郭 璐，黎繼烈，王 衛(wèi)，羅 倩，朱曉媛

（中南林業(yè)科技大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410004）

GL-7-ACA?；傅墓潭ɑに嚄l件優(yōu)化

郭 璐，黎繼烈，王 衛(wèi)，羅 倩，朱曉媛

（中南林業(yè)科技大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410004）

采用單因素和Box-Behnken實(shí)驗(yàn)對LX-1000EP樹脂固定化戊二酰-7-氨基頭孢烷酸酰化酶的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。首先通過單因素設(shè)計研究載體用量、緩沖液pH值、時間、溫度四個因素對固定化戊二酰-7-氨基頭孢烷酸?；富盍Φ挠绊?，在此基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計對LX-1000EP樹脂固定化戊二酰-7-氨基頭孢烷酸?；傅臈l件進(jìn)行優(yōu)化。載體用量、緩沖液pH值、時間、溫度對固定化戊二酰-7-氨基頭孢烷酸?；付加杏绊?，固定化最佳工藝條件為：載體用量3.3 g、pH值7.9、時間40 h、溫度25 ℃，在此條件下固定化酶活力達(dá)到(69.5±0.8) U/g，酶活回收率達(dá)到42.41%。將響應(yīng)面法應(yīng)用于固定化戊二酰-7-氨基頭孢烷酸酰化酶條件的優(yōu)化是可行的。

戊二酰-7-氨基頭孢烷酸酰化酶；LX-1000EP樹脂；固定化工藝；Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計

戊二酰-7-氨基頭孢烷酸?；福℅L-7-ACA acylase，GA）能水解戊二酰-7-氨基頭孢烷酸，產(chǎn)生半合成頭孢菌素類抗生素重要母核7-氨基頭孢烷酸(7-ACA)和戊二酸。通過兩步酶法批量生產(chǎn)7- ACA的工藝技術(shù)早已成功實(shí)現(xiàn)工業(yè)化，這條工藝路線中最關(guān)鍵的兩個酶是戊二酰-7-氨基頭孢烷酸?；?GL-7-ACA) acylase (EC 3.1.5.11 )以及D-氨基酸氧化酶（DAAO，EC 1.4.3.3）[1-2]。GA絕大多數(shù)來自于假單胞菌中，其中有文獻(xiàn)報道的假單胞菌類別有：sp130假單胞菌[3]假單胞菌SY-77[4]、GK16假單胞菌[5]等。當(dāng)然也有來源于諸如側(cè)孢芽孢桿菌[6]等其它種類的細(xì)菌。來自于不同細(xì)菌的GA，其催化性質(zhì)也表現(xiàn)各不相同，這主要體現(xiàn)在最優(yōu)的催化溫度以及pH值等方面。具有此活性的菌株一般通過土壤或污水篩選獲得[7-9]。游離戊二酰-7-氨基頭孢烷酸?；复嬖谌菀资Щ?、在除水以外的其它溶液中不溶解、穩(wěn)定性不好、反應(yīng)后酶不能夠回收再利用等弊端，使得其不可以在工業(yè)化生產(chǎn)中得到充分利用。在這種狀況趨勢下，固定化酶技術(shù)得以長足發(fā)展，酶的固定化是表示將酶固定或者限制在某一特定的固體載體上或是某一局部空間進(jìn)行其獨(dú)特的催化反應(yīng)，并且能夠回收和重復(fù)利用的技術(shù)，在催化反應(yīng)過程中以固相狀態(tài)作用于底物[10]。因此人們希望將戊二酰-7-氨基頭孢烷酸?；腹潭ǖ捷d體上來改善其使用性能。但是用于酶固定化的載體大多存在固定化酶活力低、重復(fù)利用率不高、消耗成本大等缺點(diǎn)。為了完善上述不足同時進(jìn)一步提升固定化戊二酰-7-氨基頭孢烷酸?；傅臒岱€(wěn)定性和pH值耐受性，本文采用國產(chǎn)LX-1000EP樹脂材料對戊二酰-7-氨基頭孢烷酸?；高M(jìn)行固定化，這種新的固定化材料價格低廉、吸附能力強(qiáng)，重復(fù)利用率高，可以大批量獲取。鑒于國產(chǎn) LX-1000EP樹脂的以上優(yōu)點(diǎn)，將其用于戊二酰-7-氨基頭孢烷酸?；傅墓潭ɑ榱双@得固定化戊二酰-7-氨基頭孢烷酸?；傅淖钸m當(dāng)?shù)墓に嚄l件，通過響應(yīng)面分析方法以及Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計實(shí)施工藝條件的改善，以期為戊二酰-7-氨基頭孢烷酸酰化酶的工業(yè)運(yùn)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

戊二酰-7-氨基頭孢烷酸酰化酶液：本實(shí)驗(yàn)室存儲的畢赤酵母通過發(fā)酵后，在4 ℃溫度下離心并收集發(fā)酵液，然后通過截留分子量超過10 000的中空纖維濾膜進(jìn)行濃縮，最后經(jīng)硫酸銨分級沉淀制備得來，純化后的戊二酰-7-氨基頭孢烷酸?；敢旱拿富顪y定為70.01 U/mL[11]。

氫氧化鈉、檸檬酸、95%乙醇、鹽酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉等都是分析純試劑。

實(shí)驗(yàn)儀器：HH-S 型水浴鍋，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；LX-1000EP樹脂，西安藍(lán)曉科技有限公司；恒溫?fù)u床, 上海智城公司； SHA-C恒溫振蕩器，江蘇常州儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酶活的定義

酶活通常被定義為：在37℃的溫度條件下，單位質(zhì)量的固定化GA或者單位體積的GA在單位時間段內(nèi)催化戊二酰-7-氨基頭孢烷酸水解產(chǎn)生1 μmoL的7-ACA所需的酶量定義為1個活力單位（U·L-1或 U·kg-1）。

1.2.2 測定酶活的方法

酶活采用堿滴定法進(jìn)行測定[12]。

1.2.3 固定化條件單因素實(shí)驗(yàn)

以每10 mL酶液為實(shí)驗(yàn)對象，選擇影響固定化活力的4個主要因素，固定化時間、緩沖液pH值、固定化溫度、載體投放量為單因素實(shí)驗(yàn)因子，分別測定不同因素、不同水平條件下固定化酶活、酶活回收率，通過單因素實(shí)驗(yàn)選擇Box-Behnken實(shí)驗(yàn)的水平范圍。

1.2.4 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)

依照單因素實(shí)驗(yàn)所得到的結(jié)果，確定響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的因素以及水平范圍，同時通過Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計以及響應(yīng)面分析，來確定GA固定化的最理想的工藝參數(shù)[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶固定化的條件與固定化酶活力的關(guān)系

2.1.1 溫度與固定化酶活力的關(guān)系

溫度變化對固定化酶活力產(chǎn)生的影響結(jié)果如圖1所展示，固定化酶的活力伴隨溫度的不斷升高而顯示出先增加后降低的趨勢，當(dāng)溫度為25℃的時候，酶活回收率以及固定化酶活力達(dá)到最高分別為35.27%和65.26 U/g 。溫度增加后載體對于蛋白質(zhì)的吸附量會適當(dāng)提高，不過一旦高于最適合溫度，酶蛋白活性中心的結(jié)構(gòu)就會發(fā)生改變，酶極易變性失活，這兩者的綜合影響結(jié)果就會導(dǎo)致酶活降低。

圖1 溫度與固定化酶活力的關(guān)系Fig.1 Effect of temperature on activity of immobilized enzyme

2.1.2 緩沖液pH值與固定化酶活力的關(guān)系

緩沖液的pH值對固定化酶活力產(chǎn)生的影響如圖2所展示，固定化酶的活力伴隨pH值的不斷增加而顯示出先增后減的趨勢，pH 值為8.0時固定化酶活力和酶活回收率分別達(dá)到最大為69.31 U/g和41.38%。pH值在達(dá)到一定數(shù)值后，繼續(xù)升高對固定化產(chǎn)生抑制作用。

2.1.3 載體用量與固定化酶活力的關(guān)系

圖2 緩沖液pH值與固定化酶活力的關(guān)系Fig.2 Effect of buffer pH value on activity of immobilized enzyme

圖3 載體用量與固定化酶活力的關(guān)系Fig.3 Effect of carrier on activity of immobilized enzyme

載體用量的多少對于固定化酶活力產(chǎn)生的影響結(jié)果如圖3所展示，固定化酶活力伴隨載體用量的遞增而呈現(xiàn)出先增后降的趨勢，在載體用量為3.0 g時，固定化酶活力和酶活回收率分別達(dá)到最大為63.39U/g和35.08%。酶活降低的緣故可能是因?yàn)檩d體的表面吸附了過多的酶，可能形成了一定的空間位阻，導(dǎo)致底物以及產(chǎn)物均不容易擴(kuò)散，因此而影響這種酶促反應(yīng)的順利進(jìn)行。

2.1.4 時間與固定化酶活力的關(guān)系

時間長短對于固定化酶活力產(chǎn)生的影響結(jié)果如圖4中所展示，固定化酶活力伴隨固定時間的增長而逐步增加，在40 h固定化酶活力達(dá)到最高為70.12 U/g，40 h后酶活呈現(xiàn)相對穩(wěn)定的狀態(tài)。引起這一現(xiàn)象的原因可能是因?yàn)閱挝毁|(zhì)量的載體在固定GA過程中需要花費(fèi)一定的時間，隨后一旦載體吸附的酶量達(dá)到完全飽和的時候就不會繼續(xù)吸附額外的酶，酶活也就會由此而保持相對穩(wěn)定。

2.2 Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)

2.2.1 Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)結(jié)果和分析

為深入優(yōu)化LX-1000EP樹脂固定化GL-7-ACA酰化酶的條件工藝參數(shù)，根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取水溫度（X1）、緩沖液pH值（X2）、載體用量（X3）作為試驗(yàn)因素，以固定化酶活為響應(yīng)值進(jìn)行Box-Behnken實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計以及實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1和表2。

圖4 時間與固定化酶活力的關(guān)系Fig.4 Effect of time on activity of immobilized enzyme

表1 Box-Behnken試因素及其水平Table 1 Factors and levels of variables tested in Box-Behnken experiment

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計及其結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiment

2.2.2 試驗(yàn)二次回歸擬合和試驗(yàn)方差分析

首先對SAS.8.1軟件擬合得到的方程進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)和方差分析，然后求解回歸方程從而獲得顯著因素的最恰當(dāng)取值[14]。分析此擬合方程的方差，結(jié)果如表3所示，回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果如表4所示?；貧w方程中各種變量對指標(biāo)(響應(yīng)值)影響的顯著性，通過F檢驗(yàn)來加以判定，隨著概率P的值越小，那么相應(yīng)變量的顯著程度也就越高。通過表3能夠看出，模型P＜0.05，這表示回歸模型非常顯著，失擬項(xiàng)P=0.050 7（P＞0.05），模型失擬度不顯著，其校正決定系數(shù)RAdj2=0.944 5，表示只有總變異的5.5%不能夠通過此模型進(jìn)行解釋。相關(guān)系數(shù)R2= 0.972 2，表明此模型的擬合程度比較好，實(shí)驗(yàn)誤差也比較小，此模型合適，回歸方程能夠真實(shí)地展現(xiàn)各種因素同響應(yīng)值之間的聯(lián)系。從表4中能夠觀察到，在實(shí)驗(yàn)的水平范圍內(nèi)顯著（P＜0.05）的因素為一次項(xiàng)X1、X2以及X3，交互項(xiàng)X2X3和二次項(xiàng)X12、X22、X32。

通過對軟件得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，創(chuàng)建二次響應(yīng)面的回歸模型，繼而尋找到最優(yōu)響應(yīng)因子水平，所獲得的分析結(jié)果如表3和表4所示。

各種因素經(jīng)過回歸擬合之后，解回歸方程得到：

Y=-3803.70+20.31X1+918.45X2-18.30X3+1.25X1X2-0.18X1X3+11.25X2X3-0.58X12-62.16X22-10.14X32。

式中，Y代表固定化酶活力，U/g、X1代表溫度℃、X2代表緩沖液pH值、X3代表載體用量g。

表3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)回歸方程方差分析?Table 3 Variance analysis of response surface regression test

表4 回歸系數(shù)顯著性分析?Table 4 Significant analysis of regression coefficients

2.2.3 載體用量等三因素間的相互影響

通過分析可以知道回歸方程存在穩(wěn)定點(diǎn)，而且穩(wěn)定點(diǎn)就是極大值。為了獲得最優(yōu)值X1、X2以及X3， 對回歸擬合方程求一階偏導(dǎo)數(shù)，一節(jié)偏導(dǎo)數(shù)分別針對各自的變量，并且令其等于0，獲得一個三元一次方程組，求解這個方程組能夠得到模型的極值點(diǎn)：X1＝0.074、X2＝-0.124、X3＝0.276，即溫度為25.37 ℃、緩沖液pH值取7.94、載體用量為3.28 g，固定化GA的酶活達(dá)到最大值69.52 U/g。為實(shí)驗(yàn)操作方便，取最優(yōu)條件為溫度25 ℃、緩沖液pH值7.9、載體用量3.3 g。

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為了驗(yàn)證通過響應(yīng)面法所獲取的結(jié)果是否可靠，在上面所述的通過響應(yīng)面分析方法得到的最優(yōu)取值下進(jìn)行戊二酰-7-氨基頭孢烷酸?；腹潭ɑ尿?yàn)證實(shí)驗(yàn)，經(jīng)5次平行實(shí)驗(yàn)，實(shí)際測得固定化戊二酰-7-氨基頭孢烷酸?；傅钠骄盍?9.1 U/g，跟理論預(yù)測值比較誤差是0.57%，酶活的回收率達(dá)42.35%，表明響應(yīng)面法優(yōu)化的結(jié)果適合于LX-1000EP樹脂固定化戊二酰-7-氨基頭孢烷酸?；腹に嚄l件，回歸模型真實(shí)、可靠。

3 結(jié) 論

通過單因素試驗(yàn)、Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計對LX-1000EP樹脂固定化GL-7-ACA?；傅臈l件進(jìn)行優(yōu)化，確定其最適固定條件為：載體用量3.3 g、pH值7.9、時間40 h、溫度25 ℃，在此條件下固定化酶活力達(dá)到(69.5±0.8) U/g，酶活回收率達(dá)42.41%。

通過響應(yīng)面法，用LX-1000EP這種較為廉價的國產(chǎn)樹脂對GL-7-ACA?；高M(jìn)行固定化工藝條件的優(yōu)化之后，生產(chǎn)出來的固定化GL-7-ACA?；妇哂幸韵聝?yōu)勢：酶活性比較強(qiáng)，熱穩(wěn)定性比較好，對pH以及溫度的適應(yīng)性更加廣泛。尤其是LX-1000EP能夠大批量且比較容易獲取，這一優(yōu)勢為今后實(shí)施大批量制備固定化的LX-1000EP奠定了非常好的基礎(chǔ)。

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Optimization of immobilization technology conditions for GL-7-ACA acylase

GUO Lu, LI Ji-lie, WANG Wei, LUO Qian, ZHU Xiao-yuan
(School of Life Science and Technology, Central South University of Forestry & Technology, Changsha, 410004, Hunan, China)

The immobilization technology conditions of GL-7-ACA acylase with LX-1000EP resin were optimized by using single factor analytical methodology and Box-Behnken experimental design. Firstly, the effects of carrier dosage, buffer solution pH，time and temperature on the vitality of GL-7-ACA acylase were investigated by adopting single factor design, based on which, the immobilization conditions were optimized by response surface methodology. The results show that the four factors all had effects on immobilized GL-7-ACA acylase activity, and the optimal immobilization conditions are as follows: 3.3 of the carrier dosage, pH 7.9, time 40 hours and temperature 25℃. Under these appropriate conditions above, the immobilized enzyme,s activity was 69.5±0.8U/g, the activity recovery was 42.41%. So it is feasible to optimize the immobilization conditions of GL-7-ACA acylase with LX-1000EP by using response surface methodology.

GL-7-ACA acylase；LX-1000EP resin；immobilization technology；Box-Behnken experimental design

S718.8

A

1673-923X(2013)05-0096-05

2012-12-19

國家林業(yè)局948項(xiàng)目（2011-4-17）

郭 璐（1987-），女，湖南婁底人，碩士研究生，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程；E-mail：guolu0227@163.com

黎繼烈（1959-），女，湖南岳陽人，教授，博士，博導(dǎo)，研究方向?yàn)槭称芳庸?；E-mail：lijilie@163.com

[本文編校：吳 毅]