方 鑫， 李小兵， 周美鴻， 彭毓棻

南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，南昌330006

帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）是一種常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，以中腦黑質(zhì)多巴胺（dopamine，DA）能神經(jīng)元變性為特征，其確切病因目前仍不完全清楚［1］。目前認(rèn)為神經(jīng)炎癥參與帕金森病的病理進(jìn)程［2］。近來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)帕金森病可能從腸道起病，其病理生理過(guò)程與腸道系統(tǒng)關(guān)系密切［3－4］。Toll樣受體4（TLR4）是細(xì)菌內(nèi)毒素脂多糖（LPS）的受體，已經(jīng)有研究顯示TLR4在1－甲基－4－苯基－1，2，3，6－四氫吡啶（MPTP）帕金森病小鼠模型腦內(nèi)表達(dá)增加［5］。在帕金森病患者，LPS結(jié)合蛋白（LBP，是反映LPS暴露的指標(biāo)）增高［6］，眾所周知，LPS與TLR4相互作用參與某些胃腸疾病的腸道炎性過(guò)程［7］，而TLR4在帕金森病腸道的表達(dá)尚無(wú)相關(guān)報(bào)道，本研究初步探討MPTP帕金森病小鼠模型十二指腸和遠(yuǎn)端結(jié)腸TLR4表達(dá)的變化。

(2)實(shí)驗(yàn)二。在原水溫儀探頭附近上下分別再放置兩個(gè)新的水位儀探頭，進(jìn)行同期不同層觀測(cè)數(shù)據(jù)對(duì)比分析，水溫探頭放置情況如圖3。比測(cè)過(guò)程中在185 m(命名：比1溫)、201 m(命名：原溫)的兩個(gè)探頭間歇出現(xiàn)突降，然后緩慢恢復(fù)的現(xiàn)象(圖4)，而216 m(命名：比2溫)探頭未記錄到這種變化。每次變化在0.01～0.1 ℃，185 m和201 m幅度基本一致，時(shí)間同步性較好。

1 材料與方法

1．1 主要儀器和試劑

電泳系統(tǒng)（美國(guó)Bio－Rad公司）；Leica石蠟切片機(jī)；MPTP（Sigma－Aldrich公司）；一抗 TLR4（Santa Cruz公司，sc－30002）；免疫組化試劑盒（福州邁新公司）。

1．2 動(dòng)物模型的構(gòu)建和實(shí)驗(yàn)分組

8～10周齡雄性C57／BL6小鼠（購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司），帕金森病小鼠造模（MPTP，腹腔注射，20mg／kg，每隔2h1次，共3次，總劑量為60mg／kg），對(duì)照組注射等量的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）。MPTP劑量和造模方法具體參照文獻(xiàn)［8］。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為4組：PBS對(duì)照3d組、PBS對(duì)照7d組、MPTP模型3d組、MPTP模型7d組，每組8只小鼠。所有小鼠在PBS或MPTP末次處理后第3天或第7天處死，取出十二指腸和遠(yuǎn)端結(jié)腸組織。

養(yǎng)殖生產(chǎn)實(shí)踐證明，青蝦與小龍蝦混養(yǎng)是可行的。在飼養(yǎng)期間要注意以下的問(wèn)題：①要合理控制青蝦與小龍蝦的放養(yǎng)密度，密度過(guò)大時(shí)小龍蝦可能攝食青蝦，青蝦也可以攝食小龍蝦。②混養(yǎng)池塘水體的溶解氧應(yīng)當(dāng)保持在5.0mg/L以上，最低也不能低于3.0mg/L。③要保證充足的飼料供應(yīng)，以防青蝦與小龍蝦之間，或青蝦內(nèi)部間，或小龍蝦內(nèi)部間相互殘殺。④青蝦與小龍蝦一旦達(dá)到商品規(guī)格，即捕撈出售。

1．3 Western blot檢測(cè)TLR4

東營(yíng)市地處黃河尾閭渤海之濱，那一望無(wú)際的荒灘野涂，常讓人疑心它與古老文明無(wú)緣。其實(shí)，早在6 000年以前，東營(yíng)市就出現(xiàn)了人類(lèi)聚落遺址。目前東營(yíng)市共發(fā)現(xiàn)新石器時(shí)代古文化遺址17處，其中傅家遺址和五村遺址內(nèi)涵豐富，出土文物特點(diǎn)突出，是魯北地區(qū)最具代表性的大汶口文化遺址。

1．4 免疫組化檢測(cè)TLR4

采用鹽酸(1+1)溶解鋁土礦試樣，分別用氨水和碳酸銨沉淀法消除鋁、鐵和鈣的干擾，過(guò)濾，在酸性溶液中，加入鉻酸鋇懸濁液與硫酸根生成硫酸鋇沉淀和鉻酸根離子(式1)，用氨水調(diào)節(jié)pH值至9～10，過(guò)濾除去多余的鉻酸鋇和生成的硫酸鋇，濾液即為被硫酸根所置換出的鉻酸根溶液，通過(guò)鉻酸根的吸光度值間接計(jì)算出硫酸根的含量。

裂解液與組織混合、勻漿、裂解，蛋白樣本用BCA法定量（碧云天公司），混合用5×上樣緩沖液，煮蛋白5min后放置－80℃保存?zhèn)溆谩?2%SDS凝膠電泳并且NC膜轉(zhuǎn)膜。用5%牛奶封閉1h，TLR4一抗（1∶300，Santa Cruz公司，sc－30002），βactin（1∶1 000，Santa Cruz公司，sc－47778），4℃孵育過(guò)夜。次日TBST洗膜，孵育二抗（Goat Anti Rabbit IgG／HRP，1∶5 000），TBST洗膜。用ECL顯影，掃描X線片，進(jìn)行灰度分析。

標(biāo)本處理：組織按常規(guī)進(jìn)行免疫組化檢測(cè)前處理（固定、包埋和切片，切片厚3μm），切片常規(guī)脫蠟，梯度乙醇水洗，石蠟切片組織抗原修復(fù)，兔來(lái)源的多克隆抗TLR4一抗，稀釋度1∶200（Santa Cruz公司，sc－30002）。采用邁新公司免疫組化試劑盒行免疫組化檢測(cè)。按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行免疫組化染色。DAB顯色，蘇木精復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，光鏡下觀察。TLR4陽(yáng)性染色為黃色或棕黃色。

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

與PBS對(duì)照3d組和7d組相比，MPTP處理后7d組遠(yuǎn)端結(jié)腸TLR4蛋白表達(dá)顯著增加（均P＜0．05），見(jiàn)圖3。在PBS對(duì)照組小鼠，遠(yuǎn)端結(jié)腸TLR4蛋白表達(dá)低，在MPTP造模后增加。遠(yuǎn)端結(jié)腸TLR4免疫組化檢測(cè)見(jiàn)圖4。

2 結(jié)果

2．1 十二指腸TLR4表達(dá)

與PBS對(duì)照3d組以及PBS對(duì)照7d組相比，在MPTP帕金森病小鼠7d組，十二指腸TLR4蛋白表達(dá)顯著增加（均P＜0．05），見(jiàn)圖1。免疫印跡法可見(jiàn)在PBS正常對(duì)照組小鼠，十二指腸TLR4低表達(dá)，在MPTP造模后表達(dá)明顯上升。十二指腸TLR4免疫組化檢測(cè)見(jiàn)圖2。

圖1 免疫印跡法檢測(cè)十二指腸TLR4表達(dá)Fig．1 Western blot analysis of the expression of TLR4in the duodenum

圖2 免疫組化檢測(cè)十二指腸TLR4表達(dá)（×400）Fig．2 TLR4expression in the duodenum detected by immunohistochemistry（×400）

2．2 遠(yuǎn)端結(jié)腸TLR4表達(dá)

圖3 免疫印跡法檢測(cè)遠(yuǎn)端結(jié)腸TLR4表達(dá)Fig．3 Western blot analysis of the expression of TLR4in the distal colon

圖4 免疫組化檢測(cè)遠(yuǎn)端結(jié)腸TLR4表達(dá)（×400）Fig．4 TLR4expression in the distal colon detected by immunohistochemistry（×400）

3 討論

帕金森病最主要的病理改變是中腦黑質(zhì)DA能神經(jīng)元的變性死亡，由此而引起紋狀體DA含量顯著減少而致病，導(dǎo)致這一病理改變的確切病因目前仍不清楚，遺傳因素、環(huán)境因素、年齡老化、氧化應(yīng)激等均可能參與帕金森病DA能神經(jīng)元的變性死亡過(guò)程［1］。MPTP帕金森病小鼠亦存在腸道DA能神經(jīng)元丟失，近來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)帕金森病可能從腸道起病，帕金森病的病理生理過(guò)程與腸道關(guān)系密切［3－4］。

Toll樣受體參與非特異性免疫，是連接非特異性免疫和特異性免疫的橋梁，Toll樣受體可以識(shí)別來(lái)源于微生物的具有保守結(jié)構(gòu)的分子，當(dāng)微生物突破機(jī)體的物理屏障，如皮膚、黏膜等時(shí)，Toll樣受體可以識(shí)別它們并激活機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。細(xì)菌內(nèi)毒素LPS是革蘭陰性菌的產(chǎn)物，LPS受體復(fù)合物包括TLR4，而人體和動(dòng)物腸道均存在大量的革蘭陰性菌，存在 LPS的潛在來(lái)源。Noelker等［9－10］進(jìn)一步研究證實(shí)TLR4途徑參與DA能神經(jīng)元丟失，推動(dòng)了帕金森病發(fā)病和病理進(jìn)程。眾所周知，LPS與TLR4相互作用參與某些胃腸疾病的腸道炎性過(guò)程發(fā)病機(jī)制［7］，TLR4途徑激活后可啟動(dòng)下游炎性反應(yīng)過(guò)程，在病理?xiàng)l件下，腸道炎性環(huán)境可以促進(jìn)細(xì)菌內(nèi)毒素LPS吸收進(jìn)入血液。但是帕金森病大腦中LPS的來(lái)源一直令人困惑，在其它的腸道炎性疾病中，LPS主要來(lái)源于腸道。血液循環(huán)中的LPS可以到達(dá)腦內(nèi)，從而啟動(dòng)腦內(nèi)的TLR4途徑，從而誘發(fā)典型的帕金森病DA能神經(jīng)元丟失。TLR4在帕金森病腸道的表達(dá)尚無(wú)相關(guān)報(bào)道，在本實(shí)驗(yàn)中我們研究帕金森病MPTP小鼠模型十二指腸和遠(yuǎn)端結(jié)腸TLR4蛋白表達(dá)水平的改變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在MPTP處理后7d組TLR4蛋白表達(dá)水平增加。這說(shuō)明腸道TLR4途徑有可能參與帕金森病腸道炎性反應(yīng)過(guò)程，促進(jìn)腸道LPS吸收進(jìn)入血液系統(tǒng)，進(jìn)而誘發(fā)腦內(nèi)的炎癥反應(yīng)。

MPTP帕金森病小鼠存在腸道DA能神經(jīng)元丟失［8］，這與帕金森病腦內(nèi)DA能神經(jīng)元丟失的情況類(lèi)似。也可能存在這樣一種可能性：與腦內(nèi)TLR4途徑參與DA能神經(jīng)元丟失一樣，腸道TLR4上調(diào)參與腸道DA能神經(jīng)元丟失。這種推測(cè)可在下一步的實(shí)驗(yàn)中研究證實(shí)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果未見(jiàn)國(guó)內(nèi)外相關(guān)報(bào)道，但我們僅僅初步描述了TLR4在帕金森病模型腸道的變化，未涉及到TLR4下游的具體作用機(jī)制，亦未探討TLR4在更長(zhǎng)時(shí)程的變化規(guī)律。另外，在其它的帕金森病動(dòng)物模型（如6－羥基多巴胺大鼠模型、魚(yú)藤酮大鼠模型以及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型等）腸道TLR4有無(wú)類(lèi)似變化尚無(wú)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究提供了帕金森病模型TLR4腸道表達(dá)的新信息，為下一步的相關(guān)研究提供了一定依據(jù)。

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