趙 勇, 張 璐, 蔡麗萍, 徐 晨

(1. 上海實驗動物研究中心, 上海 201203; 2. 第二軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心, 上海 200433)

小鼠側(cè)腦室埋管給藥方法的優(yōu)化

趙 勇1, 張 璐2, 蔡麗萍2, 徐 晨2

(1. 上海實驗動物研究中心, 上海 201203; 2. 第二軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心, 上海 200433)

目的 優(yōu)化小鼠側(cè)腦室埋管給藥方法。方法 通過兩種不同埋管方法比較其成功率，通過不同注射劑量組死亡率觀察探索給藥劑量范圍。結(jié)果 實時糾偏埋管法成功率可達100%，側(cè)腦室注射劑量為5～10 μl時死亡率較低。 結(jié)論 實時糾偏埋管法成功率高于傳統(tǒng)埋管法，側(cè)腦室注射劑量建議范圍為0～10 μl。

C57BL/6J小鼠; 側(cè)腦室; 實時糾偏埋管法; 劑量范圍

采用腦立體定向儀對實驗動物進行側(cè)腦室給藥是一種直接有效的實驗方法, 目前已廣泛應(yīng)用于神經(jīng)生物學(xué)等的研究[1～3]。直接進行側(cè)腦室給藥優(yōu)點顯著。首先, 能夠直接對研究區(qū)域進行準(zhǔn)確的部位限制性給藥, 方便確切掌握給藥劑量和濃度; 其次能得出更接近正常生理狀態(tài)下的實驗結(jié)果。

側(cè)腦室給藥通常有兩種實驗設(shè)計, 一種是僅需單次給藥的實驗, 可以直接進行側(cè)腦室注射; 另一種是需要連續(xù)給藥的實驗，通常進行側(cè)腦室埋管給藥的方法。采用側(cè)腦室埋管給藥方法的實驗，能夠得到的可靠數(shù)據(jù)量與埋管成功率密切相關(guān)。小鼠的側(cè)腦室較大鼠小, 埋管成功率亦較低，很容易造成因埋管不成功而影響實驗數(shù)據(jù)的科學(xué)性，實驗效率較低。這種無法實時調(diào)整、無導(dǎo)向、“盲目”的傳統(tǒng)埋管，往往需要靠成倍增加實驗動物數(shù)量來保證取得足夠的實驗數(shù)據(jù)量，預(yù)防性的增加實驗動物量對實驗資源和實驗人員均造成無謂的浪費。作者在長期側(cè)腦室埋管實驗中摸索出一種“實時糾偏埋管法”，即可以在埋管操作過程中對所埋套管是否進入側(cè)腦室進行判斷并實時調(diào)整，直至進入側(cè)腦室為止，從而大幅提高側(cè)腦室埋管成功率。目前，關(guān)于側(cè)腦室給藥的劑量亦有爭議，本實驗通過不同注射劑量導(dǎo)致小鼠死亡率的比較，擬對小鼠側(cè)腦室注射時采用的藥物劑量范圍提供實驗參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

SPF級雄性C57BL/6J小鼠60只，7～8周齡，體質(zhì)量22～26 g, 由上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供[SCXK(滬)2008-0016], 飼養(yǎng)于第二軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心屏障設(shè)施[SYXK(滬)2007-0003], 飼養(yǎng)1周使其適應(yīng)環(huán)境后進行實驗。實驗分兩部分進行:第一部分, 分為傳統(tǒng)埋管組和實時糾偏埋管組2組，每組10只，進行兩種埋管法成功率比較; 第二部分，使用實時糾偏埋管法埋管，然后分為5、10、20、30 μl 四個注射劑量組，每組10只小鼠。

1.2 實驗器材

實驗中使用ALC-H電動數(shù)顯動物腦立體定向儀、ALC-IP600型微量注射泵、ALC-CED8型動物顱骨鉆(以上均由上海奧爾科特生物科技有限公司生產(chǎn))，埋置套管使用2.5 ml無菌注射器針頭自制，內(nèi)芯使用相配不銹鋼絲自制，與套管適配的PE管、內(nèi)注射針及直徑1 mm、長度2 mm的固定用螺絲(購自深圳市瑞沃德生命科技有限公司)。自凝牙托水和牙托粉均為市購。實驗用螺絲、套管等與小鼠體內(nèi)接觸器材采用新潔爾滅浸泡消毒。

1.3 手術(shù)方法

方法如下: (1)采用戊巴比妥鈉(濃度7.5 mg/ml)0.1 ml/10 g腹腔注射麻醉小鼠; (2)小鼠頭頂部剃毛，固定于腦立體定向儀，調(diào)節(jié)門齒桿, 使其頂部呈水平狀; (3)頭頂皮膚消毒后沿中線切開, 剝離筋膜, 以無菌棉簽蘸少量雙氧水涂擦顱骨表面, 暴露Bregma(前囟)點; (4)根據(jù)Paxinos等[4]所著《小鼠腦立體定位圖譜》選擇側(cè)腦室定位坐標(biāo)為前囟后0.6 mm, 旁開1.5 mm(本實驗均為左側(cè)旁開), 深1.7 mm(進針深度以硬腦膜為起始點)(圖1); (5)操作腦立體定向儀使其定位在Bregma點，按所選取坐標(biāo)在顱骨頂標(biāo)記鉆孔位置, 使用0.8 mm直徑鉆頭鉆孔, 鉆孔以打通頂部顱骨且不傷及硬腦膜和腦實質(zhì)為標(biāo)準(zhǔn); (6)在矢狀縫與人字縫交點右側(cè)約1.5～2 mm處鉆一淺孔(未鉆通顱骨)，留待固定螺絲; (7)傳統(tǒng)埋管法, 按照所選坐標(biāo)埋置套管至硬腦膜下1.7 mm處。實時糾偏埋管法, 將欲埋置的套管連接一段長15～20 cm PE管(圖2)其內(nèi)充滿人工腦脊液或生理鹽水, 同樣埋置套管至硬腦膜下1.7 mm, 然后使PE管豎直，看其中液面是否有下降，下降即為進入側(cè)腦室，若液面不下降則說明未進入側(cè)腦室，則可小范圍調(diào)整埋管深度，直至液面下降為止; (8)將螺絲固定于預(yù)留淺孔內(nèi)，使其與顱骨連接穩(wěn)固; (9)用牙托水和牙托粉將套管、螺絲、顱骨緊密粘合，凝固后松開固定套管的裝置, 輕柔取下PE管, 并插入套管內(nèi)芯;(10)顱頂撒入青霉素干粉，縫合皮膚切口; (11)小鼠單籠飼養(yǎng)恢復(fù)1周。

1.4 判斷套管進入側(cè)腦室方法

實驗第一部分在套管埋置之后可以立刻用連接微量注射泵的內(nèi)注射針以2 μl/min的速度注射5 μl的0.1%溴酚藍染料, 靜置10 min, 抽出注射針，對小鼠施行安死術(shù)后取腦，沿進針的冠狀面切開，若腦室內(nèi)充滿藍色染料，則說明側(cè)腦室埋管成功，否則為不成功。

1.5 側(cè)腦室注射劑量設(shè)置

埋置套管的小鼠恢復(fù)1周后進行第二部分實驗即注射劑量研究。使用連接微量注射泵的內(nèi)注射針以2 μl/min的速度向側(cè)腦室注射人工腦脊液，注射量分別為5、10、20、30 μl，連續(xù)注射5 d后記錄小鼠存活率。

圖 1 套管埋置所在冠狀面

2 結(jié)果

2.1 兩種側(cè)腦室埋管法成功率比較

實驗第一部分中，將體積分?jǐn)?shù)0.1%溴酚藍注入小鼠腦內(nèi)，若埋管位置正確，位于側(cè)腦室，則染料會經(jīng)由腦脊液循環(huán)到對側(cè)側(cè)腦室，甚至?xí)h(huán)至第三腦室。根據(jù)染料所染位置可以判斷是否埋管正確(圖3)。實驗結(jié)果顯示，實時糾偏埋管組10只小鼠全部埋管正確(成功率100%)，而傳統(tǒng)埋管組僅6只埋管正確(成功率60%)，證明實時糾偏埋管法優(yōu)于傳統(tǒng)埋管法。

2.2 注射劑量對小鼠存活率的影響

在連續(xù) 5 d進行側(cè)腦室注射后, 5 μl和 10 μl劑量組小鼠死亡率均為10%(1/10), 20 μl劑量組死亡率為60%(6/10), 30 μl劑量組死亡率為100%(10/10)。

3 討論

圖 3 0.1%溴酚藍染料未進入小鼠側(cè)腦室(左)與進入側(cè)腦室(右)

腦立體定向技術(shù)是使用腦立體定向儀，根據(jù)顱骨表面標(biāo)志(如前囟、人字點、矢狀縫等)來確定腦內(nèi)神經(jīng)結(jié)構(gòu)位置，對其進行定向刺激、毀損、注射藥物、引導(dǎo)電位等的實驗技術(shù)，廣泛應(yīng)用于神經(jīng)解剖[5]、生理[6]、藥理[2,7]和外科等領(lǐng)域。

很多基礎(chǔ)與臨床實驗研究均采用側(cè)腦室注射技術(shù)，通過側(cè)腦室埋管連續(xù)進行側(cè)腦室注射給藥的研究方法亦非常普遍。C57BL/6J小鼠被認(rèn)為是“標(biāo)準(zhǔn)”的近交系，其實驗結(jié)果精度高，可比性好，應(yīng)激反應(yīng)均一，在側(cè)腦室埋管技術(shù)中亦是種常用的實驗動物，廣泛應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)的研究中[8～9]。小鼠的側(cè)腦室體積較小，采用傳統(tǒng)側(cè)腦室埋管方法成功率較低，通常有一部分小鼠在實驗結(jié)束后，經(jīng)針痕驗證發(fā)現(xiàn)并未進入側(cè)腦室，導(dǎo)致實驗數(shù)據(jù)不可用，浪費了大量的時間、精力和經(jīng)費。

有研究發(fā)現(xiàn), 在大鼠側(cè)腦室埋管時, 可以通過緩慢抽出內(nèi)芯, 2～3 s后看是否有腦脊液流出的方法來判斷埋管位置正確與否[10]。經(jīng)實踐此法并不適用于小鼠, 即無法明確觀察到小鼠的腦脊液流出。但是可以觀察到連接套管的PE管內(nèi)液面是否下降, 因而此實時糾偏埋管法更加直觀。雖然此方法簡單、直觀, 但在實際操作過程中還需注意以下問題: ①有時雖然套管埋置位置正確，但是液面并不下降，可能是由于套管前段堵塞所致，可以在PE管開放端連接微量進樣器，緩慢輕柔的進行少量推注，則可疏通套管, 從而判斷埋管位置是否正確以及是否需要調(diào)節(jié)套管位置。②在推注微量進樣器使液面下降過程中, 可同時觀察套管插入處的腦膜表面是否有液體溢出, 若有則可能是并未進入側(cè)腦室。觀察液體溢出也是一個輔助判斷的觀察指標(biāo)。

在側(cè)腦室注射劑量實驗中, 根據(jù)文獻大多數(shù)采用的劑量為 2～5 μl[11～12]，但在實際實驗中因?qū)嶒炘O(shè)計要求常需要更高注射劑量，小鼠的腦室容積約為30 μl, 因此本實驗中劑量組分別設(shè)置為5、10、20、30 μl 4 組。5 μl和10 μl劑量組死亡率較低,說明在側(cè)腦室注射實驗中劑量可以低于10 μl。20 μl劑量組小鼠在第4日其狀態(tài)普遍較差, 第5日死亡量劇增(4只), 提示在必需進行側(cè)腦室大劑量給藥時應(yīng)盡量縮短給藥天數(shù), 最好不要超過3 d; 實踐中也發(fā)現(xiàn)給藥速度較快則注射后小鼠狀態(tài)較差, 因而在必需大劑量給藥時建議減慢注射速度(如減至0.5 μl/min,0.25 μl/min)。30 μl劑量組死亡率100%，實驗中盡量避免選用。

本實驗是對技術(shù)方法的優(yōu)化，采用的實時糾偏埋管法成功率高于傳統(tǒng)埋管法。在對小鼠側(cè)腦室注射時建議劑量范圍為0～10 μl。而實驗中選取的側(cè)腦室注射液為人工腦脊液，其在滲透壓、離子濃度等各方面均接近生理值，即不易引起機體的各種不良反應(yīng)。實際實驗過程中往往會注射滲透壓、離子濃度、甚至粘稠度各異的物質(zhì)，需根據(jù)實際情況對注射量和注射速度進行調(diào)整。

[1] Ierusalimsky VN, Kuleshova EP, Balaban PM. Expression of the type 1 metalloproteinase in the rat hippocampus after the intracerebroventricular injection of β-amyloid peptide (25-35)[J]. Acta Neurobiol Exp (Wars), 2013, 73(4):571-578.

[2] Pahlavan Y, Sepehri G, Sheibani V, et al. Study the antinociceptive effect of intracerebroventricular injection of aqueous extract of origanum vulgare leaves in rat: possible involvement of opioid system[J]. Iran J Basic Med Sci, 2013,16(10):1109-1113.

[3] Kabuto H, Yamanushi TT, Janjua N, et al. Effects of squalene/squalane on dopamine levels, antioxidant enzyme activity,and fatty acid composition in the striatum of Parkinson’s disease mouse model[J]. J Oleo Sci, 2013, 62(1):21-28.

[4] Paxinos G, Franklin KBJ. The Mouse Brain: in Stereotaxic Coordinates (second edition)[M]. San Diego: Academic Press,2001.

[5] Christoph T, Schr?der W, Tallarida RJ, et al. Spinalsupraspinal and intrinsic μ-opioid receptor agonist-norepinephrine reuptake inhibitor (MOR-NRI) synergy of tapentadol in diabetic heat hyperalgesia in mice[J]. J Pharmacol Exp Ther, 2013, 347(3):794-801.

[6] Chikahisa S, Kodama T, Soya A, et al. Histamine from brain resident MAST cells promotes wakefulness and modulates behavioral states[J]. PLoS One, 2013,8(10):e78434.

[7] Zhi WH, Zeng YY, Lu ZH, et al. Simvastatin exerts antiamnesic effect in aβ5-35 -injected mice[J]. CNS Neurosci Ther, 2014,20(3):218-226.

[8] Gholizadeh S, Tharmalingam S, Macaldaz ME, et al. Transduction of the central nervous system after intracerebroventricular injection of adeno-associated viral vectors in neonatal and juvenile mice[J]. Hum Gene Ther Methods,2013, 24(4):205-213.

[9] Lu J, Wu DM, Zheng YL, et al. Ursolic acid improves high fat diet-induced cognitive impairments by blocking endoplasmic reticulum stress and IκB kinase β/nuclear factor-κB-mediated inflammatory pathways in mice[J]. Brain Behav Immun, 2011, 25(8):1658-1667.

[10] 于海明, 王百忍, 李改麗, 等. 大鼠側(cè)腦室置管方法改良[J].神經(jīng)解剖學(xué)雜志, 2005, 21(2):207-211.

Q95-33

B

1674-5817(2014)02-0153-03

10.3969/j.issn.1674-5817.2014.02.015

2014-03-04

上海市科委基金資助項目(12140900700)

趙 勇(1974-), 男, 講師,E-mail: zhaoyongslarc@163.com