吳婧，才華，柏錫，紀巍，魏正巍，唐立酈，趙陽，朱延明

(東北農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)生物功能基因重點實驗室，黑龍江哈爾濱150030)

我國是世界上主要的鹽堿地國家之一，鹽堿地面積約4000萬hm2，土壤鹽漬化嚴重影響農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境［1］。因此培育耐鹽堿作物品種，充分利用鹽堿地資源是推動農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)發(fā)展的有效手段。紫花苜蓿(Medicago sativa)作為栽培牧草，是農(nóng)牧業(yè)結(jié)合的紐帶。其營養(yǎng)豐富，產(chǎn)量高，同時具有適應性廣、抗鹽性強的特性，是改良和利用鹽堿地的主要植物［2-3］。然而苜蓿的耐鹽堿性有限，其耐鹽程度有待進一步提高［4］。因此通過轉(zhuǎn)基因手段培育耐鹽堿苜蓿，對于發(fā)展畜牧業(yè)、改善生態(tài)環(huán)境具有重要作用［5］。

GST(谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶，glutathione S-transferase)是一類植物普遍存在多功能酶。這類酶用于催化谷胱甘肽與毒性生物異源物質(zhì)或氧化產(chǎn)物結(jié)合，從而促進此類物質(zhì)的代謝、區(qū)域化隔離或清除［6］。大量研究表明，它的表達不僅受生物脅迫［7］的影響，還受干旱［8］、冷［9］、重金屬離子［10］、鹽［11］和除草劑安全劑［12］等非生物脅迫的誘導。而參與非生物脅迫的機制是降低細胞體內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平，從而減輕非生物脅迫對植物的損傷［13］。本實驗室(東北農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)生物功能基因重點實驗室)前期應用基因芯片技術(shù)建立野生大豆(Glycine soja)鹽堿脅迫基因表達譜，并構(gòu)建了鹽堿脅迫基因調(diào)控網(wǎng)絡，從中篩選出28個位于關(guān)鍵調(diào)控節(jié)點的脅迫應答基因，其中包括3個GST家族基因GsGST13，GsGST114，GsGST19［14］。并系統(tǒng)的研究了3個基因的耐鹽堿功能。其中將GsGST14，GsGST19轉(zhuǎn)入苜蓿，增強了苜蓿的耐堿性［6，15］。而GsGST13(GQ265911)基因可以提高煙草(Nicotiana tabacum)對NaCl和干旱脅迫的耐性［7］。但其轉(zhuǎn)入苜蓿是否能夠提高苜蓿的耐鹽性，有待進一步研究。

苜蓿中含硫氨基酸匱乏，嚴重影響了苜蓿的營養(yǎng)價值和商業(yè)價值［16］。因此提高苜蓿含硫氨基酸的含量對于改善苜蓿的品質(zhì)具有重要作用。SCMRP(專利號No:CN200910073162．7)基因是利用生物信息方法改造的高甲硫氨酸蛋白基因，適合在豆科植物中表達［17］。但該基因轉(zhuǎn)入苜蓿是否能夠提高苜蓿的含硫氨基酸含量有待研究。

本研究將GsGST13和SCMRP基因構(gòu)建雙價植物表達載體，采用農(nóng)桿菌介導法將其轉(zhuǎn)化到農(nóng)菁1號苜蓿(Medicago sativa cv．Nongjing No．1)。并對轉(zhuǎn)基因苜蓿在鹽脅迫下的表型、生理指標進行分析，同時進行氨基酸含量分析。旨在獲得質(zhì)量及品質(zhì)均改良的苜蓿品種，并闡明GsGST13基因在苜蓿中的耐鹽能力，為耐鹽苜蓿品種的篩選提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料

大腸桿菌DH5α、農(nóng)桿菌EHA105、植物表達載體pCGEM-SCMRP，pCGBE-GsGST13均由東北農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)生物功能基因重點實驗室構(gòu)建保存;轉(zhuǎn)化受體為農(nóng)菁1號苜蓿［18］，由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院草業(yè)研究所提供。

1．2 方法

1．2．1 植物表達載體的構(gòu)建 在植物表達載體pCGEM-SCMRP上利用EcoRⅠ單酶切得到SCMRP基因，連接到帶有GST13基因的植物表達載體pCGBE-GsGST13上，構(gòu)建雙價植物表達載體 pBEOGST13/SCMRP。其中GsGST13基因由煙草花葉病毒E12-CaMV35S promoter調(diào)控，而SCMRP基因由雙35S啟動子調(diào)控，以bar作為篩選標記基因，構(gòu)建高水平組成型植物表達載體。采用凍融法將重組質(zhì)粒導入農(nóng)桿菌EHA105，用SCMRP-S/SCMRP-AS對轉(zhuǎn)化子進行基因特異性引物PCR檢測，陽性菌用于苜蓿的遺傳轉(zhuǎn)化。

1．2．2 GsGST13/SCMRP基因?qū)俎５倪z傳轉(zhuǎn)化及再生植株的獲得 在盛慧等［19］的農(nóng)桿菌介導方法基礎上略做改進，進行苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化。經(jīng)過種子萌發(fā)、無菌苗獲得、子葉節(jié)農(nóng)桿菌共培養(yǎng)、抗性不定芽誘導及篩選(草胺膦glufosinate，0．5 mg/L)、誘導生根，馴化移栽等過程。

1．2．3 轉(zhuǎn)基因苜蓿植株的分子生物學鑒定 分子生物學檢測，包括PCR檢測和RT-PCR檢測。PCR檢測:以抗性植株的總DNA為模板，以植物表達載體質(zhì)粒DNA為陽性對照，分別以水和未轉(zhuǎn)基因植株的總DNA為陰性對照，用篩選標記基因bar及其啟動子序列設計特異引物。選取PCR陽性的轉(zhuǎn)基因植株，進行GsGST13和SCMRP轉(zhuǎn)錄水平分析。以苜蓿GAPDH(GenBank登錄號為MTR_4G131180)基因為內(nèi)參基因。引物序列如表1。

1．2．4 鹽處理下轉(zhuǎn)基因苜蓿的表型分析 實驗于2012年6月中旬－8月底在東北農(nóng)業(yè)大學香坊農(nóng)場27號溫室內(nèi)進行。

參照魏正巍等［20］的方法，略有改動。選取生長狀態(tài)良好的轉(zhuǎn)GsGST13/SCMRP基因植株和野生型(WT)植株枝條，剪取有2～3個節(jié)點的莖段于生根粉中浸泡2 h左右。插入底部打孔的盛有普通土∶草炭土∶蛭石(1∶1∶1)的塑料大盆內(nèi)1．5 cm左右，定期噴灌。兩周后長出不定根，繼續(xù)培養(yǎng)兩周選取生長狀態(tài)良好且一致的擴繁苗，移栽到含有相同基質(zhì)的小缽中，每缽1株，用1/8 Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)，緩苗1個月后，將轉(zhuǎn)基因和野生型材料各分成3組，每組10株單株，設3次重復。分別用含有0，200，300mmol/LNaCl處理，每2 d更換一次營養(yǎng)液，15 d后觀察記錄表型，并對植株株高，鮮重進行測量。鹽處理后直接用尺子測量苜蓿植株的株高，鮮重的測定將各處理苜蓿植株從營養(yǎng)缽中小心取出用水沖洗掉其根部附著的蛭石并用吸水紙吸干其表面水珠剪開苗的根系和地上部分，于天平上稱重。每株系每處理取樣10株，取其平均值，實驗做3次重復。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1．2．5 轉(zhuǎn)基因植株相關(guān)生理指標的檢測 采用硫代巴比妥酸(TBA)［21］比色法測定丙二醛(MDA)含量，參照Rao等［22］的方法提取苜蓿葉片總蛋白，略作改動，采用考馬斯亮藍法檢測蛋白含量。參照Mauch和Dudlar［23］的方法檢測GST活性。采用NBT比色法［24］檢測SOD活性。采用Talarczyk等［25］的方法測定過氧化氫 (H2O2)含量。

1．2．6 轉(zhuǎn)基因植株的氨基酸分析 采用氨基酸全自動分析儀，樣品處理采用HCl(6 mol/L)水解法［26］。

1．3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有生理指標設置3次重復，用t檢驗檢測。*和＊＊表示轉(zhuǎn)基因株系和野生型株系間差異的統(tǒng)計學意義(*表示在P＜0．05水平差異有統(tǒng)計學意義，＊＊表示P＜0．01水平差異有統(tǒng)計學意義)。

2 結(jié)果與分析

2．1 植物表達載體構(gòu)建及抗性植株的獲得

植物表達載體pBEOGST13/SCMRP構(gòu)建如圖1，對轉(zhuǎn)化子進行EcoRⅠ酶切鑒定，由圖2泳道4可以看出，酶切得到約12000和2000 bp的兩條帶，證明載體構(gòu)建正確。重組質(zhì)粒命名為pBEOGST13/SCMRP。采用凍融法將重組質(zhì)粒導入農(nóng)桿菌EHA105，用于下一步的苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化。采用根癌農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化苜蓿(圖3)，共得到了54株抗性植株。

圖1 植物表達載體pBEOGST13/SCMRP構(gòu)建Fig．1 Construction of plant expression vector pBEOGST13/SCMRP

2．2 抗性植株的分子檢測

圖2 植物表達載體pBEOGST13/SCMRP的酶切鑒定結(jié)果Fig．2 Identification of plant expression vector pBEOGST13/SCMRP

對得到抗性植株進行PCR檢測，部分PCR鑒定如圖4所示，陽性對照和轉(zhuǎn)基因植株均擴增出約450 bp片段。初步證明基因已整合到苜蓿基因組中。對篩選得到的17株P(guān)CR陽性植株進行轉(zhuǎn)錄水平分析。RT－PCR分析結(jié)果顯示，共獲得了4株GsGST13和SCMRP基因均超量表達的轉(zhuǎn)基因苜蓿(圖5)。

2．3 鹽處理下轉(zhuǎn)基因苜蓿的表型分析

由于苜蓿的生長周期長，并且是開放式異花授粉，不便于獲得苜蓿種子。因此，采用無性扦插繁殖的方式研究轉(zhuǎn)基因苜蓿的耐鹽性。在RT－PCR陽性植株中選取GsGST13基因表達量最高和最低的2個株系G16和G50，進行表型分析。將轉(zhuǎn)基因和野生型苜蓿株系分別用0，200，300 mmol/L NaCl處理15 d后發(fā)現(xiàn)，在正常條件下(0 mmol/L NaCl)，轉(zhuǎn)基因苜蓿與野生型苜蓿生長狀態(tài)良好且大致相同(圖6A)，表明GsGST13/SCMRP基因的導入并未對苜蓿的生長發(fā)育造成影響。在200 mmol/L NaCl脅迫下野生型苜蓿鹽害較輕，葉片逐漸變黃，而轉(zhuǎn)基因株系生長良好(圖6B)。在300 mmol/L NaCl脅迫條件下，野生型苜蓿鹽害比較嚴重，生長發(fā)育受抑制，葉片逐漸變黃、卷曲、萎蔫，而轉(zhuǎn)基因苜蓿只受到輕微影響，仍能正常生長，耐鹽表現(xiàn)明顯好于野生型苜蓿(圖6C)。

圖3 苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化及植株再生Fig．3 Genetic transformation and p lant regeneration of M．sativa

圖4 轉(zhuǎn)GsGST13/SCMRP抗性植株的PCR鑒定Fig．4 PCR identification of resistant plants that transformed w ith GsGST13/SCMRP

圖5 轉(zhuǎn)基因GsGST13/SCMRP植株的RT－PCR檢測Fig．5 RT －PCR identification of GsGST13/SCMRP transgenic plants

圖6 轉(zhuǎn)GsGST13/SCMRP基因苜蓿鹽脅迫表型分析Fig．6 Stress phenotype analysis of GsGST13/SCMRP transgenic alfalfa

圖7A，圖7B表明，所有株系的株高與鮮重均隨鹽處理濃度的增高而逐漸下降，但轉(zhuǎn)基因株系G50和G16的下降幅度均小于野生型。其中在200 mmol/L NaCl處理條件下，轉(zhuǎn)基因株系G16的株高顯著高于野生型(P＜0．05)，而轉(zhuǎn)基因株系G50的鮮重顯著高于野生型(P＜0．05)。在300 mmol/L NaCl處理條件下2個轉(zhuǎn)基因株系的株高和鮮重均顯著地高于野生型(P＜0．05，P＜0．01)。由此進一步說明轉(zhuǎn)GsGST13/SCMRP基因苜蓿具有較強的耐鹽能力。

2．4 鹽脅迫條件下轉(zhuǎn)GsGST13/SCMRP基因苜蓿相關(guān)生理指標的分析

為了驗證超量表達GsGST13基因的株系是否在鹽脅迫下能夠提高谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)活性，進行了GST活性的測定。結(jié)果顯示:在正常條件下，2個轉(zhuǎn)GsGST13基因株系的GST活性與野生型相比存在顯著差異 (P＜0．01)(圖8A)，說明GsGST13基因在轉(zhuǎn)基因植株中得到了超量表達;隨著NaCl脅迫濃度的增加，轉(zhuǎn)基因和野生型苜蓿株系的GST活性均被誘導升高，但轉(zhuǎn)基因株系的GST活性均顯著高于野生型株系(P＜0．01)。說明隨著脅迫濃度增加，超量表達的GsGST13/SCMRP基因增強了鹽脅迫條件下轉(zhuǎn)基因苜蓿的GST活性，其保護細胞免受氧化中毒功能啟動，從而增強了轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽能力。

超氧化物歧化酶(SOD)是參與清除植物體內(nèi)活性氧的重要機制之一［27］。如圖8B所示，脅迫15 d后，在0 mmol/L NaCl處理下，各株系的SOD活性無明顯差異。在鹽脅迫下各株系的SOD活性增強，轉(zhuǎn)基因株系G50和G16株系的SOD活性均顯著高于野生型(P＜0．05，P＜0．01)。表明了GsGST13/SCMRP基因的表達能夠在鹽脅迫下提高轉(zhuǎn)基因植株的SOD活性，進一步降低了鹽脅迫對植株造成的氧化傷害。

在鹽脅迫下，植物細胞會產(chǎn)生大量的活性氧，同時在活性氧的作用下，膜脂發(fā)生過氧化反應［28］。因此，進行了H2O2和MDA含量的測定，以檢測轉(zhuǎn)基因苜蓿株系是否降低了氧化損傷。由圖8C，圖8D可見，在非鹽分脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因和野生型苜蓿的H2O2和MDA含量差異不顯著。隨著鹽濃度的升高，轉(zhuǎn)基因和野生型苜蓿葉片中H2O2和MDA的含量呈上升趨勢。但轉(zhuǎn)基因株系的增加幅度低于對照，尤其在300 mmol/L NaCl處理后差異達到顯著水平(P＜0．05)，說明轉(zhuǎn)基因苜蓿能夠在高鹽脅迫下減少氧化損傷，降低膜脂過氧化程度，遭受的傷害較輕，耐鹽能力有了顯著地提高。

圖7 鹽脅迫對轉(zhuǎn)基因及野生型苜蓿生長的影響Fig．7 Effects of salt stress on transgenic and w ild-type alfalfa lines

圖8 轉(zhuǎn)GsGST13/SCMRP基因苜蓿生理指標分析Fig．8 Changes of physiological characteristics of transgenic alfalfa w ith GsGST13/SCMRP

2．5 轉(zhuǎn)GsGST13/SCMRP基因苜蓿的氨基酸分析

結(jié)果顯示(表2)，轉(zhuǎn)基因株系G16葉片中甲硫氨酸，半胱氨酸含量均高于野生型，且達到顯著水平(P＜0．05);轉(zhuǎn)基因株系G50葉片中甲硫氨酸含量顯著高于野生型(P＜0．05)，半胱氨酸含量也高于野生型植株，但沒有達到顯著水平。2個轉(zhuǎn)基因株系在含硫氨基酸總量上與野生型相比，分別顯著提高了0．57%和0．52%。說明GsGST13/SCMRP基因的超量表達能夠提高轉(zhuǎn)基因苜蓿中的甲硫氨酸及半胱氨酸的含量。

表2 轉(zhuǎn)GsGST13/SCMRP基因苜蓿葉片甲硫氨酸及半胱氨酸含量分析Table 2 Analysis on Met and Cys content of transgenic alfalfa w ith GsGST13/SCMRP gene %

3 討論

利用基因工程技術(shù)提高苜?？鼓嫘砸殉蔀檐俎ＳN的重要途徑。目前，已有許多利用轉(zhuǎn)耐鹽相關(guān)基因來改良紫花苜蓿耐鹽性的研究報道，Li等［29］在紫花苜蓿中高效表達鹽生植物蘇打豬毛菜(Salsola soda)的Na+/H+反向轉(zhuǎn)運體基因SsNHX1，使轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性顯著增強。Bao等［30］將擬南芥(Arabidopsis thaliana)H+-PPase基因AVP1導入新疆大葉苜蓿中，分析超表達AVP1轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性，結(jié)果表明轉(zhuǎn)AVP1基因可以明顯地提高紫花苜蓿的耐鹽性。李燕等［28］將紫花苜蓿MsZIP基因?qū)胲俎?，發(fā)現(xiàn)基因在苜蓿中的超表達可以提高苜蓿的耐鹽性。本研究選用的GsGST13基因來源于野大豆鹽堿脅迫基因表達譜，屬于Tau類GST亞家族［6］。大量研究表明Tau類GST與植物對生物和非生物脅迫的耐受有關(guān)［31-32］。因而選用該基因轉(zhuǎn)化農(nóng)菁1號苜蓿，期望能夠提高苜蓿的耐鹽性。

正常生理條件下，ROS通常被控制在毒性水平以下;但是在鹽脅迫條件下，過量的ROS會使植物滲透應答能力逐漸喪失，萎蔫甚至壞死［33］。所以維持活性氧產(chǎn)生和清除之間的平衡，對于植物生長和代謝以及對環(huán)境脅迫耐性至關(guān)重要。本研究將來源于野生大豆的GsGST13基因?qū)胲俎?，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因苜蓿在鹽脅迫下的鹽害程度顯著低于野生型。同時超量表達的轉(zhuǎn)基因苜蓿在鹽脅迫下，GST活性，SOD活性顯著高于野生型，并且過氧化氫含量顯著低于野生型植株，表明轉(zhuǎn)GsGST13基因增強了轉(zhuǎn)基因苜蓿株系的活性氧清除能力，從而降低了鹽脅迫對植物產(chǎn)生的氧化損傷。另外轉(zhuǎn)基因株系的丙二醛含量也顯著低于野生型，可見GsGST13的超量表達降低了鹽脅迫對轉(zhuǎn)基因苜蓿膜脂的傷害，使轉(zhuǎn)基因株系細胞膜保持較好的生理活性。以上表明，超量表達的轉(zhuǎn)基因苜蓿是通過降低鹽脅迫導致的膜脂氧化傷害和活性氧傷害，從而提高了轉(zhuǎn)基因苜蓿的抗氧化能力和鹽脅迫下的耐性。

對于苜蓿來說，提高甲硫氨酸含量是刻不容緩的重要問題。1988年Saalbach等［34］首次通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高了蛋氨酸含量之后，已經(jīng)開展了很多關(guān)于提高植物含硫氨基酸含量的研究。如李雷等［35］將玉米(Zea mays)10 ku醇溶蛋白基因?qū)腭R鈴薯(Solanum tuberosum)塊莖中提高了含硫氨基酸的含量。呂德?lián)P等［16］將高含硫氨酸蛋白基因轉(zhuǎn)入苜蓿，使苜蓿中含硫氨基酸含量提高13%～20%。本研究中選用的SCMRP基因是將玉米醇溶蛋白基因經(jīng)過生物信息學方法設計并合成的適合豆科植物表達的基因。結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因苜蓿的含硫氨基酸分別比野生型苜蓿提高了0．57%和0．52%?？梢姵勘磉_該基因可以有效地提高苜蓿的含硫氨基酸含量。

本研究通過在苜蓿中超量表達GsGST13和SCMRP基因，明顯提高了轉(zhuǎn)基因苜蓿的耐鹽性和含硫氨基酸含量。

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