王美珊, 孔彭成, 朱 燕, 朱 蓮, 陳學(xué)進(jìn), 李和平, 蔣滿喜

(1. 東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物資源學(xué)院，哈爾濱 150040; 2. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部,上海 200025; 3. 上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所, 上海 200032)

一種改良的小鼠附睪尾常溫運(yùn)輸方法

王美珊1,2, 孔彭成2, 朱 燕3, 朱 蓮2, 陳學(xué)進(jìn)2, 李和平1, 蔣滿喜2

(1. 東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物資源學(xué)院，哈爾濱 150040; 2. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部,上海 200025; 3. 上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所, 上海 200032)

目的 探索常溫條件下附睪尾運(yùn)輸?shù)淖罴褩l件，并消除培養(yǎng)液對(duì)常溫運(yùn)輸可能存在的影響。方法 對(duì)附睪尾的運(yùn)輸方法進(jìn)行了改良，同時(shí)比較了常溫或4～8℃條件下，在20 μl或0 μl培養(yǎng)液M2中，運(yùn)輸后精子的活力、受精能力及其胚胎發(fā)育能力。結(jié)果 結(jié)果表明，常溫運(yùn)輸不加培養(yǎng)液的條件下，運(yùn)輸?shù)母讲G尾精子活動(dòng)率和活力，均優(yōu)于20 μl培養(yǎng)液中運(yùn)輸?shù)母讲G尾，但是稍差于4～8℃條件下20 μl M2 培養(yǎng)液中運(yùn)輸?shù)母讲G尾。結(jié)論 無(wú)液體運(yùn)輸?shù)姆绞礁舆m合于附睪尾的常溫運(yùn)輸，同時(shí)該方法還可消除培養(yǎng)液對(duì)附睪精子可能存在的不良影響; 常溫附睪尾的運(yùn)輸對(duì)于小鼠資源庫(kù)或者研究機(jī)構(gòu)間珍貴小鼠品系的運(yùn)輸具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

附睪尾; 運(yùn)輸; 精子活動(dòng)率; 精子活力; 胚胎發(fā)育

過(guò)去的幾十年里，大量轉(zhuǎn)基因小鼠模型在生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域不斷涌現(xiàn)，并以指數(shù)級(jí)別的速度迅速增長(zhǎng)，應(yīng)運(yùn)而生的小鼠資源庫(kù)的建立促進(jìn)了不同實(shí)驗(yàn)室或研究機(jī)構(gòu)之間轉(zhuǎn)基因小鼠品系的交換。盡管活體動(dòng)物、冷凍胚胎或者精子都可以用來(lái)運(yùn)輸轉(zhuǎn)基因小鼠品系，但是活體運(yùn)輸非常昂貴并且存在攜帶病原體的風(fēng)險(xiǎn)，而運(yùn)輸冷凍保存樣品需要液氮罐之類的容器。新鮮精子運(yùn)輸可能是一個(gè)非常理想的選擇，而且不需要特定的容器比如深冷液氮絕熱運(yùn)輸罐(Dry shipper)等。但是很多研究表明，精子在常溫或者低溫條件下只能保存較短的時(shí)間[1～3]。最近有人發(fā)明了一種簡(jiǎn)單且成本較低的運(yùn)輸方法—附睪低溫運(yùn)輸[2～7]，其優(yōu)點(diǎn)在于可以避免在運(yùn)輸活體動(dòng)物、冷凍胚胎和精子過(guò)程中出現(xiàn)的相關(guān)問(wèn)題。

本試驗(yàn)采用常溫(20～25℃)或4～8℃運(yùn)輸?shù)姆绞? 附睪尾在 20 μl或 0 μl體積的培養(yǎng)液中運(yùn)輸 24 h后, 對(duì)附睪尾精子的活動(dòng)率、活力及其受精能力進(jìn)行了比較，最后還對(duì)IVF胚胎的體外和體內(nèi)發(fā)育潛能進(jìn)行了評(píng)估。以期消除常溫運(yùn)輸條件下運(yùn)輸液對(duì)精子可能存在的不良影響，并對(duì)小鼠附睪尾的運(yùn)輸方式進(jìn)行改良和優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

ICR小鼠(雄鼠大于10周齡; 雌鼠為3～4周齡)用作胚胎移植假孕受體的準(zhǔn)備; 3～4周齡C57BL/6N雌鼠用于超數(shù)排卵處理、卵子的收集, 均為SPF級(jí),購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司[SCXK(滬)2012-0002], 飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部[SYXK (滬)2008-0050]。所有動(dòng)物的使用均符合上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部動(dòng)物使用準(zhǔn)則和動(dòng)物福利的規(guī)定。10周齡以上的SPF級(jí)BDF1雄鼠來(lái)自東北林業(yè)大學(xué), 進(jìn)行附睪尾精子的原位運(yùn)輸。

1.2 主要試劑

孕馬血清促性腺激素(PMSG)和人絨毛膜促性腺激素(hCG)購(gòu)自寧波第二激素制藥廠，其他試劑若無(wú)說(shuō)明，均購(gòu)自Sigma-Aldrich公司。

1.3 附睪尾在常溫及低溫(4～8℃)條件下的收集與運(yùn)輸

取成年BDF1雄鼠，斷頸椎處死，無(wú)菌條件下剪開(kāi)皮膚并在陰囊上切口，依次取出兩側(cè)附睪尾, 分別置于兩個(gè)0.2 ml的離心管中, 并加入0 μl或20 μl的M2培養(yǎng)液, 扣合封口。然后將其放置于保溫杯內(nèi)經(jīng)過(guò)4 ℃或常溫(20 ℃)預(yù)溫的凝膠冰袋上, 用膠帶固定, 然后在保溫杯內(nèi)放置專門(mén)的RC-4溫度記錄儀(江蘇精創(chuàng)電氣股份有限公司)以確保溫度的可靠性, 最后將保溫杯放入經(jīng)過(guò)同樣預(yù)溫的泡沫盒中[5],低溫運(yùn)輸?shù)臏囟确秶３衷?～8 ℃, 常溫運(yùn)輸?shù)臏囟确秶３衷?0～25 ℃。然后將裝有附睪尾樣品的泡沫盒通過(guò)快遞或者專門(mén)人員攜帶的方式運(yùn)輸。

1.4 附睪精子的分離和獲能

24 h內(nèi)，附睪尾樣品送至上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部, 并立刻移至400 μl經(jīng)過(guò)37 ℃預(yù)溫的HTF體外受精液(密理博公司)中取出精子, 并在37 ℃、5% CO2條件下分別獲能30 min、90 min、120 min。

1.5 精子活力的評(píng)估

將獲能處理30、90、120 min的樣品按照1∶8的比例分別加入20 μl的HTF培養(yǎng)液中測(cè)定精子活力。在200倍顯微鏡下按照J(rèn)equier和Crich的方法[8]進(jìn)行精子活力的測(cè)定，并對(duì)活動(dòng)精子數(shù)和精子活率進(jìn)行評(píng)估。精子活力指數(shù)可分為0～4五個(gè)評(píng)定等級(jí): 0代表不運(yùn)動(dòng)，1代表弱或緩慢運(yùn)動(dòng), 2代表運(yùn)動(dòng)，3代表運(yùn)動(dòng)良好，4代表運(yùn)動(dòng)活躍。并統(tǒng)計(jì)運(yùn)動(dòng)活躍的2～4級(jí)精子在整個(gè)樣本中的百分率。

1.6 精子受精能力的評(píng)估

C57BL/6N雌鼠(4～6周齡)分別注射7.5 U PMSG和hCG(間隔48～50 h), hCG注射后13～15 h收集MII期卵子, 并將取出的卵子在HTF培養(yǎng)液中清洗3次后轉(zhuǎn)移到500 μl的HTF授精滴中。IVF參照Byer等方法[9], 獲能90 min后的精子加入含有卵子的HTF授精滴中(精子終濃度為2×105個(gè)/ml), 然后在37℃、5% CO2條件下共孵育5～6 h。最后選出受精卵并在HTF中進(jìn)行清洗若干次, 繼續(xù)培養(yǎng)。

受精后24 h, 統(tǒng)計(jì)2-細(xì)胞胚胎的數(shù)量。然后將胚胎在KSOM-AA(密理博公司)液滴中清洗干凈，每10～15枚胚胎一組放入覆蓋有無(wú)菌石蠟油的20 μl KSOM-AA液滴中繼續(xù)培養(yǎng)。受精72 h后, 統(tǒng)計(jì)發(fā)育到囊胚期的胚胎數(shù)。以全部受精卵數(shù)為基數(shù)，計(jì)算2-細(xì)胞胚胎和囊胚的發(fā)育率。

1.7 胚胎移植

提前準(zhǔn)備ICR假孕小鼠, 將囊胚移植到假孕2.5 d小鼠中。妊娠18.5 d后，通過(guò)剖宮產(chǎn)或者自然分娩的方式獲得仔鼠。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)組均重復(fù)3～4次。采用χ2檢驗(yàn)分析IVF受精率、2-細(xì)胞胚胎率和囊胚率。采用t檢驗(yàn)分析獲能后精子活動(dòng)率和精子活力。P＜0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)液和溫度對(duì)小鼠精子活動(dòng)率和精子活力的影響

結(jié)果顯示(圖 1), 附睪尾常溫?zé)o培養(yǎng)液運(yùn)輸?shù)木? 在30 min、90 min、120 min的獲能后, 其活動(dòng)率分別為76.1%±2.2%、73.4%±1.5%、70.8%±2.3%, 與4～8 ℃加20 μl培養(yǎng)液運(yùn)輸?shù)木踊顒?dòng)率之間無(wú)顯著差異(75.0%±1.4%、73.3%±3.1%和71.4%±2.0%; P＞0.05)，優(yōu)于常溫加20 μl培養(yǎng)液組(55.2%±2.0%、51.8%±2.4%和49.3%±3.4%; P＜0.05)。

附睪尾精子孵育30 min、90 min、120 min后, 常溫?zé)o培養(yǎng)液組的精子活力分別為2.0±0.3、2.1 ± 0.2、1.8 ± 0.1，比 4～8 ℃加 20 μl培養(yǎng)液組略低(2.9±0.2、3.2±0.1和3.1±0.2; P＜0.05)，但是明顯優(yōu)于常溫加20 μl培養(yǎng)液組(1.5±0.0、1.6±0.2和1.3±0.1; P＜0.05)。

2.2 常溫及4～8℃條件下運(yùn)輸小鼠附睪尾精子的IVF率及其胚胎體外發(fā)育

結(jié)果顯示，常溫或4～8℃運(yùn)輸附睪尾, 并檢測(cè)附睪精子的IVF能力(表1)。BDF1小鼠的附睪精子于37℃獲能90 min, 然后用于IVF。4～8 ℃、20 μl培養(yǎng)液運(yùn)輸?shù)母讲G尾精子的受精率為62.5%，而常溫20 μl培養(yǎng)液和常溫?zé)o液常溫組精子的受精率分別為1.9%和20.2%，差異顯著(P＜0.05)。4～8℃、20 μl培養(yǎng)液和無(wú)液體常溫運(yùn)輸組中，其2-細(xì)胞胚胎和囊胚的發(fā)育率均較高(50.3%、51.7%; P＞0.05),而且胚胎移植后分別獲得12和9只仔鼠，表明常溫?zé)o培養(yǎng)液的條件下進(jìn)行附睪尾運(yùn)輸是可行的。

圖 1 BDF1小鼠常溫及4～8 ℃運(yùn)輸附睪尾在不同培養(yǎng)液體積情況下的精子活動(dòng)率和精子活力

表 1 4～8℃或常溫運(yùn)輸?shù)母讲G精子IVF后胚胎的發(fā)育情況

3 討論

已有研究表明，常溫或低溫條件會(huì)對(duì)小鼠精子短期儲(chǔ)存產(chǎn)生一定的影響[2,10～11]。小鼠精子在24℃的TYH培養(yǎng)液中儲(chǔ)存24 h仍可維持較強(qiáng)的受精能力。但是常溫條件下超過(guò)24 h后，精子很難維持正常的受精能力[10]。另一項(xiàng)研究專門(mén)比較了M2、PB1、M16、CZB和TYH對(duì)小鼠精子的影響，認(rèn)為M2是常溫精子儲(chǔ)存的最佳液體[2]。

最近, Takeo等[11]比較了石蠟油、M2、CPS-1和Lifor對(duì)4～8℃冷藏精子受精能力的影響。他們發(fā)現(xiàn)在冷藏儲(chǔ)存72 h后, 在維持附睪精子受精能力方面，Lifor比M2以及石蠟油的效果好。這項(xiàng)研究表明，作為一種人造器官的保存液，Lifor含有糖類、氨基酸、無(wú)機(jī)鹽、緩沖劑、膠體以及氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的載體脂質(zhì)(納米粒子)[12～13]，并證明Lifor對(duì)于短期冷藏儲(chǔ)存小鼠精子是非常有益的。

本研究中，BDF1小鼠附睪尾來(lái)自于距離本實(shí)驗(yàn)室2 000 km以外的單位。在常溫和4～8 ℃運(yùn)輸過(guò)程中，使用了20 μl和0 μl兩種體積的培養(yǎng)液。最終發(fā)現(xiàn)，常溫運(yùn)輸與4～8℃運(yùn)輸相比，在不使用培養(yǎng)液(0 μl)的情況下，精子存活率在運(yùn)輸24 h之內(nèi)受到的影響不大。但由于精子活力受到了某種程度的影響, 其受精率低于4～8℃、20 μl培養(yǎng)液運(yùn)輸?shù)木?20.2% vs 62.5%)。但是常溫、20 μl培養(yǎng)液中運(yùn)輸?shù)木?，其受精率受到極大的影響，僅為1.9%。因此，常溫?zé)o培養(yǎng)液運(yùn)輸?shù)男∈缶舆M(jìn)行IVF后能夠獲得可以接受的受精率。而且與4 ℃運(yùn)輸一樣，移植后均可成功獲得健康的后代。證明各研究機(jī)構(gòu)之間通過(guò)常溫運(yùn)輸方式進(jìn)行小鼠品系交換的安全性和可行性。而且經(jīng)過(guò)改良的無(wú)培養(yǎng)液的方法更有益于24 h內(nèi)附睪尾的常溫運(yùn)輸，并消除培養(yǎng)液可能存在的影響。

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A Modified Delivery of Mouse Cauda Epididymides at Room Temperature

WANG Mei-shan1,2, KONG Peng-cheng2, ZHU Yan3, ZHU Lian2, JIANG Man-xi2, CHEN Xue-jin2, LI He-ping1

(1. College of Wildlife Resource, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China;2. Department of Laboratory Animal Sciences, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200025, China; 3. Shanghai Institute of Planned Parenthood Research, Shanghai 200032, China)

ObjectiveTo explore the optimal conditions for Cauda epididymis transport under room temperature and eliminate the effect of medium on the transport of cauda epididymides at room temperature.MethodsThe transportMethodsof cauda epididymides were modified in this study and the sperm motilities, fertility and developmental abilities of IVF embryos after transportation at room temperatures or 4～8℃ in 20 μl of medium M2 or medium-free tube were compared.ResultsUnder room temperatures,delivery of cauda epididymides without medium was significantly superior to with medium, but was inferior to 20 μl M2 medium under 4～8℃.ConclusionThe modified medium-free system was beneficial to room temperature transportation of cauda epididymides and maybe eliminate the side effects of medium on spermatozoa, and the delivery of cauda epididymides under room temperature was useful for transporting some valuable strains between mouse banks and research facilities.

Cauda epididymis; Transport; Sperm viability; Motility; Embryo development

Q95-33

A

1674-5817(2014)02-0145-04

10.3969/j.issn.1674-5817.2014.02.013

2013-09-04

國(guó)家自然基金(編號(hào):81170756/H0713)

王美珊(1987-), 女, 碩士研究生, 從事轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與發(fā)育生物學(xué)研究。

E-mail: meishan200703@126.com

蔣滿喜, 博士, 助理研究員, 長(zhǎng)期從事動(dòng)物受精、發(fā)育生物學(xué)與轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究,E-mail: manxijiang@yahoo.com

李和平, 教授, 長(zhǎng)期從事動(dòng)物遺傳育種與繁殖學(xué)研究, E-mail: 461905800@qq.com