史傳奇，劉玫，王臣，張欣欣，程薪宇

（哈爾濱師范大學生命科學與技術(shù)學院 黑龍江省分子細胞遺傳與遺傳育種重點實驗室，黑龍江 哈爾濱150025）

野豌豆族（tribe Vicieae）包括5屬，300余種，為一年生或多年生草本，葉多為偶數(shù)羽狀復葉，稀為奇數(shù)羽狀復葉，葉軸頂端具卷須或少數(shù)變?yōu)榇堂珷睿?－4］。東北產(chǎn)野豌豆族植物包括3屬：山黧豆屬（Lathyrus）包括9種及1變種；豌豆屬（Pisum）包括1種；野豌豆屬（Vicia）包括14種、4變種及7變型［5－6］。

葉片及葉柄結(jié)構(gòu)是植物相對保守和穩(wěn)定的特征，如葉形態(tài)、葉表皮細胞及附屬物和葉柄橫切面結(jié)構(gòu)等常被作為研究系統(tǒng)學與分類學的重要依據(jù)［7－17］。Leht［18］將山黧豆屬植物小葉葉形劃分為線形、橢圓形、倒卵形及卵形，葉柄無翼、具狹翼或?qū)捯?，并指出黃金山黧豆（Lathyrusaureus）小葉具腺毛。鄭太坤等［19］研究4種野豌豆屬植物表明，山野豌豆（Viciaamoena）、黑龍江野豌豆（V．a(chǎn)murensis）和大葉野豌豆（V．pseudorobus）均具橢圓形小葉，而廣布野豌豆（V．cracca）小葉為披針形。張雪梅［20］觀察5種豆科植物葉表皮微形態(tài)，將垂周壁式樣分為平直、平直－弓形、淺波形和深波形，并認為豌豆（Pisumsativum）與蠶豆（Viciafaba）均具不等型氣孔。Rodriguez［21］認為葉柄近軸面出現(xiàn)溝槽相對進化，葉柄內(nèi)維管束排列方式的進化順序為圓形－U形－V形。Lewis等［3］基于形態(tài)學與分子系統(tǒng)學數(shù)據(jù)分析表明山黧豆屬、豌豆屬與野豌豆屬之間，前兩者具有較近的親緣關(guān)系。

迄今為止，尚未見關(guān)于東北野豌豆族植物葉解剖結(jié)構(gòu)的詳細研究。本研究旨在通過對東北野豌豆族20余種植物葉外部形態(tài)與解剖結(jié)構(gòu)的觀察，為進一步研究豆科植物分類及系統(tǒng)學提供形態(tài)學基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1．1 材料

研究材料為東北野豌豆族3屬（山黧豆屬、豌豆屬和野豌豆屬），22種，2變種及1變型。新鮮材料于2012－2013年采自于中國東北部，經(jīng)哈爾濱師范大學王臣教授鑒定。憑證標本存放于哈爾濱師范大學植物標本館（Harbin Normal University，HANU），干材料于2013年取自于東北生物標本館（Institute of Forestry and Pedology，IFP）。物種名稱，憑證標本及采集地等信息詳見表1。

1．2 方法

掃描電鏡：參照陳曦等［22］的方法，成熟葉片切取長方形（5mm×3mm），用雙面膠將樣品粘在樣品臺上，之后，用Eiko IB－3離子濺射儀導電處理，濺射鍍膜7～8nm厚，在Hitachi S－4800型掃描電子顯微鏡下（加速電壓為5千伏）觀察毛狀體并照相。

葉片透明：參考任海燕等［23］的方法，每個物種取來自兩植株的成熟葉片，應(yīng)用5%NaOH水溶液透明葉片不少于24h，用50%甘油水溶液制成臨時裝片，重復3次，經(jīng)Olympus BX53顯微鏡觀察氣孔分布及形態(tài)，Olympus DP26成像系統(tǒng)照相，氣孔類型的鑒定參照Dilcher系統(tǒng)［24］。

表1 東北野豌豆族物種（用于葉特征研究）、分類地位、憑證標本及采集地［5］Table 1 Taxa of the tribe Vicieae in northeastern China examined for leaf characters，together with taxonomic status，voucher specimen details and locality

GMA（glycol methacrylate，乙二醇甲基丙烯酸酯）切片：新鮮材料用FAA（Formalin－alcohol－acetic acid mixture，福爾馬林－乙醇－冰醋酸混合液）固定，取自標本的材料放入熱水中約30min，待材料充分吸水膨脹后，用FAA固定，時間不少于24h，每個物種取自兩植株葉柄的中部，葉柄極短的物種取基部葉軸的中部。材料經(jīng)50%乙醇、100%乙醇、異丙醇、正丁醇系列脫水處理各2次（每次12h）后進入GMA滲透3次，前2次各為1d，第3次5～7d。之后將材料及GMA裝入膠囊，置于60℃溫箱24h進行聚合［25］。用Leica Ultralcut R切片，厚度2～3μm。根據(jù)Feder和 O’Brien［25］的方法，切片首先置于 DNPH（2，4－Dinitrophenylhydrazine，2，4－二硝基苯肼）冰醋酸水溶液30min，流水沖洗8～10min，轉(zhuǎn)置于高碘酸10min，流水沖洗5min后將切片烘干，置于Schiff試劑30min，流水沖洗1～2min，最后用甲苯胺藍染色1～2min，流水沖洗5～10min，切片烘干后用加拿大樹膠封片。切片同樣用Olympus BX53顯微鏡觀察及Olympus DP26成像系統(tǒng)照相。

2 結(jié)果與分析

本研究觀察并描述了東北野豌豆族葉的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征，具體結(jié)果詳見表2。

2．1 葉的形態(tài)

圖1 東北野豌豆族葉形Fig．1 Leaf shape of tribe Vicieae in northeastern China

山黧豆屬、豌豆屬和野豌豆屬植物的葉均為偶數(shù)羽狀復葉，但小葉的數(shù)目有所不同，多數(shù)物種具2～6對小葉（圖1A，E），香豌豆（圖1B）、牧地山黧豆（圖1C）和歪頭菜（圖1H）只具1對，五脈山黧豆植株上部具2～3對（圖1D1），而下部只具1對（圖1D2），廣布野豌豆（圖1F）多達10余對。葉軸頂端分為2種形態(tài)：分歧（圖1B）或單一（圖1C）的卷須和刺狀（圖1G，H）。大山黧豆（圖1A）和五脈山黧豆（圖1D1）植株的中上部葉的葉軸頂端形成卷須，而下部為刺狀（圖1D2）。小葉葉形有4種：卵形、橢圓形（如大山黧豆、豌豆，圖1A，E）、披針形或線形（如牧地山黧豆、五脈山黧豆，圖1C，D）。豌豆的托葉為葉狀（圖1E），而山黧豆屬和野豌豆屬多為箭頭形或半箭頭形（圖1B～D，F(xiàn)，G），但形態(tài)差異較大。

2．2 葉表皮細胞及附屬物特征

多數(shù)物種葉表面及葉緣具毛狀體，毛狀體分為兩類：單細胞非腺毛（如山野豌豆葉上表面，圖2A）和多細胞腺毛（如山野豌豆葉下表面，圖2B）。豌豆葉的上、下表面及葉緣均無毛。單細胞非腺毛存在于多數(shù)山黧豆屬及野豌豆屬植物，且后者還具多細胞腺毛。葉表皮細胞垂周壁主要分為兩種類型，多為波形（如豌豆葉下表面、山野豌豆葉下表面，圖2C，D），少為弓形（如五脈山黧豆葉下表面，圖2E）。上、下表皮細胞垂周壁特征相同，偶見不同，如黑龍江野豌豆上表皮的為弓形，而下表皮的為波形。氣孔包括3種類型：不等型、無規(guī)則型和平列型。山黧豆屬及豌豆屬的氣孔主要為不等型（圖2B，C），前者少見無規(guī)則型和平列型，后者偶見平列型。野豌豆屬氣孔主要為無規(guī)則型（圖2A），少數(shù)為不等型，偶見平列型。氣孔可分布于葉片的上、下表面（如豌豆和山野豌豆），或只分布在下表面（如大山黧豆和歪頭菜）。

2．3 葉柄結(jié)構(gòu)

葉柄橫切面性狀有4種類型：近倒三角形、戟形、心形和圓形。山黧豆屬葉柄橫切面為近倒三角形，如大山黧豆（圖3A）、五脈山黧豆（圖3D）等，或為戟形，如香豌豆（圖3B）和山黧豆（圖3C），前者具翼。野豌豆屬為戟形（圖3F1，G）或心形（圖3H）。兩屬的葉柄近軸面均具溝槽，山黧豆屬較野豌豆屬的溝槽淺。豌豆葉柄橫切面為近圓形而無溝槽（圖3E）。葉柄表皮細胞1層，緊密排列且外壁平滑，無明顯角質(zhì)層。表皮下由2～4層薄壁細胞構(gòu)成的皮層，內(nèi)含大量淀粉粒。位于棱角處的皮層細胞形成厚角組織，淀粉粒較少或無。山野豌豆和狹葉山野豌豆細胞內(nèi)可見單寧（圖3F2）。葉柄大維管束數(shù)目5，7或為多數(shù)。山黧豆屬維管束數(shù)目為5或7，相對較大、韌皮部外側(cè)有韌皮纖維且位置穩(wěn)定（圖3A～D），豌豆的大維管束多于7（圖3E），野豌豆屬的通常為5（圖3F～H）。維管束韌皮部與木質(zhì)部之間通?？梢?或3層形成層細胞（圖3F2）。維管束通常排列為V形（圖3D，F(xiàn)～H），或近軸面溝槽附近亦見維管束排列的心形（圖3A～C），豌豆葉柄維管束排列為圓形。山黧豆屬的大山黧豆（圖3A）、豌豆屬的豌豆（圖3E）和野豌豆屬的蠶豆（圖3G）等的葉柄具髓腔。

圖2 東北野豌豆族葉表皮毛狀體及氣孔Fig．2 The leaf trichome and stoma of tribe Vicieae in northeastern China

圖3 東北野豌豆族葉柄結(jié)構(gòu)Fig．3 The petiole structure of tribe Vicieae in northeastern China

2．4 檢索表

根據(jù)所研究物種的葉形，小葉數(shù)，毛狀體，氣孔類型及分布，葉柄結(jié)構(gòu)等特征制平行檢索表。

2．4．1 東北野豌豆族檢索表

1．氣孔主要為無規(guī)則型，葉柄大維管束為5………………………………………………………… 野豌豆屬Vicia

1．氣孔主要為不等型，葉柄大維管束5，7或更多……………………………………………………………………2

2．葉柄橫切面為圓形，近軸面無溝槽 ………………………………………………………………… 豌豆屬Pisum

2．葉柄橫切面不為圓形，近軸面有溝槽 ………………………………………………………… 山黧豆屬Lathyrus

2．4．2 東北山黧豆屬檢索表

1．葉柄具髓腔 …………………………………………………………………………… 大山黧豆Lathyrusdavidii

1．葉柄無髓腔 …………………………………………………………………………………………………………2

2．葉柄具翼，上和下表皮垂周壁樣式不一致 …………………………………………………… 香豌豆L．odoratus

2．葉柄不具翼，上和下表皮垂周壁樣式一致…………………………………………………………………………3

3．葉柄橫切面為戟形 …………………………………………………………………………………………………4

3．葉柄橫切面為近倒三角形 …………………………………………………………………………………………5

4．小葉為1對，葉柄維管束排列為V形 ………………………………………………… 牧地山黧豆L．pratensis

4．小葉多于1對，葉柄維管束排列為心形……………………………………………………………………………6

5．葉上及下表皮細胞垂周壁為弓形，氣孔分布于葉上及下表面 ………………… 五脈山黧豆L．quinquenervius

5．葉上及下表皮細胞垂周壁為波形，氣孔僅分布于葉下表面………………………………………………………7

6．葉為披針形或線形，氣孔為不等型及無規(guī)則型 ……………………………… 山黧豆L．paluatrisvar．pilosus

6．葉為卵形或橢圓形，氣孔為不等型及平列型………………………………………………………………………8

7．葉柄大維管束數(shù)常為5，多細胞腺毛僅分布于葉下表面 ……………………………… 東北山黧豆L．vaniotii

7．葉柄大維管束數(shù)常為7，多細胞腺毛分布于葉兩面 ………………………………… 三脈山黧豆L．komarovii

8．葉表皮細胞垂周壁為波形，葉表面無毛 …………………………………………………… 矮山黧豆L．humilis

8．葉表皮細胞垂周壁為弓形，葉表面具毛 ……………………………………………… 海濱山黧豆L．maritimus

2．4．3 東北野豌豆屬檢索表

1．葉柄維管束排列為心形 ……………………………………………………………………………………………2

1．葉柄維管束排列為V形 ……………………………………………………………………………………………3

2．小葉5～7對，氣孔只分布于葉下表面，葉柄橫切面為戟形 ……………………… 東方野豌豆Viciajaponica

2．小葉2～5對，氣孔分布于葉上及下表面，葉柄橫切面為心形 …………………… 大葉野豌豆V．pseudorobus

3．葉上表皮細胞垂周壁為弓形，下表皮為波形 ……………………………………… 黑龍江野豌豆V．a(chǎn)murensis

3．葉上及下表皮細胞垂周壁均為波形 ………………………………………………………………………………4

4．氣孔為無規(guī)則型 ……………………………………………………………………………………………………5

4．氣孔具無規(guī)則型及其他類型 ………………………………………………………………………………………6

5．葉柄橫切面為戟形 …………………… 山野豌豆V．a(chǎn)moena（狹葉山野豌豆var．oblongifolia小葉為線形）

5．葉柄橫切面為心形 …………………………………………………………………… 多莖野豌豆V．multicaulis

6．葉柄具髓腔 …………………………………………………………………………………………………………7

6．葉柄無髓腔 …………………………………………………………………………………………………………8

7．葉軸頂端為刺狀，葉緣無毛 ………………………………………………………………………… 蠶豆V．faba

7．葉軸頂端為卷須，葉緣有單細胞非腺毛……………………………………………………………………………9

8．氣孔分布于葉的上及下表面 ………………………………………………………………………………………10

8．氣孔只分布于葉的下表面…………………………………………………………………………………………11

9．小葉4～8對，葉片上表面具單細胞非腺毛和腺毛 ……………………………………… 救荒野豌豆V．sativa

9．小葉3～4對，葉片上表面只具單細胞非腺毛，無腺毛 …………………………………… 大花野豌豆V．bungei

10．葉軸頂端為刺狀，葉片下表面無毛 ……………………………………………………… 柳葉野豌豆V．venosa

10．葉軸頂端為卷須，葉片下表面有毛………………………………………………………………………………12

11．小葉2～3對，葉柄橫切面為戟形 ………………… 北野豌豆V．ramuliflora（貝加爾野豌豆f．baicalensis）

11．小葉僅1對，葉柄橫切面為心形 …………………………………………………………… 歪頭菜V．unijuga

12．小葉5～12對，葉柄橫切面為戟形 ……………………………………………………… 廣布野豌豆V．cracca

12．小葉3～5對，葉柄橫切面為心形 ………………………………………………… 索倫野豌豆V．geminiflora

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3 討論

本研究的東北野豌豆族植物的葉外部形態(tài)（小葉數(shù)目、葉形及葉軸頂端）與前人報道基本相同［3－6，10－12，18－19］，可作為種間的分類依據(jù)。豌豆的托葉為葉狀，山黧豆屬和野豌豆屬的托葉為箭頭狀或半箭頭狀，但形態(tài)變化很大，我們觀察到不僅在種間，在同一植株不同部位的托葉也有差異，因此認為托葉不宜作為野豌豆族植物的分類依據(jù)。野豌豆族植物葉表面無或具稀疏非腺毛［3－6，26－28］。Leht［18］報道山黧豆屬小葉具腺毛，本研究同樣發(fā)現(xiàn)山黧豆屬的幾個種和野豌豆屬多數(shù)種具多細胞腺毛。成熟葉片毛狀體的類型與分布比較穩(wěn)定，可作為種間的分類依據(jù)。張雪梅［20］指出豌豆的上及下表皮細胞垂周壁為淺波形，蠶豆的為深波形，作者認為野豌豆族植物中淺波與深波之間有過渡類型，界限不明顯，故將表皮細胞垂周壁分為弓形和波形兩類。山黧豆屬、豌豆屬和野豌豆屬具不同類型的氣孔，并且在同一葉片上的氣孔類型也不同，經(jīng)重復觀察，前兩者以不等型氣孔為主，而野豌豆屬多為無規(guī)則型，說明氣孔在屬間的分類具有一定的意義。Antonielli等［29］認為陰生植物氣孔多分布于葉片上表面，但本研究顯示林下的物種氣孔多分布在葉片下表面（如大山黧豆、北野豌豆），這可能有利于植物在林下更好地進行光合作用。山黧豆屬和野豌豆屬的葉柄近軸面都具有溝槽，但前者的稍淺，豌豆葉柄近軸面無溝槽，橫切面為近圓形，具多個不定數(shù)的大維管束，與前兩屬差別較大，可作為屬間的分類依據(jù)。葉柄內(nèi)髓腔的有無和維管束排列方式等特征因種而異，屬間有交叉，可以作為區(qū)分屬下不同種間的分類依據(jù)。

野豌豆屬植物形態(tài)變化多樣，分類存在較大的爭議［26］。傅沛云［6］認為狹葉山野豌豆的小葉為長圓形或長圓狀線形，有時為近線形而作為山野豌豆的變種。李瑞軍等［30］和夏振岱［26］也贊成這一觀點。蘇亞拉圖等［27］根據(jù)狹葉山野豌豆和山野豌豆的花粉性狀、萌發(fā)孔類型等特征極為相似，且同一植株上小葉葉形不易劃分出矩圓形或長披針形而將前者并入后者。通過對多份樣品的比較研究，發(fā)現(xiàn)兩者葉表面毛狀體、氣孔類型等特征一致，但小葉葉形明顯不同，故支持將狹葉山野豌豆作為山野豌豆變種的處理。傅沛云［6］根據(jù)花軸不分枝、比葉長或稍短等特征將貝加爾野豌豆作為北野豌豆的變型。蘇亞拉圖等［27］觀察在同一植株上同時存在分枝和不分枝的花序，贊成蔣尤泉［31］將兩者合并處理為北野豌豆。本研究認為兩者葉表面氣孔類型、葉柄橫切面等葉的特征一致，支持將兩者合并為北野豌豆的觀點。

Rodriguez［21］認為葉柄的進化方式為橫切面為圓形的葉柄較為原始，在圓形葉柄近軸面發(fā)育出溝槽的更為進化。維管束排列從圓形到U形，再到V形。根據(jù)本研究結(jié)果可知，豌豆屬的豌豆葉柄為較原始的圓形，山黧豆屬和野豌豆屬的葉柄近軸面具溝槽，較為進化。本研究沒有觀察到維管束排列成U形。作者認為山黧豆、大葉野豌豆等的維管束排列成心形應(yīng)是介于圓形和U形之間的過渡類型，即葉柄維管束排列的進化方式為圓形－心形－U形－V形。Lewis等［3］指出與野豌豆屬相比，山黧豆屬與豌豆屬的親緣關(guān)系較近。結(jié)合葉柄結(jié)構(gòu)我們推斷野豌豆族的山黧豆屬、豌豆屬和野豌豆屬中，豌豆屬較為原始，而野豌豆屬較為進化。

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