后水解程度最深，說明經(jīng)米黑毛酶處理的SPI溶液，蛋白小分子數(shù)量增加較多，結(jié)合SDS-PAGE圖譜，也可得到此結(jié)論。

圖1 SPI經(jīng)米黑毛酶在不同pH不同酶解時(shí)間處理后的水解度

2.1.2 SDS-PAGE電泳分析

由圖2可知，在電泳圖譜中，與原SPI樣品相比，米黑毛酶于pH 7.0水解的樣品中（圖2：1～4），條帶變化不明顯，說明米黑毛酶在中性環(huán)境下，較難降解SPI各亞基。米黑毛酶于pH 3.5水解的樣品中（圖2：5～8），各亞基降解消失的程度明顯，同時(shí)伴隨有新的條帶產(chǎn)生，酶解時(shí)間不同，SPI的蛋白小分子條帶都有不同程度的增加。

圖1 SPI經(jīng)米黑毛酶在不同pH不同酶解時(shí)間處理后的SDS-PAGE電泳圖譜

2.1.3 表面疏水性的分析

由表1可知，與SPI溶液相比，經(jīng)米黑毛酶處理的樣品的表面疏水性指數(shù)明顯提升。分析認(rèn)為，這是由于在酶處理過程中，維持大豆蛋白結(jié)構(gòu)的次級(jí)鍵斷開，埋藏于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露所致［14］，從而提高了其表面疏水性。然而不同酶解時(shí)間的酶解液相比較，表面疏水性變化較小，有待進(jìn)一步研究。

表1 SPI經(jīng)米黑毛酶不同酶解條件處理的表面疏水性

2.2 pH 7.0酶解條件下米黑毛酶對(duì)SPI泡沫穩(wěn)定性的影響

由圖3結(jié)果可知，在pH 7.0中性條件下，SPI經(jīng)米黑毛酶酶解不同時(shí)間后，再調(diào)至pH 7.0攪打起泡，隨著時(shí)間的增加，泡沫穩(wěn)定性急劇下降。由圖4可知，若將酶解液調(diào)至pH 5.0攪打起泡，不同酶解時(shí)間的產(chǎn)物泡沫穩(wěn)定性變化不明顯，但都優(yōu)于未經(jīng)酶解的SPI溶液。總體分析認(rèn)為，中性環(huán)境不利于米黑蛋白酶發(fā)揮活性。

圖3 pH 7.0處不同酶解時(shí)間米黑毛酶對(duì)SPI泡沫穩(wěn)定性的影響（在pH 7.0處攪打起泡）

圖4 pH 7.0處不同酶解時(shí)間米黑毛酶對(duì)SPI泡沫穩(wěn)定性的影響（在pH 5.0處攪打起泡）

2.3 pH 3.5酶解條件下米黑毛酶對(duì)SPI泡沫穩(wěn)定性的影響

由圖5、圖6結(jié)果可知，在pH 3.5酸性條件下，SPI經(jīng)米黑毛酶酶解不同時(shí)間后，再調(diào)pH至7.0或5.0攪打起泡，隨著時(shí)間增加，泡沫的穩(wěn)定性也依次增加。由圖5可知，SPI在pH 3.5處酶解45 min與酶解60 min的產(chǎn)物相比，泡液比沒有明顯變化，基本穩(wěn)定在45%附近。由圖6可知，若將酶解產(chǎn)物再回調(diào)pH至5.0攪打起泡，產(chǎn)物的泡液比最高能保持在50%附近，泡沫穩(wěn)定性得到很大提高。

圖5 pH 3.5處不同酶解時(shí)間米黑毛酶對(duì)SPI泡沫穩(wěn)定性的影響（在pH 7.0處攪打起泡）

圖6 pH 3.5處不同酶解時(shí)間米黑毛酶對(duì)SPI泡沫穩(wěn)定性的影響（在pH 5.0處攪打起泡）

由圖3～圖6結(jié)果分析認(rèn)為，米黑毛酶更適宜應(yīng)用到酸性食品中，在中性食品中泡沫穩(wěn)定性的改變并不顯著。同時(shí)，在接近SPI等電點(diǎn)的pH 5.0處攪打起泡，泡沫穩(wěn)定性都優(yōu)于pH 7.0處攪打起泡的泡沫穩(wěn)定性。分析認(rèn)為，溶液pH值接近等電點(diǎn)時(shí)，產(chǎn)生的凝聚物有利于提高泡沫穩(wěn)定性，且此時(shí)的泡沫均勻黏稠，氣泡細(xì)密較小。綜合SDS-PAGE、水解度、表面疏水性三者結(jié)果，分析認(rèn)為，通過米黑毛酶在酸性條件下對(duì)SPI的水解，可以在一定程度上降低蛋白分子量，增加蛋白分子表面疏水性，達(dá)到提高泡沫穩(wěn)定性的目的，這與Duyer等［3］的研究結(jié)果基本一致。

3 結(jié)論

本研究嘗試?yán)妹缀诿笇Ｒ坏卮蜷_SPI中某些化學(xué)鍵，使水解產(chǎn)物中親水性和疏水性側(cè)鏈基團(tuán)的存在狀態(tài)及分布發(fā)生變化，從而提高泡沫穩(wěn)定性。在保持大豆蛋白良好的起泡能力的前提下，顯著提高了泡沫穩(wěn)定性，且效果持久明顯，實(shí)現(xiàn)了更加有目的性地對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行改性，提高了大豆蛋白的功能特性，有助于拓寬其在食品工業(yè)中作為配料應(yīng)用的范圍。

研究結(jié)果表明，SPI經(jīng)米黑毛酶在pH 3.5處水解45～60 min后，回調(diào)pH至5.0攪打起泡的泡沫穩(wěn)定性最優(yōu)；隨水解時(shí)間增長，SPI的泡沫穩(wěn)定性有不同程度提高；酶解液在pH 5.0處攪打起泡的泡沫穩(wěn)定性優(yōu)于在pH 7.0處攪打起泡。通過酶解作用，伴隨SPI的蛋白分子量減小，蛋白分子表面疏水性增加，泡沫的穩(wěn)定性提高。

［1］王金梅.大豆蛋白熱聚集行為及界面、乳化性質(zhì)研究［D］.廣州：華南理工大學(xué)，2012

［2］丁汀.高乳化性大豆蛋白的制備及其應(yīng)用研究［D］.廣州：華南理工大學(xué)，2011

［3］Dwyer M D，He Lizhong，Michael James，et al.The effects of acid hydrolysis on protein biosurfactant molecular，interfacial，and foam properties：pH responsive protein hydrolysates［J］.Soft Matter，2012，8（19）：5131-51399

［4］莫文敏，曾慶孝.蛋白質(zhì)改性研究進(jìn)展［J］.食品科學(xué)，2000，21（6）：6-10

［5］Yuan Boen，Ren Jiaoyan，Zhao Mouming，et al.Effects of limited enzymatic hydrolysis with pepsin and high-pressure homogenization on the functional properties of soybean protein isolate［J］.LWT-Food Science and Technology，2012，46（2）：453-459

［6］陳潔，何志勇，唐學(xué)燕，等.一種高效大豆蛋白起泡劑的制備方法：中國，200810195988.6［P］.2009-02-18

［7］姜峰，張?zhí)m威.我國凝乳酶特性及其替代品的研究現(xiàn)狀［J］.食品研究與開發(fā)，2003，24（6）：3-6

［8］Channe P S，Shewale JG.Influence of culture conditions on the formation of milk-clotting protease by Aspergillus niger MC4［J］.World JMicrobiol Biotechnol，1998（14）：11-15

［9］Hashem A M.Optimization of milk-clotting enzyme productivity by Penicillium oxalicum［J］.Bioresource Technology，1999（70）：203-207

［10］Iwabuchi S，Yamauchi F.Determination of glycinin-in andβ-conglycinin in soybean proteins by 8 mmol／L-une mological methods［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1987，35（2）：200-205

［11］Laemmli U K.Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4［J］.Nature，1970，227：680-685

［12］Nielsen P M，Petersen D，Dambmann C.Improved method for determining food protein degree of hydrolysis［J］.Journal of Food Science，2001，66（5）：642-646

［13］Wang Jinmei，Yang Xiaoquan，Yin Shouwei，et al.Structural rearrangement of ethanol-denatured soy proteins by high hydrostatic pressure treatment［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2011，59（13）：7324-7332

［14］Sun Xiangdong.Enzymatic hydrolysis of soy proteins and the hydrolysates utilisation［J］.International Journal of Food Science and Technology，2011，46（12）：2447-2459.

The Enhancement Effects of Mucor Miehei on the Foam Stability Properties of Soybean Protein Isolate

Chen Zhuo Hou Junjie Yang Xiaoquan
（Research and Development Center of Food Proteins，College of Light Industry and Food Sciences，South China University of Technology，Guangzhou 510640）

The foam stability properties of SPI were measured at different pH and different time in this study with the analysis on the SDS-PAGE，degree of hydrolysis and surface hydrophobicity，providing theoretical foundation for the SPI products with high foam stability prepared by Mucor miehei.The results showed that the sample with the best foam stability properties was hydrolysed by Mucor miehei at pH 3.5 for 45～60 min；then it turned pH to 5.0.With the increase of time，the foam stability properties of SPI were improved at different degree.Through enzymatic hydrolysis，the foam stability properties of SPI were enhanced substantially with the decrease of SPI protein molecule weights and the increase of surface hydrophobicity.

soybean protein isolates，Mucor miehei，foam stability

TS21

A

1003-0174（2014）03-0052-05

“十二五”國家科技支撐計(jì)劃（2012BAD33B10-2，2012BAD34B04-2），國家自然科學(xué)基金（31130124）

2013-04-17

陳卓，女，1989年出生，碩士，植物蛋白加工與利用

楊曉泉，男，1965年出生，教授，博士生導(dǎo)師，植物蛋白加工與利用