劉星星， 范 恒， 唐 慶， 壽折星， 左冬梅

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，武漢430022

趨化因子受體4（chemokine receptor 4，CXCR4）是基質(zhì)細(xì)胞衍生因子（stromal cell derivedfactor－1，SDF－1）的特異性受體，兩者具有高度的親和力。CXCR4基因定位于人染色體2q21，分子結(jié)構(gòu)上是高度保守的G蛋白偶聯(lián)的第7跨膜區(qū)受體。SDF－1／CXCR4生物軸在細(xì)胞間信息傳遞以及干細(xì)胞（stem cells，SC）遷移中扮演著重要角色。研究表明損傷組織部位的SDF－1表達(dá)升高，表達(dá)CXCR4的干細(xì)胞能夠沿著SDF－1的濃度梯度遷移實(shí)現(xiàn)歸巢過(guò)程［1］，但同時(shí)也有多項(xiàng)研究顯示人及鼠類間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSC）表面幾乎都不表達(dá)CXCR4［2－3］。如果能有效地提高細(xì)胞膜表面的CXCR4表達(dá)，就能有效地提高細(xì)胞的遷移效率，參與組織修復(fù)和重建。本研究中我們利用基因工程技術(shù)構(gòu)建過(guò)表達(dá)CXCR4基因的慢病毒載體，并進(jìn)行體外轉(zhuǎn)染以檢測(cè)其準(zhǔn)確性，以期為進(jìn)一步研究SDF－1／CXCR4軸的生物學(xué)功能提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 材料

Primer、250bp DNA ladder Marker購(gòu)于捷瑞生物公司；GV208載體、pHelper 1．0載體、pHelper 2．0載體、293T細(xì)胞、大腸埃希菌菌株DH5α購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司；In－FusionTMPCR克隆試劑盒購(gòu)于美國(guó)Clontech公司；質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自Promega公司；限制性內(nèi)切酶購(gòu)自新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室公司；1kb DNA梯狀標(biāo)志購(gòu)于Fermentas公司；預(yù)染蛋白標(biāo)記物購(gòu)于中晶公司；瓊脂糖購(gòu)于賽百盛公司；Taq聚合酶購(gòu)于欣百諾公司；脫氧核苷三磷酸（dNTP）購(gòu)于美國(guó)普洛麥格公司；錐蟲藍(lán)購(gòu)于上海捷倍思基因技術(shù)有限公司；胎牛血清、細(xì)胞培養(yǎng)液（DMEM）購(gòu)于Gibco公司；胰酶購(gòu)于上?；瘜W(xué)試劑公司；Lipofectamine 2000購(gòu)于美國(guó)英杰公司；脫氧胸苷酸（Oligo dT）購(gòu)自上海生物工程公司；第3代大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合研究所贈(zèng)送。

1．2 方法

1．2．2 CXCR4－GV208質(zhì)粒構(gòu)建 用載體構(gòu)建試劑盒In－FusionTMPCR克隆試劑盒進(jìn)行克隆重組，將擴(kuò)增的CXCR4的基因片段插入到慢病毒載體GV208（元件順序?yàn)?Ubi－MCS－EGFP；含增強(qiáng)型綠色熒光標(biāo)記；克隆位點(diǎn)為AgeⅠ）中。

1．2．3 聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增CXCR4基因片段 取正義鏈引物（10μmol／L）0．4μL，反義鏈引物（10 μmol／L）0．4μL，5×Taq緩沖液4μL，ddH2O 12．4 μL，dNTPs（2．5mmol／L）1．6μL，模板（10ng／μL）1μL，Taq聚合酶0．2μL，混勻，94℃，5min，然后反復(fù)94℃30s，55℃30s，72℃2min循環(huán)30次，72℃10min后取出冷卻至室溫，獲得CXCR4基因片段。

1．2．4 酶切消化GV208載體 取純化的GV208質(zhì)粒（1μg／μL）2μL，AgeⅠ 酶（5U／μL）1μL，10×緩沖液5μL，ddH2O 42μL，將上述液體緩慢混合后置于37℃，2h，獲得線性化的GV208載體。

1．2．5 擴(kuò)增的CXCR4基因片段交換入線性化GV208表達(dá)載體 設(shè)計(jì)分組為：GAPDH組，對(duì)照組以及 CXCR4組。反應(yīng)體系為：ddH2O（13．5、16．5、13．5μmol），10×In－Fusion交換酶緩沖液（每組 各 2 μmol），In－Fusion 交 換 酶 （每 組 各 0．5 μmol），線性化GV208載體DNA（每組各1μmol），純化后CXCR4基因片段（3、0、3μmol）。反應(yīng)條件：混合后25℃，30min，然后42℃，15min。

1．2．6 陽(yáng)性克隆的PCR鑒定 PCR鑒定引物為CXCR4－P3（5′－CTGACTATCCCTGACATCATC－3′）；EGFP－N－R （5′－CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG－3′），PCR方法同1．2．3。陽(yáng)性對(duì)照為 GAPDH內(nèi)參基因，鑒定出陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，接種后37℃培養(yǎng)16h并保存為甘油菌，分裝200μL送測(cè)序。

1．2．7 慢病毒包裝 將 DNA 混合液 （CXCR4－GV208 20μg，pHelper 1．0載體15μg，pHelper 2．0載體10μg）與 Opti－MEM 2．5mL 混勻，室溫 5 min，稀釋后的DNA與Lipofectamine 2000混勻，室溫20min，將混合液轉(zhuǎn)移至293T細(xì)胞培養(yǎng)液中，37℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)，8h后換液，20mL PBS洗滌，加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)液25mL，繼續(xù)培養(yǎng)48h，收集轉(zhuǎn)染后48h的293T細(xì)胞上清。4℃，4 000g離心10min，過(guò)濾上清于過(guò)濾器中，4 000g離心15min，收集病毒濃縮液于－80℃保存。

1．2．8 慢病毒滴度檢測(cè) 采用RT－qPCR法，抽提病毒感染的293T細(xì)胞的總RNA，總RNA的抽提根據(jù)美國(guó)英杰公司的試劑盒操作說(shuō)明書進(jìn)行。RNA逆轉(zhuǎn)錄獲cDNA根據(jù)美國(guó)普洛麥格公司的M－MLV操作說(shuō)明書進(jìn)行。GFP上游引物：5′－TGCTTCAGCCGCTACCC－3′，下 游 引 物 序 列：5′－AGTTCACCTTGATGCCGTTC－3′，Actin（NM ＿001101）上 游 引 物：5′－GTGGACATCCGCAAAGAC－3′，下游引物序列：5′－AAAGGGTGTAACGCAACTA－3′。RT－qPCR 檢測(cè)在日本寶生物公司（TaKaRa）的TP800上完成。通過(guò)比較對(duì)照組和樣品組的Ct值差異判斷滴度值，通常認(rèn)為Ct值相差2以上存在顯著差異。

1．2．9 慢病毒轉(zhuǎn)染MSC細(xì)胞 將3代MSC進(jìn)行胰酶消化，制成細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液（細(xì)胞數(shù)約為4×105）接種于24孔培養(yǎng)板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)到約80%，根據(jù)美國(guó)英杰公司Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑使用說(shuō)明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。以20的感染指數(shù)（multiplicity of infection，MOI）轉(zhuǎn)染MSC，48h后觀察GFP基因的表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2．1 PCR擴(kuò)增CXCR4基因片段及鑒定陽(yáng)性克隆

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，基因片段的大小為1 138bp，與預(yù)期一致（圖1）。將擴(kuò)增的目的基因CXCR4交換入線性化GV208載體后，進(jìn)行PCR鑒定（圖2），結(jié)果表明，陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子PCR產(chǎn)物大小約為680bp，與預(yù)期相符。

2．2 陽(yáng)性克隆測(cè)序結(jié)果

將構(gòu)建的重組載體陽(yáng)性克隆送美國(guó)英杰公司進(jìn)行DNA測(cè)序分析。與GenBank上的CXCR4基因標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行分析比對(duì)顯示：Identities＝1 047／1 047（100%），Gaps＝0／1 047（0%），結(jié)果說(shuō)明：顯示含有與設(shè)計(jì)相同的靶序列，表明已正確構(gòu)建重組質(zhì)粒（圖3）。

圖1 CXCR4基因片段的PCR擴(kuò)增Fig．1 Amplification of the gene fragments of CXCR4by PCR

圖2 CXCR4重組載體的PCR鑒定Fig．2 Identification of the CXCR4recombinants by PCR

2．3 慢病毒滴度檢測(cè)

在本次滴度檢測(cè)中，10－4μL組和對(duì)照組樣品的Ct值存在2個(gè)左右差異（表1），所以認(rèn)為在10－4μL組樣品中存在病毒顆粒。假定該組樣品含有至少1個(gè)病毒顆粒，則病毒的滴度為：1／（1．0×10－4）×20＝2．0×105TU／μL＝2．0×108TU／mL。

表1 不同劑量病毒感染后樣品組的Ct值及表達(dá)量分析Table 1 The Ct value of samples after transfection with lentiviruses at different concentrations and the analysis of expression quantity

2．4 慢病毒轉(zhuǎn)染MSC效率

慢病毒轉(zhuǎn)染MSC 48h后，熒光顯微鏡下可觀察到細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞膜表面都有明顯的綠色熒光表達(dá)，表明慢病毒成功轉(zhuǎn)染MSC并使其成功表達(dá)出CXCR4－GFP融合蛋白（圖4）。

3 討論

干細(xì)胞是一類具有自我復(fù)制能力的多潛能細(xì)胞，在一定條件下，它可以分化成多種功能細(xì)胞。MSC是一種存在于骨髓中的非造血干細(xì)胞，易于體外培養(yǎng)擴(kuò)增，并在培養(yǎng)過(guò)程中保持多分化潛能，其具有遺傳背景穩(wěn)定，體內(nèi)植入排斥反應(yīng)較弱等特點(diǎn)，所以被認(rèn)為是一種用于組織工程和細(xì)胞治療的理想細(xì)胞［4］。MSC移植作為一種新的治療方法能治療炎癥介導(dǎo)的多種疾 ?。?－6］。有研 究證實(shí)，靜脈注射MSC能夠顯著減緩炎癥性腸病的癥狀，抑制炎癥因子分泌，提高IL－10的表達(dá)，同時(shí)抑制Th1細(xì)胞活性［7］。雖然MSC在再生醫(yī)學(xué)中具有很大的應(yīng)用潛力，但是也有大量研究表明系統(tǒng)釋放的MSC到達(dá)受損組織的效率是非常低下的，循環(huán)中的MSC大部分停留于肺血管床［8］。

慢病毒載體是以人類免疫缺陷型病毒為基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)的基因治療載體，通過(guò)自身RNA為模板在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成雙鏈DNA，并通過(guò)整合酶作用將目的基因整合到宿主染色體上。慢病毒對(duì)分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有感染能力，同時(shí)不受細(xì)胞分裂影響，其可以在體內(nèi)較長(zhǎng)期地表達(dá)且安全性高，因此在基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究中具有廣闊的應(yīng)用前景［9］。本研究中的慢病毒載體系統(tǒng)由GV208載體、pHelper 1．0載體、pHelper 2．0載體組成。GV208慢病毒載體中含有HIV的基本元件5′LTR和3′LTR及其他的輔助元件，可根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?duì)GV208載體進(jìn)行改造并用于基因功能研究。pHelper 1．0載體中含有g(shù)ag基因、pol基因和rev基因，分別負(fù)責(zé)編碼病毒主要的結(jié)構(gòu)蛋白、編碼病毒特異性的酶和編碼調(diào)節(jié)gag和pol基因表達(dá)的調(diào)節(jié)因子。pHelper2．0載體中含有VSV－G基因（來(lái)源于單純皰疹病毒），提供病毒包裝所需要的包膜蛋白［10］。上述載體均為假型病毒，病毒感染目的細(xì)胞后不再具有感染能力，也不會(huì)在宿主細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生新的病毒顆粒［11］。因此該慢病毒系統(tǒng)具有較好的安全性、靶向性。該慢病毒技術(shù)已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于多領(lǐng)域研究［12－13］。

圖3 克隆序列與CXCR4基因標(biāo)準(zhǔn)序列比對(duì)（部分）Fig．3 Contrast of the gene sequence alignment between the cloning sequence and the standard of CXCR4（Only apart is presented）

圖4 攜帶CXCR4／GFP慢病毒轉(zhuǎn)染MSCFig．4 Transfection of LentivirusCXCR4／GFPinto MSC

SDF－1α是趨化因子亞家族成員之一，它在藥物的趨化作用、干細(xì)胞歸巢以及腫瘤轉(zhuǎn)移中扮演著重要作用［14］。依靠其局部高濃度，SDF－1能招募循環(huán)中的白細(xì)胞到達(dá)炎癥或受損組織，從而發(fā)揮治療目的［15］。CXCR4屬于G蛋白偶聯(lián)的7次跨膜的趨化因子受體，在體內(nèi)許多細(xì)胞，尤其在造血干／祖細(xì)胞的表面均有CXCR4的構(gòu)成性表達(dá)。目前認(rèn)為SDF－1α是CXCR4的唯一生理配體，CXCR4也是SDF－1的唯一受體，兩者的親和力很高［16］。有研究顯示SDF－1能特異地對(duì)CXCR4產(chǎn)生趨化作用，表達(dá)CXCR4的干細(xì)胞能夠沿著SDF－1α的濃度梯度遷移實(shí)現(xiàn)歸巢過(guò)程［17］。Masafumi等［18］證實(shí)在心肌梗死部位的SDF－1表達(dá)升高，并能夠有效地吸引表達(dá)CXCR4的骨髓來(lái)源細(xì)胞（包括內(nèi)皮祖細(xì)胞）到達(dá)梗死部位促進(jìn)血管生成。大量研究表明雖然MSC低表達(dá)CXCR4，其也能通過(guò)SDF－1／CXCR4軸，有效地遷移至受損的骨髓或心肌，提高M(jìn)SC膜表面的CXCR4表達(dá)將成為改善MSC遷移的一個(gè)重要途徑［19－20］。由此可見(jiàn)提高CXCR4的表達(dá)是基礎(chǔ)及臨床研究的迫切需要。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)重組慢病毒技術(shù)成功構(gòu)建了過(guò)表達(dá)CXCR4基因的慢病毒載體并成功感染MSC。同時(shí)該慢病毒載體技術(shù)能夠共表達(dá)增強(qiáng)型GFP，GFP能夠用來(lái)有效示蹤MSC在活體內(nèi)的遷移［21－23］。有研究者成功地應(yīng)用慢病毒技術(shù)使目的細(xì)胞過(guò)表達(dá)CXCR4來(lái)治療各種疾病［24－25］。

目前應(yīng)用該慢病毒系統(tǒng)構(gòu)建過(guò)表達(dá)CXCR4的研究尚未見(jiàn)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了重組CXCR4－GV208慢病毒載體，為進(jìn)一步研究CXCR4的生物學(xué)功能提供新的途徑，為進(jìn)一步促進(jìn)MSC遷移和歸巢等研究打下良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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