黃樹軍，黃 婷，肖永太，榮俊冬，楊 陽，何天友，陳凌艷，鄭郁善，

(1.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院;2.福建農(nóng)林大學(xué)園林學(xué)院，福建 福州350002)

大明竹屬(Pleioblastus)植物隸屬竹亞科(Bambusoideae)，我國有20余種，多分布于長江中下游各地，分布零散［1］.該屬竹子形態(tài)優(yōu)美，生態(tài)凈化能力強(qiáng)，為庭園景觀綠化的優(yōu)良植物.

竹類植物的生長發(fā)育規(guī)律都較為特殊，以花、果實(shí)等形態(tài)為主的傳統(tǒng)植物分類方法對竹子進(jìn)行分類較為復(fù)雜、困難，竹子分類不一［2－4］，學(xué)術(shù)上頗有爭議［5］.隨著現(xiàn)代分子生物技術(shù)的飛速發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)在竹子分類及遺傳多樣性研究方面得到了廣泛應(yīng)用［6－11］，從分子水平上輔助分類［12］，有助于解決分類爭議，對鑒定種質(zhì)資源起重要作用.簡單重復(fù)序列間擴(kuò)增(inter simple sequence repeats，ISSR)是由Zietkiewicz提出，具有較好的穩(wěn)定性及多態(tài)性［13］.近年來，ISSR技術(shù)對竹類植物的研究報(bào)道較多，但關(guān)于大明竹屬植物的相關(guān)報(bào)道不多.目前大明竹屬部分植物的分類還存在爭議［14］，運(yùn)用生物技術(shù)對大明竹屬植物的種間親緣關(guān)系的研究報(bào)道較少.利用ISSR技術(shù)可對大明竹屬植物的遺傳多樣性進(jìn)行研究.ISSR技術(shù)基于PCR的擴(kuò)增，該擴(kuò)增體系受諸多因素的影響［15］.為了確定ISSR分析的可靠性，對ISSR-PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序優(yōu)化選擇是極有必要的.本試驗(yàn)利用單因素試驗(yàn)方法對大明竹屬部分植物的反應(yīng)體系進(jìn)行了優(yōu)化，建立了適合大明竹屬植物的PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序，并篩選了18條對大明竹屬植物有效的引物，旨在為大明竹屬植物的遺傳多樣性及鑒定分類等方面研究提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 選取栽植于福建農(nóng)林大學(xué)百竹園大明竹屬25個(gè)竹種(表1)的嫩葉，每個(gè)品種取3－5株，用冰壺及變色硅膠迅速干燥，并在－80℃的低溫下保存，以備提取DNA.

表1 大明竹屬25個(gè)竹種的情況Table 1 The 25 species of Pleioblastus in the present study

1.1.2 儀器 主要儀器有LabCycler PCR儀、DYY-8C電泳儀、DYCP-31DN電泳槽、JS-680全自動數(shù)碼凝膠成像分析儀等.

1.1.3 試劑 10 × PCR Buffer、Taq DNA 聚合酶、RNA 酶、DNA Ladder Marker、dNTPs Mixture、MgCl2、100條隨機(jī)引物(哥倫比亞大學(xué)公布)、瓊脂糖等購于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;核酸染料Gold View購于上海賽百盛公司;液氮購于福州市第二化工廠;硼酸、無水乙醇、溴酚藍(lán)、三羥基氨基甲烷、乙二胺四乙酸二鈉、蔗糖均為國產(chǎn)分析純.

1.2 基因組DNA的提取

大明竹屬植物基因組DNA采用杭州博日公司Biospin植物基因組DNA提取試劑盒(Cat#BSCl3S1)提?。?6－17］，所提取的DNA的完整性、濃度、純度經(jīng)電泳及紫外分光光度計(jì)測定，滿足試驗(yàn)要求，并保存于－20℃的冰箱中供ISSR分析.

1.3 ISSR反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序的建立及優(yōu)化

1.3.1 ISSR-PCR原初體系及擴(kuò)增程序的建立 參考孫志娟等［18］的方法，將PCR反應(yīng)體積設(shè)定為20 μL，含 40 ng 模板 DNA、0.5 μmol·L－1引物、0.5 mmol·L－1dNTPs、2 μL 10 × PCR Buffer、1.0 U Taq DNA 聚合酶、2.0 mmol·L－1Mg2+.篩選時(shí)所應(yīng)用的擴(kuò)增程序固定為:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，55℃復(fù)性30 s，72℃延伸90 s，循環(huán)40次;72℃延伸7 min，4℃保存.

1.3.2 ISSR-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化 以大明竹屬25個(gè)竹種的DNA樣品為模板，利用UBC811引物在Lab-Cycler PCR儀上篩選ISSR擴(kuò)增體系.以建立的ISSR-PCR原初體系為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)不同濃度(用量)的Mg2+、Taq DNA聚合酶、引物、dNTPs、模板DNA(表2)，每次擴(kuò)增改變其中的某一因子，研究此因子對ISSR擴(kuò)增反應(yīng)的影響，確定各因子濃度(用量)并綜合檢驗(yàn)體系的擴(kuò)增效果.

表2 ISSR擴(kuò)增體系篩選1)Table 2 Design of optimal ISSR reaction system

1.4 ISSR有效引物的篩選及反應(yīng)體系的檢驗(yàn)

用100條隨機(jī)引物對任意一份DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在已優(yōu)化的反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序下進(jìn)行.對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，并于凝膠成像分析儀上觀察拍照，篩選有效的ISSR引物.有效引物需符合如下條件:(1)條帶清晰，不模糊，不彌散;(2)空白中無或少假帶;(3)對所有樣品均有質(zhì)量好的條帶.以大明竹屬25個(gè)竹種提取的DNA作為模版，用篩選過的ISSR引物在已優(yōu)化的反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢驗(yàn)其效果及重復(fù)性.

1.5 ISSR有效引物退火溫度的確定

對篩選過的隨機(jī)引物，依據(jù)Tm=2×(A+T)－4×(C+G)確定引物的理論退火溫度.式中，Tm表示DNA的溶解溫度，A表示腺嘌呤個(gè)數(shù)，T表示胸腺嘧啶個(gè)數(shù)，C表示胞嘧啶個(gè)數(shù)，G表示鳥嘌呤個(gè)數(shù).在比引物Tm低5℃的基礎(chǔ)上，設(shè)置6個(gè)退火溫度梯度，在已優(yōu)化的反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，確定引物的最佳退火溫度.

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR反應(yīng)體系的建立

2.1.1 擴(kuò)增程序的優(yōu)化 PCR擴(kuò)增程序分為變性、復(fù)性和延伸3個(gè)階段，對擴(kuò)增時(shí)間、溫度及循環(huán)次數(shù)進(jìn)行優(yōu)化.不同物種的變性和延伸溫度一般差別不大，變性溫度為94－95℃，延伸溫度為72℃;復(fù)性溫度是影響特異性的重要因子;循環(huán)次數(shù)對擴(kuò)增量也有影響，一般在35－40個(gè)循環(huán).經(jīng)過UBC811引物的初步篩選，在原擴(kuò)增程序的基礎(chǔ)上確定大明竹屬植物的擴(kuò)增程序?yàn)?94℃預(yù)變性5 min;94℃變性60 s，55℃復(fù)性45 s，72℃延伸90 s，循環(huán)40次;72℃延伸7 min，4℃保存.

2.1.2 Mg2+濃度的確定 Mg2+是Taq DNA聚合酶維持活性的重要因素.Mg2+濃度不但對酶活性和忠實(shí)性有影響，還影響產(chǎn)物的特異性、產(chǎn)物與模板的解鏈溫度、引物退火、引物二聚體形成等.若Mg2+濃度過高會增加非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，使條帶模糊;若Mg2+濃度過低則Taq DNA聚合酶的擴(kuò)增效率較低，擴(kuò)增產(chǎn)物就少.從圖1可以看出:Mg2+濃度為2.0和2.5 mmol·L－1時(shí)可擴(kuò)增出較清晰的條帶，其中以2.5 mmol·L－1擴(kuò)增的條帶多態(tài)性和亮度最好;當(dāng)Mg2+濃度大于或小于2.5 mmol·L－1時(shí)，條帶的多態(tài)性和清晰度均較差.可見，Mg2+濃度對擴(kuò)增結(jié)果有較大的影響，對PCR擴(kuò)增極為重要.

2.1.3 Taq DNA聚合酶用量的確定 Taq DNA聚合酶的作用是將dNTPs添加到雙鏈DNA引物鏈上，使聚合形成新DNA鏈.Taq DNA聚合酶的用量由酶活性、反應(yīng)體積、酶耐熱性等因素決定.若Taq DNA聚合酶用量過高，容易造成非特異性擴(kuò)增［1］，過低則造成擴(kuò)增產(chǎn)物少.從圖2可以看出，Taq DNA聚合酶用量低于1.0 U時(shí)，其擴(kuò)增強(qiáng)度弱，而0.5 U的用量則沒有擴(kuò)增結(jié)果.這可能是由于Mg2+濃度固定時(shí)，Taq DNA聚合酶的減少會使Mg2+對酶的激活能力相對減弱，導(dǎo)致擴(kuò)增量下降.當(dāng)Taq DNA聚合酶用量為1.0 U時(shí)，擴(kuò)增條帶最多;當(dāng)用量大于1.0 U時(shí)，條帶變少，造成了非特異性擴(kuò)增.可見，Taq DNA聚合酶的用量以1.0 U為宜.

圖1 Mg2+濃度對ISSR擴(kuò)增的影響Fig.1 The effect of concentration of Mg2+on the amplification of ISSR

圖2 Taq DNA聚合酶用量對ISSR擴(kuò)增的影響Fig.2 The effect of concentration of Taq DNA polymerases on the amplification of lSSR

2.1.4 dNTPs濃度的確定 dNTPs是PCR擴(kuò)增的底物，dNTPs濃度對擴(kuò)增條帶的數(shù)量及亮度存在較大影響.dNTPs濃度過低會導(dǎo)致引物與底物的酶促反應(yīng)速度下降，擴(kuò)增量減少;dNTPs濃度過高，一方面會與Mg2+發(fā)生鰲合，使Mg2+濃度降低，從而影響Taq DNA聚合酶的活性，另一方面會導(dǎo)致堿基錯(cuò)配，降低產(chǎn)物的特異性.因此，確定dNTPs的濃度是非常重要的.圖3表明:dNTPs濃度為0.15 mmol·L－1時(shí)，擴(kuò)增條帶清晰且?guī)?shù)多，效果最好;濃度高于0.15 mmol·L－1時(shí)，擴(kuò)增條帶則變淺，部分條帶消失，這可能是由于抑制了Taq DNA聚合酶的活性從而影響了擴(kuò)增效果;濃度低于0.15 mmol·L－1時(shí)，擴(kuò)增條帶數(shù)變少，且呈彌散狀，這可能是由于Mg2+不能有效激活Taq DNA聚合酶，導(dǎo)致擴(kuò)增量減少.可見，dNTPs濃度以0.15 mmol·L－1為宜.

2.1.5 引物濃度的確定 引物濃度偏高時(shí)容易導(dǎo)致引物之間形成二聚體，還容易引起非特異性擴(kuò)增及錯(cuò)配，同時(shí)引物之間會產(chǎn)生競爭，使擴(kuò)增量大幅下降;引物濃度過低時(shí)，引物與模板DNA結(jié)合的機(jī)率降低，反應(yīng)提前結(jié)束，使擴(kuò)增條帶變淺甚至沒有條帶.圖4表明:引物濃度為0.1和0.2 μmol·L－1時(shí)，沒有出現(xiàn)擴(kuò)增條帶;濃度為 0.3 和 0.4 μmol·L－1時(shí)出現(xiàn)不清晰條帶;當(dāng)濃度大于 0.5 μmol·L－1時(shí)，條帶很亮但背景模糊，這可能由非特異性擴(kuò)增導(dǎo)致.經(jīng)綜合考慮，引物濃度以0.5 μmol·L－1為宜.

圖3 dNTPs濃度對ISSR擴(kuò)增的影響Fig.3 The effect of concentration of dNTP on the amplification of lSSR

圖4 引物濃度對ISSR擴(kuò)增的影響Fig.4 The effect of concentration of primer on the amplification of lSSR

2.1.6 模板DNA用量的確定 PCR擴(kuò)增對模板DNA用量及純度的要求不高，僅2個(gè)拷貝模板或細(xì)胞粗提物即可進(jìn)行PCR擴(kuò)增.但為了確保擴(kuò)增效率及特異性，仍需一定量的模板DNA，以避免交叉污染導(dǎo)致反應(yīng)失敗.圖5表明，模板DNA用量為10－100 ng時(shí)，條帶的清晰度相似，表明模板DNA用量對擴(kuò)增效果的影響較小，較大范圍的用量均能擴(kuò)增出清晰條帶.但當(dāng)模板DNA用量不足時(shí)，會降低擴(kuò)增效率，引物與模板有效配對較難;若模板DNA用量太大，引物耗盡過早，會造成退火發(fā)生在PCR產(chǎn)物3'端與模板間或產(chǎn)物間，導(dǎo)致延伸中止，條帶呈彌散狀.根據(jù)圖5中條帶的清晰度，模板DNA用量以50 ng為宜.

圖5 模板DNA用量對ISSR擴(kuò)增影響Fig.5 The effect of concentration of DNA template on the amplification of lSSR

2.1.7 ISSR-PCR反應(yīng)體系各因子的終濃度(用量) 采用單因素試驗(yàn)方法，對影響PCR擴(kuò)增的5個(gè)因子進(jìn)行優(yōu)化并檢驗(yàn)，最終確立大明竹屬植物 20 μL 反應(yīng)體系含 50 ng模板 DNA、0.5 μmol·L－1引物、0.15 mmol·L－1dNTPs、2 μL 10 × PCR Buffer、1.0 U Taq DNA 聚合酶、2.5 mmol·L－1Mg2+.

2.2 有效引物的篩選

利用已優(yōu)化的大明竹屬植物ISSR-PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序，對選取的100條隨機(jī)引物進(jìn)行篩選(圖6)，最終篩選出18條條帶清晰、多態(tài)性豐富且重復(fù)性高的有效引物(表3).

圖6 大明竹屬植物部分引物的ISSR擴(kuò)增電泳圖譜Fig.6 Electrophoretogram of ISSR amplification of some primers in Pleioblastus

2.3 退火溫度的確定

退火溫度會影響擴(kuò)增條帶的帶譜，與引物及物種的序列相關(guān)［19］.退火溫度一般設(shè)定比引物的理論退火溫度低5℃，然后以2℃的幅度逐級增大.退火溫度較高時(shí)會影響引物二聚體和非特異性產(chǎn)物的形成，可在設(shè)定的較高退火溫度下先進(jìn)行5個(gè)循環(huán)，再在較低的溫度下進(jìn)行余下循環(huán)來提高產(chǎn)物的特異性.ISSR引物對退火溫度的要求嚴(yán)格，每一條引物的退火溫度不盡相同.退火溫度越高，產(chǎn)物的特異性就越高，但擴(kuò)增量就會減少;反之，溫度越低，則擴(kuò)增量越高，但容易引起引物與模板錯(cuò)配.根據(jù)上述規(guī)律，確定已篩選的18條ISSR引物的最適退火溫度為49.2－55.2℃(表3).

2.4 ISSR有效引物及優(yōu)化體系的檢驗(yàn)

以大明竹屬25個(gè)竹種的DNA為模版，用篩選過的ISSR引物在已優(yōu)化的反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條帶清晰度高、多態(tài)性豐富、重復(fù)性高(圖7).

表3 大明竹屬植物的ISSR有效引物Table 3 The sequence of ISSR primers in Pleioblastus

圖7 引物UBC840對大明竹屬植物的ISSR擴(kuò)增電泳圖譜Fig.7 The electrophoretogram of ISSR amplification by primer UBC840 for Pleioblastus

3 討論與結(jié)論

影響PCR擴(kuò)增的因素很多，有效性、特異性及忠實(shí)性為檢驗(yàn)擴(kuò)增效果的指標(biāo)，但高特異性的影響因子可能與高擴(kuò)增量的影響因子存在差異，因此在建立PCR反應(yīng)體系時(shí)，需要確定哪些參數(shù)指標(biāo)最重要，并據(jù)此優(yōu)化反應(yīng)條件.在PCR反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化中，單因素試驗(yàn)方法得到了廣泛的應(yīng)用［20－21］，但因單因素試驗(yàn)沒有考慮各因子的交互作用，因此略有缺陷.正交試驗(yàn)恰好能彌補(bǔ)此缺陷，這種方法已逐漸在該領(lǐng)域應(yīng)用［22－24］.正交試驗(yàn)雖然可確定各因子影響的主次關(guān)系，但其對技術(shù)要求高，加樣時(shí)間較長，可能易引起模板斷裂或Taq DNA聚合酶失活，影響擴(kuò)增結(jié)果.本試驗(yàn)在前人研究的基礎(chǔ)上，以大明竹屬25個(gè)竹種的DNA為模板，UBC811為引物，采用單因素試驗(yàn)方法，先對反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序進(jìn)行優(yōu)化，確定各因子濃度(用量)后進(jìn)行擴(kuò)增檢驗(yàn);在已優(yōu)化反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序的基礎(chǔ)上，對有效引物進(jìn)行篩選，并確定引物的退火溫度;以大明竹屬25個(gè)竹種的DNA為模版，用18條ISSR引物在已優(yōu)化的反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序下進(jìn)行擴(kuò)增.

本試驗(yàn)采用單因素試驗(yàn)方法，對影響大明竹屬植物PCR反應(yīng)的各因子及擴(kuò)增程序進(jìn)行了優(yōu)化，建立了ISSR反應(yīng)體系，并從初選的100條引物中篩選出18條條帶清晰、多態(tài)性好、重復(fù)性高的有效引物，為ISSR分析大明竹屬植物的遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)提供參考.優(yōu)化后的大明竹屬植物ISSR-PCR的20 μL反應(yīng)體系含 2.0 μL 10 × PCR Buffer、2.5 mmol·L－1Mg2+、0.15 mmol·L－1dNTPs、0.5 μmol·L－1引物、1.0 U Tap DNA聚合酶、50 ng模板DNA、10.6 μL滅菌ddH2O.擴(kuò)增程序?yàn)?94℃預(yù)變性5 min;94℃變性60 s，55℃復(fù)性45 s，72℃延伸90 s，循環(huán)40次;72℃延伸7 min，4℃保存.

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