于瀛龍，周姝婧，徐新建，朱翔杰，周冰峰

(福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)學(xué)院，福建福州350002)

遺傳多樣性是物種適應(yīng)環(huán)境變化的必備條件，是進(jìn)化的物質(zhì)基礎(chǔ)，反映了物種的進(jìn)化潛力［1］.遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)是種群遺傳學(xué)、進(jìn)化生物學(xué)和保育遺傳學(xué)等生命科學(xué)的重要內(nèi)容［1－3］.在我國(guó)中華蜜蜂遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)的研究中，云南［4］、福建［5－6］、海南［7］、重慶［8］、廣東［9］、華東［10］、東北［11］等地區(qū)中華蜜蜂的研究已開(kāi)展［12－13］.通過(guò)19群樣本的測(cè)定，在長(zhǎng)白山中華蜜蜂遺傳多樣性的研究中已發(fā)現(xiàn)了5種mtDNA單倍型種類［11，14－15］;嘗試用2群中華蜜蜂樣本的csd基因和用12群中華蜜蜂樣本的RAPD標(biāo)記，對(duì)長(zhǎng)白山中華蜜蜂的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行探索［16－18］.長(zhǎng)白山地區(qū)中華蜜蜂mtDNA標(biāo)記、微衛(wèi)星標(biāo)記的遺傳多樣性與遺傳結(jié)構(gòu)的分析還需深入研究.

長(zhǎng)白山是東北中華蜜蜂的主要分布區(qū)，是中華蜜蜂分布的東北部邊緣，具有獨(dú)特的生物學(xué)特性［19－20］.長(zhǎng)白山中華蜜蜂在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中形成了群勢(shì)強(qiáng)、耐寒力高、分蜂性弱等適應(yīng)當(dāng)?shù)丨h(huán)境的特性［21］，可在最低氣溫－40℃的環(huán)境自然越冬，越冬期長(zhǎng)達(dá)半年［11，20］.長(zhǎng)白山中華蜜蜂在體色、體長(zhǎng)、前翅翅脈、肘脈指數(shù)等主要形態(tài)標(biāo)記表現(xiàn)出特殊性.相比于其他地區(qū)中華蜜蜂，長(zhǎng)白山中華蜜蜂個(gè)體較大，體色偏黑［21－22］，肘脈指數(shù)較高，為 4.09－5.99［21，23－24］，第三徑中橫脈出現(xiàn)突出的頻率較高，為 30%－80%［22，24］.

本研究在長(zhǎng)白山的腹地，中華蜜蜂主產(chǎn)區(qū)采集110群樣本，采用5對(duì)微衛(wèi)星引物和mtDNA tRNAleu-COII 357 bp片段，分析該地區(qū)中華蜜蜂的遺傳多樣性與遺傳結(jié)構(gòu).本研究為長(zhǎng)白山地區(qū)中華蜜蜂資源保護(hù)和利用提供重要理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

中華蜜蜂樣本于2008年8月采自吉林省長(zhǎng)白山區(qū)的安圖縣池北區(qū)、二道白河鎮(zhèn)、松江鎮(zhèn)地區(qū)，總計(jì)樣本數(shù)量110群蜜蜂(表1).

表1 長(zhǎng)白山中華蜜蜂樣本信息Table 1 Information of samples from Changbai Mountains

1.2 試驗(yàn)方法

每群取1只工蜂，利用UNIQ10柱式基因組DNA抽提試劑盒(生工生物上海股份有限公司)提取基因組.

PCR擴(kuò)增微衛(wèi)星位點(diǎn)的引物來(lái)源于NCBI網(wǎng)站(表2)，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min;95℃變性50 s，退火30 s(退火溫度參照表2)，72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min;4℃保存.微衛(wèi)星PCR產(chǎn)物經(jīng)8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè).

表2 微衛(wèi)星位點(diǎn)信息Table 2 Information of 5 microsatellite loci

PCR擴(kuò)增mtDNA tRNAleu-COII片段，上游引物為E2:5'-GGCAGAATAAGTGCATTG-3'，下游引物H2:5'-CAATATCATTGATGACC-3'［25］.反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸30 s，30個(gè)循環(huán);72℃延伸8 min;8℃保存.mtDNA PCR產(chǎn)物送至上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序.為保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，測(cè)序結(jié)果中個(gè)體數(shù)量在3只以下的單倍型進(jìn)行重復(fù)測(cè)序.

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

根據(jù)8%非變性聚丙烯酰胺電泳結(jié)果進(jìn)行微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因判讀，利用Ms tools軟件計(jì)算期望雜合度(expected heterozygosity，He)、觀察雜合度(observed heterozygosity，Ho)、多態(tài)信息含量(polymorphism information content，PIC)與等位基因頻率.利用Popgene 1.31軟件計(jì)算等位基因數(shù)(observed number of alleles，Na)、有效等位基因數(shù)(effective number of alleles，Ne)與香農(nóng)指數(shù)(Shannon's information index，I).

mtDNA測(cè)序序列以非編碼區(qū)“AAAATTT”序列為開(kāi)始，截取357 bp的序列片段進(jìn)行分析，利用ClustalX 1.83軟件對(duì)其進(jìn)行比對(duì)，統(tǒng)計(jì)單倍型種類，利用MEGA 4.0軟件計(jì)算序列的堿基組成，利用DnaSP 5.00.07軟件計(jì)算單倍型多樣度(haplotype diversity，Hd)，核苷酸多樣度(nucleotide diversity，Pi)與平均核苷酸差異數(shù)(average number of nucleotide differences，K).

2 結(jié)果與分析

2.1 長(zhǎng)白山中華蜜蜂遺傳多樣性

2.1.1 微衛(wèi)星位點(diǎn)的遺傳多樣性 長(zhǎng)白山中華蜜蜂在A107、AP043、AP085、AP313、AT101位點(diǎn)整體等位基因較少，遺傳多樣性水平低.每個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)1－4個(gè)等位基因，平均等位基因數(shù)為2.6000±1.1402，平均有效等位基因數(shù)為1.4181±0.6487.長(zhǎng)白山中華蜜蜂5個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的期望雜合度為0－0.6107，平均期望雜合度為0.2110±0.2333.除A107位點(diǎn)的期望雜合度為0.6107外，其余4個(gè)位點(diǎn)的期望雜合度為0－0.1780.5 個(gè)位點(diǎn)的觀察雜合度為0－0.1827，平均觀察雜合度為0.0645 ±0.0718.5 個(gè)位點(diǎn)的平均香農(nóng)指數(shù)為 0.4031 ±0.4202(表3).

表3 長(zhǎng)白山中華蜜蜂微衛(wèi)星DNA的遺傳多樣性參數(shù)Table 3 Genetic diversity parameters of Apis cerana cerana from Changbai Mountains by microsatellite loci

2.1.2 線粒體DNA遺傳多樣性 長(zhǎng)白山中華蜜蜂在mtDNA tRNAleu-COII 357 bp片段T、C、A、G 4種核苷酸的平均比例分別為44.8%、9.5%、40.6%和5.0%.長(zhǎng)白山中華蜜蜂共檢測(cè)出9種單倍型，H1單倍型(Japan1型，AB078733)是文獻(xiàn)報(bào)道中分布較為廣泛的類型，相比于H1單倍型，1種單倍型在1個(gè)位點(diǎn)上發(fā)生缺失，7種單倍型分別在1個(gè)位點(diǎn)發(fā)生突變(表4)，其中單一多態(tài)位點(diǎn)4個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)3個(gè).

表4 長(zhǎng)白山中華蜜蜂mtDNA tRNAleu-COII片段單倍型種類及變異信息1)Table 4 Variable sites and haplotypes of Apis cerana cerana from Changbai Mountains in mtDNA tRNAleu-COII region

長(zhǎng)白山中華蜜蜂mtDNA tRNAleu-COII 357 bp片段遺傳多樣性偏低，單倍型多樣度為0.249±0.054、核苷酸多樣度為0.00074 ±0.00017、平均核苷酸差異為0.263.

本研究在長(zhǎng)白山地區(qū)新發(fā)現(xiàn) H2、H3、H4、H5、H7、H8、H9等7種單倍型.與 NCBI網(wǎng)站進(jìn)行比對(duì)，H3(登錄號(hào):KF673779)、H5(登錄號(hào):KF673782)、H7(登錄號(hào):KF673780)、H8(登錄號(hào):KF673781)等4種單倍型為中華蜜蜂中首次發(fā)現(xiàn)(表4)，H2、H4、H9等3種單倍型為在長(zhǎng)白山地區(qū)發(fā)現(xiàn)的新記錄.

2.2 長(zhǎng)白山中華蜜蜂遺傳結(jié)構(gòu)

2.2.1 微衛(wèi)星遺傳結(jié)構(gòu) 長(zhǎng)白山中華蜜蜂5個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的遺傳結(jié)構(gòu)中，均以一種等位基因?yàn)橹?AP043、AP085、AP313、AT101等4個(gè)位點(diǎn)的主要主等位基因，占所檢測(cè)到的等位基因90%以上.AP313位點(diǎn)只有1種等位基因(342 bp).A107有4種等位基因，其中165 bp占所檢測(cè)到的等位基因50%以上(表5).2.2.2 線粒體遺傳結(jié)構(gòu) 長(zhǎng)白山中華蜜蜂mtDNA tRNAleu-COII 357 bp片段的遺傳結(jié)構(gòu)較單一.9種單倍型中，以H1(Japan1型)單倍型為主，占83.64%.其次為H9單倍型，占6.36%.其余7種單倍型頻率為0.91%－2.73%(表 4).

表5 長(zhǎng)白山中華蜜蜂的微衛(wèi)星遺傳結(jié)構(gòu)Table 5 Genetic structure of Apis cerana cerana based on microsatellite in Changbai Mountains

3 討論

(1)在現(xiàn)有中華蜜蜂遺傳多樣性研究中，中華蜜蜂 A107、AP043、AP085、AP313、AT101 這 5 個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的 PIC 值主要范圍分別是0.5－0.6、0.2－0.5、0.7－0.85、0.2－0.4 和 0.2－0.5［5－6，26］，長(zhǎng)白山中華蜜蜂的 PIC 值分別為 0.5541、0.1186、0.1319、0和0.1644，均低于PIC值的主要分布范圍或處于較低水平.期望雜合度也體現(xiàn)出相似的規(guī)律［5－6，26］.目前，較少使用mtDNA tRNAleu-COII片段進(jìn)行中華蜜蜂遺傳多樣性研究，僅有海南中華蜜蜂的相關(guān)研究中運(yùn)用了該片段.海南中華蜜蜂 mtDNA tRNAleu-COII片段發(fā)現(xiàn)單倍型多樣度、核苷酸多樣度、平均核苷 酸 差異分別為 0.742 ± 0.017、0.00354 ±0.00013和1.248［7］，而長(zhǎng)白山中華蜜蜂的這3個(gè)指標(biāo)均遠(yuǎn)低于海南中華蜜蜂的研究結(jié)果.所以微衛(wèi)星和線粒體分子遺傳標(biāo)記分析，均說(shuō)明長(zhǎng)白山中華蜜蜂遺傳多樣性水平處于非常低的水平.

(2)長(zhǎng)白山植被良好、具有大宗蜜源以及豐富的輔助蜜粉源，是中華蜜蜂優(yōu)良的棲息地.20世紀(jì)前長(zhǎng)白山野生中華蜜蜂資源極豐富，此地蜂蜜是皇家貢品［27］.由于西方蜜蜂引進(jìn)后引起種間競(jìng)爭(zhēng)，導(dǎo)致長(zhǎng)白山中華蜜蜂種群數(shù)量下降;外來(lái)中華蜜蜂基因滲入，使得當(dāng)?shù)刂腥A蜜蜂面對(duì)環(huán)境變化、疾病等惡劣條件的耐受性下降;經(jīng)濟(jì)較發(fā)達(dá)的鄰國(guó)對(duì)野生蜂蜜的高價(jià)需求，促進(jìn)毀巢取蜜的行為，毀滅性減少了當(dāng)?shù)匾吧腥A蜜蜂的種群數(shù)量;社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，養(yǎng)蜂人的數(shù)量減少，養(yǎng)蜂技術(shù)下降;人工育王技術(shù)應(yīng)用不當(dāng)，以上原因均使得長(zhǎng)白山中華蜜蜂種群遺傳多樣性降低.長(zhǎng)白山中華蜜蜂形成分散的小種群，遺傳變異低于其它地區(qū)的中華蜜蜂，并表現(xiàn)出較為單一的遺傳結(jié)構(gòu).

(3)長(zhǎng)白山中華蜜蜂是分布在我國(guó)東北地區(qū)的中華蜜蜂代表，是耐寒型中華蜜蜂的寶貴資源.原長(zhǎng)白山中華蜜蜂廣泛分布在黑龍江省的小興安嶺以南、吉林省和遼寧省的長(zhǎng)白山脈，具有維持強(qiáng)群、耐寒力強(qiáng)等優(yōu)良蜂種特性.但近年來(lái)長(zhǎng)白山中華蜜蜂數(shù)量大幅度減少，已成為中華蜜蜂中數(shù)量最少的生態(tài)型，處于瀕危維持狀態(tài)［9，28］.長(zhǎng)白山中華蜜蜂存在著滅絕的風(fēng)險(xiǎn).生命資源的滅絕將會(huì)永久消失，因此搶救性保護(hù)長(zhǎng)白山中華蜜蜂刻不容緩.建議在長(zhǎng)白山中華蜜蜂分布較多、生態(tài)條件較好的地方設(shè)立中華蜜蜂保護(hù)區(qū);在保護(hù)區(qū)內(nèi)政府用補(bǔ)貼、技術(shù)支持等形式鼓勵(lì)當(dāng)?shù)剞r(nóng)民原始飼養(yǎng)本土的中華蜜蜂，擴(kuò)大長(zhǎng)白山中華蜜蜂的種群數(shù)量;禁止西方蜜蜂和轉(zhuǎn)地的中華蜜蜂進(jìn)入，禁止從保護(hù)區(qū)外購(gòu)買蜂種或蜂王，保持長(zhǎng)白山中華蜜蜂的遺傳特征;在保護(hù)區(qū)內(nèi)適當(dāng)?shù)挠杏?jì)劃的蜂群交流，不進(jìn)行人工選育，保持長(zhǎng)白山中華蜜蜂的遺傳多樣性.致謝:樣本采集中得到了楊明福等同志的幫助.本科生夏鳳枝參與部分實(shí)驗(yàn).謹(jǐn)此致謝!

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