曹 爽, 丁建偉 , 李 炳, 袁麗粉, 杜 勤

(1. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院, 上海 200011;2. 云南中醫(yī)學(xué)院針灸推拿康復(fù)學(xué)院, 昆明 650500;3. 復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院, 上海 201508)

慢性束縛應(yīng)激誘導(dǎo)自發(fā)性高血壓大鼠出現(xiàn)抑郁焦慮樣行為

曹 爽1, 丁建偉2, 李 炳3, 袁麗粉1, 杜 勤1

(1. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院, 上海 200011;2. 云南中醫(yī)學(xué)院針灸推拿康復(fù)學(xué)院, 昆明 650500;3. 復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院, 上海 201508)

目的 探討自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)在慢性束縛應(yīng)激(Chronic Restraint Stress, CRS)時抑郁焦慮樣行為學(xué)改變。 方法 雄性SHR大鼠16只，隨機(jī)分為對照組(CON, n=8)和慢性束縛應(yīng)激組(CRS, n=8)。通過曠場試驗(Open Field test, OFT)、強迫游泳實驗(Forced Swimming test, FST)、高架十字迷宮試驗(Elevated Plus Maze, EPM)評價其抑郁焦慮樣行為，同時比較SHR血壓變化及血清ACTH水平。結(jié)果 束縛4周后，與對照組相比，CRS組的SHR在OFT中直立次數(shù)及總位移均顯著降低(P＜0.05)，F(xiàn)ST中不動時間顯著延長(P＜0.05)，EPM中開臂滯留時間百分比顯著下降(P＜0.05)。 結(jié)論 慢性束縛應(yīng)激可誘導(dǎo)SHR出現(xiàn)抑郁焦慮樣行為。

自發(fā)性高血壓大鼠(SHR); 慢性束縛應(yīng)激(CRS); 抑郁; 焦慮

高血壓病是臨床常見的身心疾病，其中焦慮抑郁障礙是高血壓患者中最常見的情緒障礙[1]。焦慮抑郁障礙不僅是高血壓病的獨立危險因素，還可顯著影響高血壓患者的預(yù)后[2～3]。應(yīng)激是高血壓與焦慮抑郁相互聯(lián)系的因素之一[4]。遇到應(yīng)激事件時，高血壓人群與正常血壓人群相比，心率及血壓的升高幅度更大，更易激惹，更易出現(xiàn)焦慮抑郁情緒，這與高血壓患者體內(nèi)交感神經(jīng)活性增高及下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamic-pituitary-adrenal axis, HPA)軸的高反應(yīng)性有關(guān)。SHR是目前國際公認(rèn)的最接近于人類原發(fā)性高血壓動物模型，其發(fā)病機(jī)制、外周血管阻力變化等都與人類高血壓相似。同時SHR屬于應(yīng)激高反應(yīng)性動物，應(yīng)激時其相關(guān)神經(jīng)內(nèi)分泌及心血管功能變化均較正常血壓大鼠更為顯著[5～6]。而應(yīng)激尤其是慢性應(yīng)激除包括神經(jīng)內(nèi)分泌等生理反應(yīng)外，還伴隨著一系列情緒、行為等心理反應(yīng)。因此關(guān)于慢性應(yīng)激對自發(fā)性高血壓大鼠的行為學(xué)影響日益受到關(guān)注，高血壓伴發(fā)抑郁焦慮動物模型的制備也成為研究的熱點。本實驗擬對SHR施予慢性束縛應(yīng)激，觀察其抑郁焦慮樣行為及血壓、內(nèi)分泌相關(guān)激素水平變化，以期為高血壓伴發(fā)抑郁焦慮動物模型的制備提供參考，為深入研究高血壓伴發(fā)抑郁焦慮的相關(guān)機(jī)制提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與飼養(yǎng)環(huán)境

10周齡清潔級雄性SHR大鼠，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2012-0001]提供，實驗在上海市公共衛(wèi)生臨床中心[SYXK(滬)2010-0098]進(jìn)行。大鼠飼養(yǎng)環(huán)境溫度為22±2 ℃，相對濕度55%±15%，維持12 h晝夜節(jié)律(光照時間7∶00～19∶00)。大鼠在適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后開始正式實驗。本研究動物實驗遵守美國國立衛(wèi)生院倡導(dǎo)的實驗動物管理和使用指導(dǎo)原則(Guide for Care and Use of laboratory Animals, NIH)，并經(jīng)上海交通大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)[滬科動倫(2012)30]。

1.2 主要儀器與試劑

曠場實驗、高架十字迷宮實驗設(shè)備及小動物行為分析系統(tǒng)均由上海多毅信息科技有限公司提供。PowerLab ML125/R 無創(chuàng)尾動脈血壓測定分析系統(tǒng)由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理教研室提供。ACTH放免試劑盒購自北京北方生物技術(shù)研究所。

1.3 慢性束縛應(yīng)激

將16只SHR隨機(jī)分為2組: 對照組(CON，n=8)和慢性束縛應(yīng)激組(CRS，n=8)。CRS組參照文獻(xiàn)方法[7～9]，將大鼠束縛于束縛架上，限制大鼠自由活動，但不會對其造成傷害。大鼠每日束縛6 h(9∶00～15∶00)，連續(xù)4周。

1.4 曠場實驗(OFT)

曠場實驗在底面為100 cm×100 cm, 高40 cm的無蓋黑色方箱中進(jìn)行，并由數(shù)碼攝像頭監(jiān)測動物行為活動。實驗時將大鼠放入箱內(nèi)底面中心, 同時進(jìn)行攝像，由小動物行為分析系統(tǒng)記錄分析5 min內(nèi)大鼠的水平運動情況及直立次數(shù)。實驗人員和計算機(jī)等設(shè)備與曠場箱隔開以減少對動物的干擾。

1.5 強迫游泳實驗(FST)

實驗第1日將每只大鼠單獨放入玻璃圓筒中(桶高40 cm，直徑18 cm)，預(yù)游泳15 min。第2日，再次將測試大鼠放入桶中，記錄大鼠在5 min內(nèi)的不動時間。

1.6 高架十字迷宮實驗(EPM)

實驗裝置由兩條開臂(長50 cm，寬10 cm)和兩條閉臂(長50 cm, 寬10 cm, 高20 cm)連接而成，且距離地面50 cm，并由數(shù)碼攝像頭監(jiān)測動物行為活動。測試時將大鼠面對開臂置于EPM的中央平臺處，由小動物行為分析系統(tǒng)記錄分析5 min內(nèi)大鼠在開、閉臂中的活動情況，以開臂滯留時間百分比為評價指標(biāo)。實驗在安靜、四周由遮光簾隔離干擾的環(huán)境條件下進(jìn)行。

1.7 血壓測定

將大鼠置于無創(chuàng)尾動脈血壓測定分析系統(tǒng)(PowerLab)配備的大鼠固定器內(nèi)，并將鼠尾在37℃恒溫水浸泡，待局部血管充分?jǐn)U張后，將氣囊式尾套及脈搏傳感器依次套于鼠尾，然后觀測脈搏波形，出現(xiàn)穩(wěn)定的脈搏波時開始測定血壓。重復(fù)測量3次，取平均值。

1.8 血漿ACTH濃度測定

行為學(xué)實驗及血壓測定完成后，10%水合氯醛腹腔注射(0.4 ml/100 g)麻醉大鼠，然后經(jīng)心臟取血，離心后取血漿，用放射免疫法測定血漿中ACTH濃度。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件統(tǒng)計處理，數(shù)據(jù)以x- ± s表示, 兩組比較用t檢驗, P＜0.05為統(tǒng)計學(xué)顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 OFT

如表1所示，曠場實驗中，與CON組大鼠相比，CRS組大鼠直立次數(shù)及總位移出現(xiàn)顯著下降，且每周測試結(jié)果比較均具有顯著性差異(P＜0.05)。

2.2 FST

如表2所示, CRS組大鼠在束縛后第2周到第4周在FST中的不動時間, 較CON組顯著延長(P＜0.05),表現(xiàn)出抑郁樣行為。

表 1 慢性束縛應(yīng)激后SHR曠場行為變化Table 1 Behvavior in OFT after CRS

2.3 EPM

自束縛第2周起，CRS組大鼠開臂滯留時間百分比與CON組比較出現(xiàn)顯著下降(P＜0.05)(表3)。

2.4 血壓

在束縛期間，CRS組大鼠血壓呈持續(xù)升高趨勢，與CON組大鼠血壓相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)(表 4)。

2.5 血漿ACTH濃度

束縛4周后，CRS組大鼠的血漿ACTH濃度(72.01±5.76) pg/ml顯著高于CON組大鼠(50.26±3.27)pg/ml(P＜0.05)。

3 討論

慢性束縛應(yīng)激是一種是有效的負(fù)性心理應(yīng)激動物模型, 其通過剝奪動物活動自由而產(chǎn)生純粹的挫折應(yīng)激，激活交感神經(jīng)系統(tǒng)及HPA軸(hypothalamicpituitary-adrenal axis)，進(jìn)而影響動物行為。大量研究已報道慢性束縛應(yīng)激可以誘導(dǎo)大鼠出現(xiàn)了穩(wěn)定的抑郁焦慮樣行為。其具體機(jī)制可能與海馬糖皮質(zhì)激素受體下調(diào)，腦內(nèi)腦源性神經(jīng)生長因子(brainderived neurotrophic factor, BDNF)及其受體功能受損，促炎因子IL-6水平升高及抑炎因子IL-10水平降低，進(jìn)而導(dǎo)致海馬、杏仁核等部位神經(jīng)元結(jié)構(gòu)功能改變等有關(guān)[9～11]。

OFT是評價大鼠在陌生環(huán)境中自發(fā)行為、探究行為與緊張度的一種方法，大鼠在曠場中的總位移及直立次數(shù)反映其自發(fā)活動及對新異環(huán)境的好奇心。FST是通過大鼠在水中不動時間反映其絕望行為。EPM則是利用大鼠對新異環(huán)境的探究特性和對高懸敞開臂的恐懼形成矛盾沖突行為來考察動物的焦慮狀態(tài)，其中大鼠在開臂中的滯留時間與焦慮水平成反比。本實驗發(fā)現(xiàn)連續(xù)4周的慢性束縛應(yīng)激后，SHR大鼠在OFT中規(guī)定時間內(nèi)總路程及直立次數(shù)均明顯減少，說明其活動性下降，好奇心減低; 在FST中掙扎及攀爬行為減少，不動時間延長，反映其絕望程度增加。這些表現(xiàn)說明應(yīng)激后SHR呈現(xiàn)抑郁狀態(tài)，與抑郁癥臨床中精神運動改變、興趣減低及無助、自殺等行為有一定的相似性。同時，應(yīng)激組大鼠在EPM開臂探索次數(shù)及停留時間明顯降低，又表現(xiàn)出一定的焦慮情感。目前，關(guān)于應(yīng)激時SHR大鼠行為學(xué)改變的研究并不很多。其中Roman等[12]發(fā)現(xiàn)在SHR在急性應(yīng)激時可表現(xiàn)出典型的焦慮樣行為，而慢性應(yīng)激并未顯著影響其焦慮水平。與本實驗結(jié)果不符，推測可能與應(yīng)激的方式及持續(xù)時間不同有關(guān)，本實驗中采用的慢性束縛應(yīng)激所導(dǎo)致的心理應(yīng)激相對更為強烈。

表 2 慢性束縛應(yīng)激對SHR強迫游泳實驗中不動時間的影響Table 2 Alterations in immobility behavior in the FST after CRS

表 3 慢性束縛應(yīng)激對SHR高架十字迷宮實驗中開臂滯留時間百分比的影響Table 3 Effect of CRS on the time spent in open arms of SHR in EPM

表 4 慢性束縛應(yīng)激對 SHR血壓的影響Table 4 Effect of CRS on blood pressure of SHR

同時，HPA軸及藍(lán)斑-交感-腎上腺髓質(zhì)軸激活是應(yīng)激反應(yīng)的主要特征。本實驗中經(jīng)過慢性束縛應(yīng)激的SHR變現(xiàn)出血漿ACTH水平和收縮壓顯著升高。已有大量研究表明SHR是應(yīng)激高敏動物，在應(yīng)激時其神經(jīng)內(nèi)分泌及心血管系統(tǒng)相關(guān)指標(biāo)均較正常血壓大鼠顯著[5～6]。本實驗結(jié)論與之相吻合。

綜上所述，慢性束縛應(yīng)激使SHR血漿ACTH及收縮壓升高的同時，也誘導(dǎo)其抑郁焦慮樣行為的發(fā)生。SHR應(yīng)激后情感反應(yīng)一方面可能與血漿ACTH水平升高有關(guān)，另一方面可能與其血壓水平有關(guān)。其中血壓及焦慮抑郁情緒關(guān)系密切，二者有著眾多調(diào)控機(jī)制，如HPA軸紊亂、交感神經(jīng)活性異常及腦內(nèi)腎素-血管緊張素系統(tǒng)功能改變，中樞神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)肽類(5-羥色胺、縮宮素及加壓素等)的合成與釋放異常，腦內(nèi)慢性非特異性炎癥反應(yīng)的激活等[4]。因此SHR大鼠血壓水平的增高，可能使其在應(yīng)激時更易表現(xiàn)出抑郁焦慮障礙樣行為，而這些負(fù)性情感反應(yīng)反過來又可干擾血壓的調(diào)控，使血壓進(jìn)一步升高。

臨床中高血壓伴發(fā)抑郁焦慮障礙在臨床中越來越常見，二者共病機(jī)制研究尚需進(jìn)一步研究。鑒于直接進(jìn)行人體實驗的局限性，制備合適的動物模型顯得尤為重要。目前采用復(fù)合處理，制備在一種疾病基礎(chǔ)上伴發(fā)抑郁的動物模型已有較多報道，如卒中后抑郁及心梗后抑郁動物模型均多可是采用慢性應(yīng)激的方法來制備[13～14]，而高血壓伴發(fā)抑郁焦慮動物模型的建立報道尚少。本研究由慢性束縛應(yīng)激誘導(dǎo)SHR出現(xiàn)焦慮抑郁樣行為，使之同時具備了高血壓及抑郁焦慮的特性，與臨床中二者高血壓與抑郁焦慮共病的特征點十分相近，可由此做進(jìn)一步探索，使之為高血壓伴發(fā)抑郁焦慮的病理機(jī)制的深入研究創(chuàng)造條件。

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Chronic Restraint Stress Induced Anxiety- and Depression-like Behaviors in Spontaneously Hypertensive Rats

CAO Shuang1, DING Jian-wei2, LI Bing3, YUAN Li-fen1, DU Qin1
(1. Shanghai Ninth People’s Hospital Affiliated Shanghai Jiao Tong University School of Medicine,Shanghai 20001, China; 2. School of Acupuncture, Massage and Rehabilitation, Yunnan College of Traditional Chinese Medicine, Kunming 650500, China;3. Affiliated Jinshan Hospital, Fudan University, Shanghai 201508, China)

ObjectiveTo investigate the effects of chronic restraint stress (CRS) on anxiety- and depression-like behaviors in Spontaneously Hypertensive Rats(SHR).MethodsSHR were randomly divided into control(CON) group and CRS group respectively. The changes of behaviors were detected by open field test (OFT),forced swimming test (FST) and elevated plus maze(EPM) test??the changes of blood pressure and levels of adrenocorticotropic hormone(ACTH) in plasma in different groups were also measured and compared.ResultsSHR in CRS group showed significant reductions in rearing incidence in OFT(P??0.05),the time spent in open arms during the EPM(P??0.05), and the immobility during the FST was increased significantly (P??0.05). Furthermore, the blood pressure and concentration of plasma ACTH increased significantly in CRS group compared to CON group.ConclusionsCRS can induce anxiety- and depression-like behaviors in SHR.

Spontaneously Hypertensive Rat(SHR);Chronic Restraint Stress(CRS); Depression; Anxiety

Q95-33

A

1674-5817(2014)02-0093-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2014.02.003

2013-10-12

上海市科委資助項目(074119621)

曹 爽(1988-), 女, 碩士研究生, 從事老年高血壓與抑郁癥的研究。E-mail: caoshuang2209@163.com

杜 勤(1964-), 碩士生導(dǎo)師, 從事老年心血疾病與心理障礙等的研究和治療。E-mail: jeanniedu@hotmail.com