付曉華 張 巖 張 薇 王 紅， 吳 濤 周 巍，3

棉籽油中DNA不同提取方法的比較研究

付曉華1張 巖2張 薇2王 紅1，2吳 濤2周 巍2，3

（河北師范大學(xué)生命科學(xué)院1，石家莊 050024）
（河北省食品安全監(jiān)督檢驗(yàn)研究院2，石家莊 050071）
（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院3，保定 071000）

在食用油DNA提取的SDS法和國(guó)標(biāo)法基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)5種不同方案對(duì)15種來(lái)自不同生產(chǎn)廠家及加工精度的棉籽油進(jìn)行DNA的抽提，通過比較各來(lái)源DNA提取液中內(nèi)源基因tRNALeu的PCR擴(kuò)增結(jié)果判斷DNA的提取效率；并對(duì)方案5獲得的DNA樣品進(jìn)行外源基因FMV35S的PCR擴(kuò)增以檢測(cè)轉(zhuǎn)基因成分。結(jié)果表明方案5提取棉籽油DNA的效率最高，而且方案5提取到的DNA能用于棉籽油的轉(zhuǎn)基因成分定性檢測(cè)。

棉籽油 DNA提取 富集 轉(zhuǎn)基因物種

食用油安全是人們健康生活的保證。棉籽油多以棉籽浸制而成，在人體內(nèi)的消化吸收率可達(dá)98%，其亞油酸含量高（44.0%～55.0%），可有效抑制血液中的膽固醇；此外還含棕櫚酸、硬脂酸、油酸、花生酸等營(yíng)養(yǎng)成分。過去由于粗制棉籽油中含有游離棉酚，限制了人們的大量食用。隨著加工工藝的改進(jìn)，精制棉籽油將棉酚有效去除，棉籽油的市場(chǎng)占有率呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)。棉籽油已成為很多食用調(diào)和油的主要成分。

轉(zhuǎn)基因作物的種植率近年來(lái)不斷增加，轉(zhuǎn)基因食用油的市場(chǎng)占有率也越來(lái)越高。2002年，《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識(shí)管理辦法》中要求對(duì)上市的大豆油、玉米油、油菜籽油、棉花種子進(jìn)行轉(zhuǎn)基因標(biāo)識(shí)。2003年規(guī)定了對(duì)食用油脂中轉(zhuǎn)基因植物成分定性PCR檢測(cè)的方法［1-2］。這為油脂原料成分的鑒定和標(biāo)簽標(biāo)識(shí)檢驗(yàn)提供了技術(shù)保證，對(duì)保護(hù)消費(fèi)者權(quán)益和確保食品安全具有重要意義。

目前轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)主要依靠蛋白質(zhì)檢測(cè)和核酸檢測(cè)兩方面。蛋白質(zhì)檢測(cè)常規(guī)方法主要

有ELISA法，即酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法，其原理是利用表達(dá)的抗原與目標(biāo)抗體間結(jié)合的特異性來(lái)檢測(cè)特定蛋白的存在。核酸檢測(cè)法則主要依賴聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，其利用與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物對(duì)DNA序列進(jìn)行檢測(cè)，具有更高的檢測(cè)靈敏度。由于特征基因已知，食用油脂中的轉(zhuǎn)基因植物成分定性檢測(cè)主要通過核酸檢測(cè)技術(shù)鑒定［3-13］。簡(jiǎn)便高效的DNA提取方法，是進(jìn)行核酸檢測(cè)和轉(zhuǎn)基因標(biāo)簽鑒定的基礎(chǔ)。

DNA的提取方法已不斷深入，發(fā)展較成熟的DNA提取方法有硅藻土法、磁珠法、離心柱法和試劑盒法等［14］。梅玲玲等［15］用蛋白酶 K裂解法提取出多種食品中的轉(zhuǎn)基因成分，從中獲得高濃度的食用油 DNA提取液；程紅梅等［5］、袁建琴等［6］用中性磷酸鹽緩沖溶液（PBS）和正己烷提取出大豆油中的DNA；楊冬燕等用CTAB直接抽提精煉植物油，得到了目的DNA。但由于精煉食用油中DNA含量本身很少，不能保證所有油中的DNA提取成功。因此，開發(fā)成本低、高效、穩(wěn)定的方法是油類DNA檢測(cè)研究的重點(diǎn)。

目前DNA的常用提取試劑有SDS和CTAB 2種。本試驗(yàn)用CTAB和SDS 2種常規(guī)提取液，采用5種方案對(duì)15種來(lái)自不同生產(chǎn)廠家及加工精度的棉籽油進(jìn)行DNA的提取。通過擴(kuò)增內(nèi)源基因tRNALeu并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，對(duì)各方案的DNA提取效率進(jìn)行評(píng)價(jià)，以期獲得一種簡(jiǎn)便高效的DNA提取方法。

1 材料與方法

1.1 試劑及主要試劑的配制

三羥甲基氨基甲烷（Tris）、醋酸鈉（NaAc）：天津市博迪化工有限公司；乙二胺四乙酸二鈉（Na2EDTA）：北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；十二烷基硫酸鈉（SDS）：北京拜爾迪生物公司；分析純級(jí)三氯甲烷、異戊醇、異丙醇、無(wú)水乙醇、氯化鈉（NaCl）：天津市永大化學(xué)試劑有限公司；β-巰基乙醇：Amresco公司；100 bp DNA Ladder Marker，rTaq預(yù)混液、引物tRNALeu、FMV35S：大連寶生物技術(shù)公司合成。

擔(dān)體：本單位自提非轉(zhuǎn)基因大豆基因組DNA；TE緩沖液：Tris 0.010 mol／L，Na2EDTA 1.0 mmol／L，pH 8.0；CTAB提取液：CTAB 20 g／L，NaCl 1.4 mol／L，Tris 0.1 mol／L，Na2EDTA 0.02 mol／L，pH 8.0。

1.2 試驗(yàn)材料與儀器

試驗(yàn)儀器：恒溫水浴鍋：余姚市東方電工儀器廠；恒溫震蕩器：金壇市富華電器有限公司；MS3渦旋混勻器：IKA公司；水平電泳儀：北京市六一儀器廠；050-811 Tgradient96定性 PCR儀：Biometra TGradient公司；凝膠成像系統(tǒng)：Bio-Rad公司。

表1 棉籽油試驗(yàn)材料

1.3 棉籽油DNA的提取

本試驗(yàn)采用SDS和CTAB 2種常規(guī)提取液，以SDS法和國(guó)標(biāo)法［1］為基礎(chǔ)，并對(duì)國(guó)標(biāo)法進(jìn)行優(yōu)化，最終確立SDS法、國(guó)標(biāo)法、大量富集法、直接裂解法、上清重復(fù)離心法5種方案。由于5種方案遵循共同的DNA提取步驟，精簡(jiǎn)介紹如下：A.DNA富集：TE緩沖液中加入棉籽油，混勻后，13 000 r／min，室溫離心3 min，棄油脂；重復(fù)多次使 DNA富集于水相。水相400μL／管分裝于1.5 mL離心管。B.裂解：水相中加入SDS／CTAB提取液，65℃水浴30 min，每10 min輕微搖勻1次。C.純化，分離有機(jī)相：SDS提取液裂解后加入醋酸鈉溶液（NaAc），而用CTAB提取液裂解后加入等體積三氯甲烷：異戊醇（24：1）；輕微混勻后靜置，13 000 r／min，離心 5 min，轉(zhuǎn)移上清；反復(fù)抽提1次；D.沉淀DNA：上清中加入擔(dān)體及沉淀劑，輕微混勻后-20℃過夜；13 000 r／min，4℃，離心 10 min，棄上清；E.洗滌，干燥：用70%乙醇洗滌沉淀2次，干燥15 min；F.溶解 DNA：加入0.1×TE溶解 DNA，37℃保溫1 h后，4℃保存。

在基本流程的基礎(chǔ)上，5種DNA提取方案的優(yōu)化流程不同，具體步驟如下：

1.3.1 SDS法

A.400μL TE緩沖液中加入1 mL棉籽油，上下顛倒混勻5 min，離心3 min；去上層油脂；重復(fù)20次，得約400μL水相；→B.水相中加入200μL 20%SDS，水??；→C.加入 100μL 5 mol／L NaAc，輕輕搖勻，冰上放置30 min，離心10 min；→D.將上清移至新離心管，加入1μg擔(dān)體、等體積無(wú)水乙醇和0.1倍體積3 mol／L NaAc（pH 5.2），顛倒混勻后，-20℃放置2 h；離心，棄上清；→E.沉淀用500μL 70%乙醇洗滌兩次，干燥15 min；→F.加入30μL 0.1×TE。

1.3.2 國(guó)標(biāo)法

A.DNA富集同1.3.1；→B→C→D.沉淀DNA時(shí)加入1μg擔(dān)體，450μL異丙醇；→E.500μL 70%乙醇洗滌兩次；→F.加30μL 0.1×TE溶解DNA。

1.3.3 大量富集法

A.50 mL離心管中加入5 mL TE和35 mL棉籽油，富集15次并400μL／管分裝水相；→B→C.純化后所有上清移至一個(gè)10 mL離心管；→D.沉淀DNA時(shí)加入10μg擔(dān)體，0.6倍體積的異丙醇；→E.2 mL 70%乙醇洗滌2次；→F.用50μL 0.1×TE溶解DNA，37℃水浴1 h后移至1.5 mL離心管，4℃保存。

1.3.4 直接抽提法

A.50 mL離心管中加入5 mL含1%β-巰基乙醇的CTAB提取液（現(xiàn)用現(xiàn)配，65℃預(yù)熱）和35 mL棉籽油，180次／min，45℃，振蕩 30 min后，離心 5 min。去除油層，富集6次。水相按600μL／管加入1.5 mL離心管中；→C.每管加600μL三氯甲烷：異戊醇進(jìn)行純化，純化后所有上清移至10 mL離心管；→后續(xù)步驟同1.3.3。

1.3.5 上清重復(fù)離心法

A.50 mL離心管中加入35 mL棉籽油和5 mL TE，平置于振蕩儀，固定，180次／min，37℃，振蕩 30 min，離心5 min，去油脂層；富集 10次并 400μL／管分裝水相；→B→C.純化同1.3.3；→D.沉淀DNA時(shí)加入10μg擔(dān)體，0.6倍體積的異丙醇，-20℃過夜后離心15 min；并將上清輕輕移至另一10 mL離心管重復(fù)離心一次，棄上清；→E.2管均用2 mL 70%乙醇洗滌兩次；→F.2管中各用30μL 0.1×TE溶解DNA，37℃水浴1 h后移至同一個(gè)1.5 mL離心管，4℃保存。

1.4 效果評(píng)估

由于各方案在沉淀DNA過程中都加入了擔(dān)體，無(wú)法檢測(cè)棉籽油DNA實(shí)際濃度和純度，因此用PCR擴(kuò)增結(jié)果比較各方案的DNA提取效率。本試驗(yàn)對(duì)小片段內(nèi)源基因tRNALeu（180 bp）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以其產(chǎn)物的凝膠成像結(jié)果評(píng)估食用棉籽油DNA的提取效果，并對(duì)提取效率最高的方案中獲得的DNA進(jìn)一步用外源基因FMV35S（210 bp）進(jìn)行擴(kuò)增，驗(yàn)證DNA產(chǎn)物能否進(jìn)行棉籽油轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)。

1.4.1 PCR引物序列

表2 PCR引物序列及產(chǎn)物大小

1.4.2 μL PCR反應(yīng)體系

rTaq預(yù)混液12.5μL，10 mmol／L的上下游引物各1μL，DNA模板3μL，去離子水7.5μL。空白對(duì)照以無(wú)菌雙蒸水代替樣品提取DNA，陰性對(duì)照以擔(dān)體DNA為擴(kuò)增模板，陽(yáng)性對(duì)照以轉(zhuǎn)基因棉籽油為底物，在各方案中提取的DNA為擴(kuò)增模板。

1.4.3 PCR擴(kuò)增程序

tRNALeu擴(kuò)增程序：變性階段：95℃，4 min。擴(kuò)增階段：95℃，30 s；55℃，30 s；72℃，60 s；循環(huán) 30次。延伸階段：72℃，5 min。4℃終止反應(yīng)。

FMV35S擴(kuò)增程序：變性階段：95℃，5 min。擴(kuò)增階段：95℃，20 s；55℃，40 s；72℃，60 s；循環(huán) 40次。延伸階段：72℃，5 min。4℃終止反應(yīng)。

1.4.4 電泳檢測(cè)

取10μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀下觀察電泳結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品tRNALeu基因PCR檢測(cè)結(jié)果

圖1為以5種方案提取的DNA為模板，進(jìn)行內(nèi)源基因tRNALeu擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖。

圖1 5種方案提取的DNA產(chǎn)物進(jìn)行tRNALeu擴(kuò)增后的電泳結(jié)果

圖1結(jié)果顯示，SDS法擴(kuò)增的目的條帶最少，國(guó)標(biāo)法次之，直接抽提法、大量富集法、上清液重復(fù)離心法提取效率依次增高，分別得到4、5、6、10、12個(gè)目的條帶。其中2、6、10、11號(hào)樣品在5種方案中都擴(kuò)增出目的條帶，2號(hào)和6號(hào)樣品DNA擴(kuò)增條帶最亮，表明其DNA濃度高；1、9、13號(hào)樣品均未擴(kuò)增成功；其他樣品DNA在部分方案中擴(kuò)增出目的條帶。

從加工程度分析，2號(hào)和6號(hào)樣品為浸出三級(jí)棉籽油，10號(hào)和11號(hào)樣品為半精煉棉籽油，DNA在5種方案中全部提取成功；1、9、13為全精煉棉籽油，5種方案均未提取成功。表明棉籽油精煉程度越深，DNA降解越嚴(yán)重，含量可能越少。從樣品存放時(shí)間來(lái)看，3、9、13號(hào)樣品的存放時(shí)間均超過6個(gè)月，其他樣品的存放時(shí)間較短。食用油長(zhǎng)期存放也可能加重DNA的降解程度。

DNA富集步驟中，方案SDS法和國(guó)標(biāo)法的底物少，DNA提取效率低，后3種方案將樣品大量富集后，DNA提取效率增高。其中大量富集法是國(guó)標(biāo)法的直接改進(jìn)，加大樣品富集量后，提取DNA效率比國(guó)標(biāo)法增高了1倍。從操作步驟進(jìn)行分析，SDS法產(chǎn)物低也可能是沉淀過程中的pH不當(dāng)，影響了DNA的完全沉淀，造成DNA流失。直接裂解法用CTAB進(jìn)行富集和裂解處理，步驟簡(jiǎn)單，但結(jié)果提取效率偏低，可能由于富集過程油相和水相的交界面出現(xiàn)較多的膏狀物質(zhì)，形成了固體斜面，將其去除后水相產(chǎn)物減少；另外，該方案在CTAB提取液中加入1%β-巰基乙醇用于消泡、抗氧化及去除酚類，提取效率卻沒有提高，推測(cè)酚類物質(zhì)可能極少，不會(huì)干擾DNA的提取效率。上清重復(fù)離心法是本試驗(yàn)的最優(yōu)提取方案，在樣品大量富集的基礎(chǔ)上將離心管平置振蕩，加大了DNA在水相的溶解程度；適當(dāng)延長(zhǎng)了離心沉淀的時(shí)間，并將異丙醇沉淀后的上清液重復(fù)離心，DNA提取效率最高。

2.2 外源基因檢測(cè)結(jié)果

圖2為以方案5提取到的12個(gè)DNA產(chǎn)物為模板，進(jìn)行FMV35S外源基因擴(kuò)增的凝膠電泳圖，含轉(zhuǎn)基因成分的 3、4、8、12、14、15號(hào)樣品全部被檢測(cè)出。

檢測(cè)結(jié)果與產(chǎn)品標(biāo)簽一致，表明上清重復(fù)離心法得到的DNA提取液可用于轉(zhuǎn)基因成分的定性檢測(cè)。圖中8號(hào)樣品的轉(zhuǎn)基因目的條帶較模糊，是由于其DNA提取液的濃度偏低，這與圖1 e中8號(hào)樣品的擴(kuò)增電泳條帶較暗相一致。

3 討論

作物的種子和其他組織含有豐富的DNA，但食用油經(jīng)過多重加工后DNA含量極少，提取DNA的難度加大［15-18］。5種方案提取精煉棉籽油DNA的結(jié)果說(shuō)明，棉籽油經(jīng)過理化處理、加熱等步驟后，精煉程度越深，油中的DNA含量越少，提取難度越大。此外，存放時(shí)間越長(zhǎng)，DNA降解可能越嚴(yán)重。

PCR擴(kuò)增進(jìn)行效果評(píng)估時(shí)，目標(biāo)片段的選擇會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果［6］。植物油加工過程中會(huì)不同程度的斷裂基因組DNA，本研究選用多拷貝小片段基因?yàn)橐?，?80 bp的tRNALeu內(nèi)源基因和210 bp的FMV35S外源基因，有效降低了擴(kuò)增的假陰性率。引物的特異性強(qiáng)，可用于常規(guī)的核酸檢測(cè)。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)采用5種DNA提取方案，通過比較內(nèi)源基因tRNALeu的擴(kuò)增結(jié)果，確定上清重復(fù)離心法在本試驗(yàn)中的DNA提取效率最高。其獲取的DNA提取液能進(jìn)一步擴(kuò)增外源基因FMV35S，用于棉籽油轉(zhuǎn)基因成分的定性檢驗(yàn)。該方法的優(yōu)點(diǎn)總結(jié)如下：

4.1 先將油DNA溶于TE緩沖液，再用CTAB提取DNA的效率高；加大DNA與TE緩沖液的溶解程度有利于提高DNA的提取效率。

4.2 DNA大量富集是成功提取精煉棉籽油DNA的關(guān)鍵。

4.3 三氯甲烷：異戊醇（24∶1）反復(fù)抽提1次，可較大程度提高DNA純度。

4.4 加入異丙醇后于-20℃沉淀過夜，使DNA沉淀徹底；將異丙醇沉淀后的上清液重復(fù)離心，收集沉淀，能有效減少人為操作引起的DNA損失，這對(duì)于提高DNA的提取效率至關(guān)重要。

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A Comparative Study of Different Methods of DNA Extraction of Cottonseed Oil

Fu Xiaohua1Zhang Yan2Zhang Wei2Wang Hong1，2Wu Tao2Zhou Wei2，3
（College of Life Sciences，Hebei Normal University1，Shijiazhuang 050024）
（Hebei Institute of Food Quality Supervision Inspection and Research2，Shijiazhuang 050071）
（College of Food Science and Technology，Agricultural University of Hebei3，Baoding 071000）

The research has designed five different schemes to extract DNA of 15 cottonseed oil samples with different machining accuracy from different manufacturers，which based on the SDSmethod as well as national standard method for DNA extraction of edible oil.The research estimated the DNA extraction efficiency by comparing PCR amplification results of the endogenous gene tRNALeu of DNA extract from different sources.Amplified the exogenous gene FMV35S from the obtained DNA of the fifth scheme to detect genetically modified ingredients.The results showed that the fifth method made the higher DNA-extracting efficiency than the other methods；the DNA extracted by the fifth method can also be adopted for the qualitative detection of genetically modified ingredients in cottonseed oil.

cottonseed oil，DNA extraction，enrichment treatment，genetically modified organisms（GMO）

TS221

A

1003-0174（2014）03-0042-05

河北省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局科研項(xiàng)目（2011ZD06）

2013-04-25

付曉華，女，1984年出生，碩士，應(yīng)用微生物

周巍，男，1983年出生，工程師，農(nóng)產(chǎn)品加工與儲(chǔ)藏工程