范玉蘭, 王 寧, 施志沖, 鄭衛(wèi)東, 盧 偉, 肖 萍

(上海市疾病預(yù)防控制中心毒性評價科, 上海 200336)

氟濃度對體外培養(yǎng)大鼠軟骨細胞糖胺多糖和II型膠原分泌的影響

范玉蘭, 王 寧, 施志沖, 鄭衛(wèi)東, 盧 偉, 肖 萍

(上海市疾病預(yù)防控制中心毒性評價科, 上海 200336)

目的 探討氟濃度對體外培養(yǎng)軟骨細胞糖胺多糖(GAG)和II型膠原分泌的影響。方法 取2月齡雌性SD大鼠下肢髖關(guān)節(jié)及膝關(guān)節(jié)軟骨，分離、培養(yǎng)出軟骨細胞后，接種于細胞培養(yǎng)瓶，經(jīng)鑒定后, 分為空白對照組和 NaF 受試組(6.25 μmol/ml、12.50 μmol/ml、25.00 μmol/ml、50.00 μmol/ml和100.00 μmol/ml)，孵育6 d后，分別進行GAG含量測定、阿利新藍染色和II型膠原免疫組化染色。結(jié)果 NaF受試6 d后，大鼠軟骨細胞培養(yǎng)液GAG含量各組無顯著性差異(P＞0.05); 阿利新藍染色顯示, 大鼠軟骨細胞內(nèi)的糖原異染顆粒亦無明顯差異; II型膠原免疫組化染色則顯示，不同劑量NaF可引起對軟骨細胞外II型膠原染色積分隨劑量的升高逐漸上升(P＜0.05)。結(jié)論 NaF對大鼠軟骨細胞GAG分泌可能無影響，但可能影響Ⅱ型膠原的分泌。

氟化鈉; 軟骨細胞; 糖胺多糖; II型膠原

氟骨癥是一種由于長期攝入氟濃度引起的慢性地方性骨關(guān)節(jié)病，主要侵害四肢關(guān)節(jié)的骨、軟骨和骨周組織，導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能障礙，嚴重者可致脊柱和四肢關(guān)節(jié)畸形。有研究表明，過量氟可引起兒童和實驗動物的軟骨內(nèi)成骨障礙; 還可使實驗大鼠的骺板軟骨表現(xiàn)肥大、軟骨細胞增多、成熟障礙，關(guān)節(jié)軟骨病理切片可見單個、散在的軟骨細胞變性、萎縮、壞死，軟骨基質(zhì)和細胞內(nèi)鈣鹽沉積及軟骨內(nèi)骨化[1～2]; 過量氟可促進軟骨膠原蛋白的生物合成[3]。氟濃度對實驗大鼠軟骨細胞基質(zhì)和膠原分泌的研究十分有限，目前尚無定論。本文擬研究氟濃度對體外培養(yǎng)軟骨細胞糖胺多糖(glycosaminoglycan, GAG)和II型膠原分泌的作用，旨在探明氟濃度對軟骨細胞的功能影響和氟骨癥的發(fā)病機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

2月齡雌性SPF級SD大鼠2只，由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供[SCXK(滬)2008-0016]。飼養(yǎng)于上海市疾病預(yù)防控制中心SPF級動物設(shè)施內(nèi)[SYXK(滬)2012-0008]。

1.2 主要試劑和儀器

氟化鈉(NaF), 含量＞99.9%(Sigma進口分裝), 貝科的改良伊格爾培養(yǎng)基: 營養(yǎng)合劑的F12(DMEM/F12)培養(yǎng)液(Sigma 公司), 胎牛血清(FBS, Gibco), 透明質(zhì)酸酶、胰蛋白酶、II型膠原酶(Sigma公司), 鼠抗人II型膠原多克隆抗體及PowerVisionTM免疫組化試劑盒(北京中杉金橋公司)。儀器: 倒置顯微鏡(日本Olympus公司); 生物顯微鏡(日本Nikon公司); 透射電鏡(德國Philips公司)。

1.3 軟骨細胞的分離和鑒定[4～5]

頸椎脫臼法處死大鼠,嚴格消毒后，剪開膝關(guān)節(jié)，用11號刀片削取關(guān)節(jié)表面軟骨，放入盛有滅菌PBS的培養(yǎng)皿中，清除表面血污。用PBS沖洗數(shù)次后，剪切軟骨至1 mm3大小的碎塊, 移入無菌培養(yǎng)皿內(nèi)。加入4 ml 透明質(zhì)酸酶，室溫孵育5 min后倒去液體。重復(fù)加入透明質(zhì)酸酶一次。用PBS沖洗2次，移入離心管中。10 ml的胰酶37 ℃搖床消化30 min, 靜置5 min, 棄上清液，用PBS沖洗2次。4 ml 該II型膠原酶37 ℃培養(yǎng)30 min, 去除上清液。再用4 ml 膠原酶液37 ℃恒溫振蕩180 min，收集上清液，1 000 r/min，離心5 min。最后用PBS沖洗，加入DMEM/F12培養(yǎng)液(含體積分數(shù)10%胎牛血清)，制成細胞懸液。隨機取培養(yǎng)細胞，經(jīng)胰蛋白酶消化后接種于蓋玻片上，貼壁生長后，PBS沖洗，甲醇固定15 min，用10 g/L甲苯胺藍進行基質(zhì)異染(pH 2.5)，PowerVisionTM兩步法進行II型膠原免疫組化染色，取培養(yǎng)好的軟骨細胞培養(yǎng)玻片，經(jīng)體積分數(shù)2.5%戊二醛固定, 0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH 7.4)沖洗，置體積分數(shù)1%鋨酸后固定，再用0.1mol/L磷酸緩沖液(pH 7.4)沖洗，然后用各級乙醇逐級脫水，包埋、定位、超薄切片，最后置Philips CM-120型透射電鏡下觀察并拍照，確定其為軟骨細胞。

1.4 NaF細胞受試液的配制和給藥

當(dāng)原代軟骨細胞培養(yǎng)至第2代時, 以5×105/皿接種于10 cm2培養(yǎng)皿, 經(jīng)過24 h細胞貼壁后, 傾去原有培養(yǎng)液, 各組分別加入含有不同實驗因子的DMEM/F12培養(yǎng)液(含體積分數(shù)10%胎牛血清)。實驗共分6組:對照組只加DMEM/F12培養(yǎng)液(含10%胎牛血清);實驗組分別另加 6.25 μmol/ml、12.50 μmol/ml、25.00 μmol/ml、50.00 μmol/ml 和 100.00 μmol/ml NaF。每組3個平行樣。培養(yǎng)至第6日, 收集細胞培養(yǎng)液用于分析GAG含量, 并對對照組、25.00 μmol/ml、50.00 μmol/ml 和 100.00 μmol/ml 3 個測試組培養(yǎng)細胞爬片固定后做阿利新藍染色和免疫組化染色，分別觀察并分析各受試組差異。

1.5 細胞培養(yǎng)液中GAG含量的測定[6]

用二甲基亞甲藍(DMB)比色法測定細胞培養(yǎng)液GAG含量: 取100 μl 細胞傳代消化液，加入1 ml 20 mmol/L 磷酸鈉緩沖液(pH6.8，含30 μg木瓜蛋白酶，1 mmol/L EDTA，2 mmol/L 二硫蘇糖醇)，于60 ℃消化60 min后，加入20 mmol/L 碘乙酸和50 mmol/LTris/HCl(pH=8.0)各1 ml待測。分別取100 μl不同含量(5～100 mg/L)透明質(zhì)酸標準溶液，加入2.5 ml DMB顯色劑，混勻，反應(yīng)15 s后，于525 nm波長處比色，測定吸光度，根據(jù)標準曲線求得消化液中硫酸GAG的含量(mg/L)。

1.6 阿利新藍染色和II型膠原免疫組化染色

取培養(yǎng)細胞，胰蛋白酶消化后接種于蓋玻片上, 貼壁生長后，PBS沖洗3次, 甲醇固定15 min，用5 g/L阿利新藍染色[5]; Power VisionTM兩步法進行II型膠原免疫組化染色[4], 染色結(jié)果的積分評分標準見表1。

1.7 統(tǒng)計方法

采用SPSS 13.0 for windows 軟件處理所有數(shù)據(jù), 計量資料用± s表示, 顯著性差異用t檢驗, 計數(shù)資料用秩和檢驗, P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠軟骨細胞的鑒定

2.1.1 甲苯胺蘭染色分析 軟骨細胞內(nèi)見藍色異染顆粒,細胞周圍有少量異染顆粒出現(xiàn)(圖1)。

2.1.2 II型膠原免疫組化染色分析 軟骨細胞胞漿被染成棕黃色，胞核不著色(圖2)。

2.1.3 透射電鏡分析 細胞核較大, 多為圓形, 形態(tài)不規(guī)則，核仁邊聚，常染色質(zhì)明顯。細胞質(zhì)胞漿豐富，核糖體、線粒體較多，有豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及分泌小泡，泡內(nèi)為合成的基質(zhì)成分，胞漿中還可見大量成團的糖原顆粒(圖3)。

2.2 NaF對大鼠軟骨細胞培養(yǎng)液中GAG含量影響

與對照相比，NaF各處理組GAG含量沒有顯著性差異(P＞0.05)(表 2)。

表 1 Ⅱ型膠原免疫組化染色積分表Table 1 Criteria of histochemical examination of Ⅱtype collagen

圖 1 P2代軟骨細胞甲苯胺蘭染色(×400)Figure 1 Toluidine blue staining of chondrocytes of P2(×400)

圖 2 P2代軟骨細胞免疫組化染色(×400)Figure 2 Type II collagen immuno-histochemistry dye of chondrocytes of P2 (×400)

圖 3 P2代軟骨細胞電鏡形態(tài)(Bar=1 μm)Figure 3 Photos of PEM of chondrocytes of P2(Bar=1 μm)

表 2 各受試組大鼠軟骨細胞培養(yǎng)液中GAG的含量Table 2 GAG content in cell culture medium of chondrocytes of rats

2.3 NaF對大鼠軟骨細胞內(nèi)糖原顆粒的影響

阿利新蘭染色顯示, 對照組細胞邊界清晰，胞質(zhì)內(nèi)有少量異染糖原顆粒(圖4A)。25.00 μmol/ml、50.00 μmol/ml和 100.00 μmol/ml NaF 受試組軟骨細胞數(shù)目變多，邊界模糊，胞質(zhì)內(nèi)的異染糖原顆粒數(shù)目與對照相比無明顯差異(圖4B, C, D)。

2.4 NaF對大鼠軟骨細胞II型膠原分泌的影響

免疫組化染色顯示, 對照組細胞邊界清晰, 細胞周圍有少量膠原分泌(-)(圖5A)。與對照組相比,25.00 μmol/ml和 50.00 μmol/ml NaF 受試組細胞邊界尚清, 數(shù)目增多, 細胞周圍彌漫著大量的II型膠原染色顆粒(++～+++)(圖 5B, C); 100.00 μmol/ml NaF受試組細胞數(shù)目減少，形態(tài)不規(guī)則細胞外的II型膠原染色顆粒也相應(yīng)開始減少(++++)(圖5D)。按表1的評分標準分別對每瓶細胞的細胞爬片染色結(jié)果進行評分。每組檢查結(jié)果的總積分即組中每瓶細胞的細胞爬片染色的檢查積分之和(表3)。

3 討論

圖 4 受試組給藥后阿利新藍染色的差異 (×200)Figure 4 Difference of alcian blue eye after treatment (×200)

圖 5 各受試組給藥后II型膠原染色的差異 (×200)）Figure 5 Difference of II Type Collagen Immunohistochemistry Dye After Treatment (×200)

表 3 NaF對大鼠軟骨細胞周圍II型膠原染色顆粒的影響(n=3)Table 3 Effect of secretion of II type collagen of chondrocytes of rat treated by NaF (n=3)

氟是一種人體必需的微量元素，但氟過量攝入后進入機體可成為原生質(zhì)毒物損害軟骨，影響骨骼生長發(fā)育。要建立體外實驗體系研究氟對軟骨細胞的作用，必須選擇適合的實驗動物作為細胞來源，運用科學(xué)的實驗方法進行組織細胞分離，獲得的軟骨細胞必須進行鑒定后方能用于氟化物的毒性研究。本實驗選擇取材的實驗動物，主要考慮該實驗動物(SD大鼠)在生物學(xué)實驗中比較常用，結(jié)果具有廣泛的代表性，能提供足量的關(guān)節(jié)軟骨細胞，同時也考慮動物遺傳背景的一致性和實驗結(jié)果的可重復(fù)性。另外，有研究表明雌性動物發(fā)生骨關(guān)節(jié)炎和骨關(guān)節(jié)退行性變的易感性較大[7]，所以本研究選用雌性SD大鼠分離的軟骨細胞。

分離方法綜合相關(guān)文獻, 應(yīng)用最多的是低質(zhì)量濃度的胰蛋白酶和II型膠原酶順序染色消化法。胰蛋白酶對軟骨細胞外周基質(zhì)有較強的消化能力, 可見大部分的蛋白多糖分解; II型膠原酶可將膠元降解成低分子多肽短鏈物，但胰酶和膠原酶的濃度和作用時間應(yīng)嚴格控制，避免造成軟骨細胞的損傷[8～9]。關(guān)節(jié)軟骨的表面為一層纖維膜組織，取材時應(yīng)仔細剝離，可保證分離的細胞單一。本實驗觀察到，甲苯胺藍染色時軟骨細胞內(nèi)見藍色異染顆粒，細胞周圍有少量異染顆粒出現(xiàn); 而II型膠原免疫組化染色時，軟骨細胞胞漿被染成棕黃色，胞核不著色。透射電鏡分析顯示細胞核較大，多為圓形，形態(tài)不規(guī)則，核仁邊聚，常染色質(zhì)明顯。細胞質(zhì)胞漿豐富，核糖體、線粒體較多，有豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及分泌小泡，泡內(nèi)為合成的基質(zhì)成分，胞漿中還可見大量成團的糖原顆粒證實了本實驗所觀察的細胞為軟骨細胞。

本研究結(jié)果顯示，氟濃度對體外培養(yǎng)實驗大鼠軟骨細胞培養(yǎng)液中的GAG含量各受試組與對照組相比無顯著性差異(P＞0.05)，阿利新蘭染色顯示氟濃度對大鼠軟骨細胞胞質(zhì)內(nèi)的異染糖原顆粒也無明顯影響。說明氟濃度對體外培養(yǎng)實驗大鼠軟骨細胞GAG分泌無明顯影響，氟骨癥的機制可能不是通過影響軟骨細胞分泌GAG影響關(guān)節(jié)功能的。

有報道稱，“膠原蛋白是氟化物作用的靶子”[10]，膠原蛋白是骨與軟骨組織的重要成分之一，而氟是與膠原蛋白代謝有密切關(guān)系的微量元素，環(huán)境中的氟濃度可引起人與動物骨和軟骨膠原蛋白代謝異常。近年研究表明，過量氟可直接損害軟骨，引起骺板軟骨深層肥大細胞增多; 并可使大鼠軟骨基質(zhì)中可溶性膠原、膠原α1(II)鏈的分子量降低和尿中羥脯氨酸排泄量增加，表明過量氟可干擾軟骨膠原蛋白的代謝[11]。膠原表型對軟骨正常結(jié)構(gòu)的維持具有重要的意義，軟骨細胞分化的不同時期膠原表型表達不同。其中分化過程中的關(guān)節(jié)軟骨和骺板軟骨合成II、VI、IX和XI型膠原，肥大軟骨細胞特異性地合成X型膠原以及II型膠原，從軟骨細胞肥大后分化至形成類成骨細胞的過程中合成X和I型膠原[12～14]。據(jù)此，II型膠原的合成是軟骨細胞成骨分化過程中的一個重要階段, 所以, 對于II型膠原含量的檢測可以直接反映NaF對軟骨細胞分化的影響。本次研究中II型膠原免疫組化染色結(jié)果顯示, 隨著 NaF 濃度的升高(0～50.00 μmol/ml)，軟骨細胞周圍的II型膠原分泌量開始逐漸增多，但是濃度升至100.00 μmol/ml時，軟骨細胞開始死亡,細胞數(shù)量開始減少，細胞周圍的II型膠原染色顆粒也相應(yīng)減少。這說明NaF在一定濃度范圍內(nèi)對大鼠軟骨細胞的毒性作用符合一般毒性效應(yīng)規(guī)律，NaF致大鼠軟骨細胞II型膠原分泌改變作用存在閾值。本實驗對過量氟損傷軟骨機制進行初步探索, 發(fā)現(xiàn)氟濃度對軟骨細胞分泌GAG的能力沒有顯著影響, 而免疫組化染色研究從半定量分析結(jié)果顯示了氟濃度對軟骨細胞膠原分泌量有一定的影響，所以接下來可以繼續(xù)運用激光共聚焦技術(shù)對氟濃度對軟骨細胞膠原分泌量以及膠原分型進行進一步的細化研究。

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Effects of Excess Fluoride on Secretion of GAG and II Type Collagen in vitro Chondrocytes of Rats

WANG Ning, FAN Yu-lan, SHI Zhi-chong, ZHENG Wei-dong, LU Wei, XIAO Ping
(Department of Toxicology, Shanghai Municipal Center of Disease Control and Prevention, Shanghai 200336, China)

ObjectiveTo observe the effect of secretion of GAG and II type collagen of excess fluoride on in vitro chondrocytes of rats.MethodsChondrocytes of rats was separated from the 2-month old female rats, and cultured in the cell bottles. After identification, six groups were designed in the research including control group and NaF group (6.25 μmol/ml, 12.50 μmol/ml, 25.00 μmol/ml,50.00 μmol/ml and 100.00 μmol/ml). After 6 days of administration, GAG contents were measured.Alcian Blue dye and II type collagen immunohistochemistry dye were also performed on the in vitro chondrocytes of rats.ResultsAfter 6 days of treatment, there were no significant difference of GAG contents of cell culture medium between NaF groups and control group (P＞0.05). Alcian Blue dye showed that secretion of GAG content of all groups did not change after administered by NaF. But II type collagen immunohistochemistry dye showed that scores of II type collagen immunohistochemistry dye increased according to dosage of NaF leveled up (P＜0.05).ConclusionsNaF may not affect the content of GAG secreted by the chondrocytes of rats in vitro, but can affect the secretion of II type collagen.

NaF; Chondrocytes; GAG; II type collagen

Q95-33

A

1674-5817(2014)02-0120-06

10.3969/j.issn.1674-5817.2014.02.008

2014-01-10

上海市衛(wèi)生局科研課題(編號: 2007180)

范玉蘭(1964-), 女, 副研究員: 研究方向: 衛(wèi)生毒理學(xué), E-mail: ylfan@scdc.sh.cn

肖 萍, E-mail: pxiao@scdc.sh.cn