羅 倩，黎繼烈，王 衛(wèi)，郭 璐，朱曉媛

（中南林業(yè)科技大學 生命科學與技術(shù)學院， 湖南 長沙 410004）

重組畢赤酵母發(fā)酵產(chǎn)PGA的條件優(yōu)化

羅 倩，黎繼烈，王 衛(wèi)，郭 璐，朱曉媛

（中南林業(yè)科技大學 生命科學與技術(shù)學院， 湖南 長沙 410004）

對重組畢赤酵母發(fā)酵產(chǎn)青霉素G?；?PGA)的培養(yǎng)條件進行探討。依據(jù)基礎鹽搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基，通過單因素試驗考察了接種量、甘油濃度、pH以及誘導過程中氨水濃度、甲醇濃度等因素對PGA表達的影響。并采用Box-Behnken實驗設計進行因素組合優(yōu)化。結(jié)果與意義：最佳發(fā)酵條件為：甘油濃度40 g/L、氨水濃度0.1%、甲醇濃度1.0%、pH 5.6、接種量10%，在此條件下PGA酶活力達到8 680±12 U/L。本實驗結(jié)果對下一步利用發(fā)酵罐進行重組畢赤酵母擴大培養(yǎng)有借鑒作用。

畢赤酵母；青霉素G酰化酶；培養(yǎng)條件優(yōu)化；Box-Behnken實驗設計

青霉素G?；? Penicillin G Acylase，EC 3. 5. 1.11，簡稱PGA)是用于抗生素中間體6-氨基頭孢烷酸(6-APA)和7-氨基脫乙酰頭孢烷酸(7-ADCA)生產(chǎn)的重要酶制劑，目前已經(jīng)在工業(yè)中得到了廣泛的應用[1-2]。許多微生物均可以產(chǎn)生青霉素?；?，這包括細菌、放線菌、真菌、酵母等[3-4]。近年來，青霉素?；傅陌l(fā)展主要是在以下2個方面：一是運用基因工程和蛋白質(zhì)工程的方法尋找該酶的高產(chǎn)菌株和性能優(yōu)良菌株；二是探索新的高效的固定化方法，提高酶固定化效率和使用穩(wěn)定性，改善酶的應用特性。

巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)有著近年發(fā)展起來的一種高效表達外源蛋白的真核系統(tǒng)，其有諸多優(yōu)點[5-6]：外源基因穩(wěn)定、目的蛋白表達量高、分泌效率高、并具有甲醇精確調(diào)控的醇氧化酶啟動子PAOX及日臻成熟的高密度發(fā)酵工藝。如今已用這個系統(tǒng)成功的表達了200種以上蛋白，包括病毒的、細菌的、真菌的、動植物和某些人體蛋白[7]。到目前為止，文獻中有關(guān)畢赤酵母產(chǎn)胞內(nèi)PGA的報道較少，筆者采用Box-Behnken實驗設計對重組巴斯德畢赤酵母的發(fā)酵條件進行了研究，以期得到高產(chǎn)PGA的發(fā)酵條件，從而為PGA工業(yè)應用提供實驗基礎[8]。

1 材料與方法

1.1 菌 株

畢氏酵母工程細胞株，由中南林業(yè)科技大學發(fā)酵工程實驗室保存。

1.2 培養(yǎng)基

YPD液體培養(yǎng)基，BSM基礎鹽培養(yǎng)基，以及PTM1配方均采用Invitrogen公司提供的標準配方。BSM需高壓滅菌后再加4.0 mL/L過濾除菌的PTM1[9]。

1.3 培養(yǎng)方法

1.3.1 種子擴大搖瓶培養(yǎng)

50 mL種子培養(yǎng)基裝入250 mL三角瓶中，滅菌冷卻后，于無菌狀態(tài)下吸取0.5～1.0 mL甘油管菌液，于30 ℃，220 r/min下，培養(yǎng)40 h。

1.3.2 畢赤酵母搖瓶發(fā)酵

將培養(yǎng)好的種子液以10%接種量接種到預裝80 mL BSM基礎鹽生長培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，溫度30℃，轉(zhuǎn)速220 r/min下培養(yǎng)，每隔24 h補加甲醇至終濃度1%，每隔12 h補加28%氨水至終濃度0.1%，維持培養(yǎng)基中pH值5.5左右，同時亦可補加氮源，培養(yǎng)120 h后，發(fā)酵結(jié)束。同一水平3組重復實驗，以進行統(tǒng)計分析。

1.4 酶活測定方法

酶活測定采用堿滴定法[10]。

1.5 中心組合實驗

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，確定中心組合實驗的因素與水平，進行Box-Behnken實驗設計和試驗結(jié)果分析，最終確定重組畢赤酵母發(fā)酵產(chǎn)PGA培養(yǎng)的最佳條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果與分析

2.1.1 甘油濃度對PGA表達水平的影響

在其它發(fā)酵基礎培養(yǎng)基成分不變的情況下，甘油按 30、35、40、45、50 g/L比例加入，誘導培養(yǎng)96 h后，測PGA活力。從圖1中可以看出，當甘油質(zhì)量濃度增高時，菌體產(chǎn)PGA表達水平也隨之升高，但當甘油濃度大于40 g/L時，PGA表達水平卻隨甘油濃度升高而減少，說明甘油濃度過低或過高會限制或抑制菌體表達PGA。而甘油濃度為40 g/L時重組畢赤酵母PGA表達水平最高，達到8 319 U/L。

圖1 甘油濃度對PGA表達水平的影響Fig.1 Effects of glycerol concentration on PGA activity

2.1.2 氨水濃度對PGA表達水平的影響

補料用的28%氨水預先經(jīng)過濾除菌，氨水加入量按體積百分比計算分別為0.06%、0.08%、0.1%、0.12%、0.14%，每隔12 h補加1次。誘導培養(yǎng)96 h后，測PGA活力。從圖2中可以看出，隨著氨水體積分數(shù)增高，PGA酶活也隨之升高；當氨水體積分數(shù)等于0.1% 時，PGA酶活達到8 296 U/L；而當氨水體積分數(shù)大于0.1% 時，PGA酶活卻隨之下降，說明過高的氨水體積分數(shù)不利于畢赤酵母的PGA表達，所以本實驗選取每12 h補加28%氨水至0.1%。

圖2 氨水濃度對PGA表達水平的影響Fig.2 Effects of ammonia water concentration on PGA activity

2.1.3 甲醇濃度對PGA表達水平的影響

以甲醇濃度分別為0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%的誘導培養(yǎng)基重懸菌體進行誘導培養(yǎng)，每24h補加甲醇維持以上濃度。誘導培養(yǎng)96 h[11]后，測PGA活力。甲醇濃度過低，會限制菌體生長和誘導強度；濃度過高，則對菌體產(chǎn)生毒性。從圖3中可以看出，最適甲醇濃度為1.0%，PGA表達水平達到8 448 U/L；濃度超過1.5% 時，甲醇對菌體PGA表達水平有抑制作用。

圖3 甲醇濃度對PGA表達水平的影響Fig.3 Effects of methanol concentration on PGA activity

2.1.4 pH對PGA表達水平的影響

配制不同pH值為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0的誘導培養(yǎng)基，誘導培養(yǎng)96 h后，測PGA活力。由于外界的pH值變化會改變菌體細胞內(nèi)的pH值，從而影響細菌的代謝反應，進而影響細胞的生物量和基因產(chǎn)物的表達[12]。從圖4中可以看出，最適pH值為5.5，此時的PGA表達水平達到8 402 U/L。

圖4 pH值對PGA表達水平的影響Fig.4 Effects of pH on PGA activity

2.1.5 接種量對PGA表達水平的影響

試驗不同的接種量對畢赤酵母表達PGA的影響，接種量大小的控制在很多細胞培養(yǎng)和代謝物積累中都發(fā)揮著重要作用[13]。分別以4%、6%、8%、10%、12%的接種量接種到BSM基礎鹽生長培養(yǎng)基中，結(jié)果如圖5所示，當接種量為10% 時，此時的PGA表達水平達到8 511 U/L。

圖5 接種量對PGA表達水平的影響Fig.5 Effects of inoculum on PGA activity

2.2 Box-Behnken 實驗結(jié)果與分析

在單因素實驗結(jié)果的基礎上，運用Box-Behnken實驗設計考察甲醇體積百分比（X1）、氨水體積百分比（X2）和培養(yǎng)基pH值（X3）這3個因素對響應值Y（PGA酶活力）的影響，各個因素的水平和實驗結(jié)果見表1和表2。

利用SAS.8.1軟件對表2中數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，二次多項回歸方程為：

Y=8692.33+31.62X1-61.563X2+182.50X3-284.00X1X2+136.75X1X3-73.25X2X3-1 105.67X12-778.17X22-1 123.42X32

表1 響應面實驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments

表2 響應面實驗設計和結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiments

2.2.1 二次回歸擬合及方差分析

對SAS軟件擬合所得方程進行分析，表3為對該擬合方程進行方差分析的結(jié)果，表4為回歸方程系數(shù)顯著性的檢驗結(jié)果。在回歸方程中，是通過F檢驗來判定各變量對響應值影響的顯著性的，當其概率P的值越小時，則相應變量的顯著程度就越高。表3中的模型P＜0.01，表明回歸模型極顯著，而其校正決定系數(shù)R2Adj=0.947 7，表明總變異中僅有5.23%是不能由該模型來進行解釋。相關(guān)系數(shù)R2= 0.981 3以及Lack of Fit值(0.101 8＞0.05)，表明該模型擬合程度良好，實驗誤差較小，回歸方程是能夠較好地描述各因素與響應值之間的真實關(guān)系。

從表4中可以看出，在實驗的水平范圍內(nèi)顯著(P＜0.05)的因素為交互項XX以及二次項X2、

121X2

2和X32。對這一現(xiàn)象的可能解釋是，畢赤酵母在以甲醇作為誘導物及碳源，合成PGA過程中，需通過呼吸作用產(chǎn)能及相應的還原力NADPH，此過程中釋放出來H+部分溶于培養(yǎng)基后pH偏酸；而PGA的合成過程中需要構(gòu)建酰胺鍵，隨著氨水的補料加入，環(huán)境pH會上升，故X1與X2兩因素交互作用明顯。試驗設計過程中，pH跨度為5.0～6.0以及發(fā)酵培養(yǎng)基中緩沖液系統(tǒng)的存在，此時培養(yǎng)基中由于細胞的新陳代謝甲醇快速消耗，而酶的合成相對緩慢，所表現(xiàn)出來的是pH與甲醇、氨水補料的相互作用相對較弱。去除非顯著性因素后，重組畢赤酵母產(chǎn)PGA發(fā)酵各因素的二次多項回歸方程式可簡略為：

Y=8 692.33-284.00X1X2-1 105.67X12-778.17X22-1 123.42X23

進一步優(yōu)化分析可知，回歸方程存在穩(wěn)定點，且穩(wěn)定點為極大值。對所得的回歸擬合方程進行偏導微分處理得到X1、X2和X3的最佳取值：X1＝0.026、X2＝ -0.048、X3＝ 0.085，即甲醇流加體積比為1.01%、氨水補加體積比為0.10%、培養(yǎng)基pH為5.64，在此條件下表達PGA，回歸方程預測的PGA活力為8 701.92 U/L。為實驗操作方便，取最優(yōu)條件為甲醇補加體積比1.0%、氨水補加體積比為0.10%、培養(yǎng)基pH值為5.6。

表 3 響應面實驗回歸方程方差分析?Table 3 Variance analysis of response surface regression

2.3 回歸模型實驗驗證

為檢驗響應面法所得結(jié)果的可靠性，以上述求得的最佳取值下進行重組畢赤酵母PGA表達水平的驗證實驗，經(jīng)5次平行實驗，實際測得PGA的平均活力為8 680±12 U/L，與理論預測值相比誤差為0.25%。范超等[8]采用Box-Behnken實驗設計和響應面分析方法，對重組巨大芽孢桿菌產(chǎn)青霉素G?；傅陌l(fā)酵條件進行優(yōu)化，由于重組巨大芽孢桿菌產(chǎn)胞外PGA，胞外酶在發(fā)酵過程中被分泌到發(fā)酵液中，便于酶活力的測定，該實驗的研究方向?qū)Ρ菊n題有一定的借鑒作用。此外，作為產(chǎn)胞內(nèi)PGA的畢赤酵母工程菌，在甘油消耗完后，需補料甲醇，此時細胞以甲醇為唯一碳源并誘導細胞代謝產(chǎn)酶，細胞進入誘導表達階段。在誘導表達階段，補料量的控制也至關(guān)重要，因為甲醇或氨水尤其甲醇的過量會嚴重毒害酵母細胞，從而會導致發(fā)酵失敗[14-16]。

表 4 回歸系數(shù)顯著性分析Table 4 Significant analysis of regression coefficients

3 結(jié) 論

通過單因素試驗、Box-Behnken實驗設計對重組畢赤酵母產(chǎn)PGA的發(fā)酵條件進行優(yōu)化，確定其最佳發(fā)酵條件為：甘油濃度40 g/L、氨水濃度0.1%、甲醇濃度1.0%、pH 5.6、接種量10%，在此條件下PGA酶活力達到8 680±12 U/L。本實驗結(jié)果對下一步利用發(fā)酵罐進行重組畢赤酵母擴大培養(yǎng)有借鑒作用，從而為PGA工業(yè)應用提供實驗基礎。

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Optimization of fermentation conditions for expression of PGA in recombinant Pichia pastoris

LUO Qian, LI Ji-lie, WANG Wei, GUO Lu, ZHU Xiao-yuan
(School of Life Science & Technology, Central South University of Forestry & Technology, Changsha 410004, Hunan, China)

The cultivation conditions for Penicillin G acylase (PGA) production by recombinant Pichia pastoris were studied. the inf l uences of inoculum, pH value, concentrations of glycerol, and methanol and ammonia water on the expression of PGA and the cell growth were investigated in shake fl asks with Fermentation Basal Salts Medium by single factor experiments. And the experiments with the Box-Behnken experimental design were conducted to optimize the fermentation conditions of PGA production of recombinant P.pastoris. The results and implications are as follows: the optimum fermentation conditions were obtained (glycerol concentration 40 g/L, ammonia water concentration 0.1%, methanol concentration 1.0%, pH 5.6, inoculum 10%). Under these conditions, the activity of PGA was (8 680±12) U/L. These results will be provide a reference base for the expansion cultivation of recombinant P. pastoris fermentation.

Pichia pastoris; Penicillin G acylation enzyme; cultural condition optimization; Box-Behnken experimental design

S718.8

A

1673-923X(2013)05-0101-04

2012-11-12

國家林業(yè)局948項目（2011-4-17）

羅 倩（1988-），女，湖南岳陽人，碩士研究生，研究方向為微生物育種、微生物轉(zhuǎn)化及過程調(diào)控；

E-mail：luoqian7747@126.com

黎繼烈（1959-），女，湖南岳陽人，教授，博士，博導，研究方向為食品加工；E-mail：lijilie@163.com

[本文編校：吳 毅]