王愛迪，冉曉華，陳 磊,*，趙衛(wèi)東

(1.天津大學(xué)藥物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，天津 300072；2.天津出入境檢驗檢疫局動植物和食品檢測中心，天津 300461)

自1994年首例轉(zhuǎn)基因植物——轉(zhuǎn)基因耐儲藏番茄在美國批準(zhǔn)進入市場以來，轉(zhuǎn)基因植物的研發(fā)、生產(chǎn)和試驗規(guī)模均快速增長。轉(zhuǎn)基因植物主要有大豆、馬鈴薯、番茄等，并被廣泛加工成食品流入市場[1-3]?；趯D(zhuǎn)基因食品的安全及生物環(huán)境安全的考慮，各國政府相繼建立法規(guī)，對轉(zhuǎn)基因植物的研究、生產(chǎn)、運輸、貯存、銷售和進出口等所有環(huán)節(jié)進行監(jiān)控[4-6]。目前食品中轉(zhuǎn)基因成分的檢測方法應(yīng)用較廣泛的是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)和實時定量PCR(quantitative real time-polymerase chain reaction，qRTPCR)，即通過對樣品基因組核酸中的外源基因的擴增和定量來進行轉(zhuǎn)基因成分的定性和定量檢測[7-9]。使用PCR法檢測深加工食品中的轉(zhuǎn)基因成分，面臨的最大挑戰(zhàn)是如何有效地提取到DNA模板，其難度不僅在于食品加工過程中DNA會遭到嚴重破壞，而且受物理、化學(xué)和生物等因素的影響使DNA質(zhì)量降低[10]。

由于深加工產(chǎn)品的DNA提取技術(shù)是轉(zhuǎn)基因成分定性和定量檢測的瓶頸，因此，很多實驗室都在研究深加工產(chǎn)品的DNA提取方法?，F(xiàn)有的DNA提取技術(shù)大多依賴各種試劑盒，花費較高；一些研究通過其他手段提取DNA，但提取過程繁雜，較為耗時[11-12]。

盡管已有多種DNA提取方法可供選擇，深加工食品如馬鈴薯淀粉和食用大豆油中DNA降解嚴重，含量低，樣品基質(zhì)黏稠，因此此類樣品中的DNA提取仍然是一個具有挑戰(zhàn)性的課題。本實驗以磁響應(yīng)性高、表面包覆二氧化硅的磁性四氧化三鐵微球為固相吸附劑，從植物源食品中提取基因組DNA模板，然后選擇適當(dāng)序列的引物，對DNA模板中的內(nèi)源和外源基因進行PCR擴增。內(nèi)源基因的擴增用以驗證純化DNA的可擴增性；外源基因的擴增用于轉(zhuǎn)基因成分的檢測。通過與傳統(tǒng)方法的DNA提取量、純度、PCR擴增效果、qRT-PCR數(shù)據(jù)結(jié)果、提取時間、費用等幾個方面比較，對磁性微球提取基因組核酸方法與qRT-PCR相結(jié)合的檢測方法用于深加工食品中轉(zhuǎn)基因檢測進行綜合評價。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

大豆(抗草甘膦基因)、馬鈴薯(抗Bt基因)陽性對照品 天津市出入境檢疫局動植食檢測中心；其他食品 市購。

十二烷基硫酸鈉、聚乙二醇8000 北京鼎國生物技術(shù)有限公司；蛋白酶K 德國Merck公司；鹽酸胍 天津市光復(fù)精細化工研究所；10×PCR Buffer、10×Ex Taq Buffer、dNTP Mix(2.5mmol/L)、rTaq(5U/μL)、Ex Taq HS (5U/μL)、各種引物等生物試劑均由TaKaRa公司合成(表1)；Affimag FEO磁性四氧化三鐵微球(200nm，飽和磁化率78emu/g) 天津市倍思樂色譜技術(shù)開發(fā)中心；Omega?磁珠核酸提取試劑盒、Omega?硅膠柱核酸提取試劑盒、Wizard?磁珠核酸提取試劑盒 美科美(北京)生物醫(yī)學(xué)有限公司。

UV2450紫外分光光度計 日本島津公司；PCR儀 德國Biometra公司；Light Cycler 480實時定量PCR儀 德國Roche公司；DYCP-31C水平電泳槽 美國Bio-Rad公司；BioDoc-IT220凝膠成像系統(tǒng) 美國UVP公司。

表 1 引物序列及其大小Table 1 Sequences and fragment sizes of primers

1.2 方法

1.2.1 核酸的提取

Affimag磁珠法：將大豆(種子研磨)、豆腐、腐乳、大豆油、馬鈴薯(鮮品)、薯條、薯泥和淀粉(馬鈴薯)等固體樣品用液氮研磨。各稱取0.5g于離心管中，加入預(yù)熱的細胞裂解液(0.01mol/L Tris-HCl，0.15mol/L NaCl，0.002mol/L乙二胺四乙酸二鈉，2g/100mL十二烷基硫酸鈉(SDS)，pH8.0)5mL，5mol/L的鹽酸胍溶液0.5mL，10mg/mL的蛋白酶K溶液0.05mL。55℃溫育30min，加入10μL 3mg/mL的RNase，反應(yīng)5min，12000r/min離心5min得到樣品液。取0.5mL 10mg/mL的磁性微球懸液放于1.5mL的離心管中，磁分離棄去清液，加入吸附液(聚乙二醇8000 20g/mL，2mol/L NaCl)1.0mL，振搖混勻，加入樣品液0.5mL，室溫充分混勻10min。磁場分離，棄去清液。再加入吸附液1.0mL，同法處理一遍。70%乙醇洗滌磁珠兩遍，棄去洗滌液，室溫下風(fēng)干。加入TE(0.01mol/L EDTA，0.025mol/L Tris-HCl，pH8.0)緩沖液0.5mL，輕輕顛倒10min，使磁珠充分分散均勻。磁分離，清液即為DNA提取液，備用。豆油體積為200mL，淀粉質(zhì)量為10g，提取步驟同前。

十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法，操作步驟見參考文獻[15]；Omega?硅膠試劑盒、Omega?磁珠試劑盒、Wizard?磁珠試劑盒的使用參照說明書進行。

每種方法針對每種樣品做3個重復(fù)。

1.2.2 DNA樣品的檢測

1.2.2.1 DNA質(zhì)量濃度和純度的測定

用紫外分光光度計檢測基因組DNA在260nm波長處的吸光度(A260)，計算所提DNA的質(zhì)量濃度，DNA的質(zhì)量濃度/(μg/mL)=A260×50。檢測基因組DNA在260nm和280nm 波長處的吸光度，根據(jù)A260/A280值判斷DNA 純度。

1.2.2.2 瓊脂糖凝膠電泳檢測

將提取的DNA進行凝膠電泳檢測，制備1%的瓊脂糖凝膠，上樣配比為5μL 核酸樣品溶液＋1μL 6×Loading Buffer＋1μL 100×SYBR Green。取上述混合配比溶液5μL。電泳條件為80V，40min。

1.2.2.3 PCR擴增反應(yīng)

表 2 PCR以及qRT-PCR反應(yīng)體系Table 2 Reaction system of PCR and qRT-PCR

普通PCR反應(yīng)體系(表2)的反應(yīng)條件為95℃、1min，95℃、10s，60℃、40s，72℃、40s，35個循環(huán)；72℃ 10min。選擇25μL反應(yīng)體系。制備3%的瓊脂糖凝膠，上樣配比同1.2.2.2節(jié)，電泳條件為80V，40min。

qRT-PCR的反應(yīng)體系(表2)的反應(yīng)條件為95℃、30s，95℃、15s，60℃、40s，45個循環(huán)；40℃、30s。選擇25μL反應(yīng)體系，每個模板DNA做2個平行，Ct值取平均值。

1.2.3 實際樣品的轉(zhuǎn)基因檢測

選擇幾種常見的市售食品，用Affimag磁珠法提取樣品DNA(每個樣品做3個重復(fù))，并對其進行內(nèi)源基因以及外源基因啟動子CaMV35S和終止子NOS檢測，提取步驟以及qRT-PCR反應(yīng)體系參照1.2.2節(jié)和1.2.3節(jié)。每個DNA模板做2個平行。其中Ct值表示反應(yīng)管的熒光信號到達設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，該值越小，表明反應(yīng)管內(nèi)DNA含量越高。Ct＜36表示該目的基因為陽性；Ct＞40表示目的基因為陰性；36＜Ct＜40，需要做重復(fù)實驗判斷陽性陰性結(jié)果[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 5種方法提取基因組DNA的檢測

圖 1 樣品基因組DNA電泳結(jié)果Fig.1 Agarose gel electrophoresis of the DNA from samples

圖 2 5種DNA提取方法提取的樣品DNA的純度(A260/A280)(A)和含量(B)Fig.2 Purity (A260/A280) (A) and quantity (B) of extracted DNA samples determined by five different methods

采用CTAB法、Omega?硅膠柱法、Wizard?磁珠法、Omega?磁珠法和Affimag磁珠法5種不同方法提取DNA樣品，結(jié)果見圖1。未經(jīng)過加工的大豆和馬鈴薯鮮品，采用不同的提取方法都可以得到整齊明亮的DNA條帶，為基因組DNA，分子質(zhì)量大于10kbp；經(jīng)過加工后的豆腐，薯條，薯泥，只能觀察到一些彌散拖尾的小片段DNA，分子質(zhì)量基本小于1kbp；而深加工的大豆油，腐乳和馬鈴薯淀粉樣品中的DNA含量很低，用不同方法提取的樣品在瓊脂糖凝膠電泳上均未看到明顯的DNA條帶，將通過后續(xù)PCR以及qRT-PCR來檢測DNA的提取效率。為了定量檢測所提取的DNA的含量和純度，利用紫外分光光度計測定DNA樣品在260nm和280nm波長處的紫外吸光度，根據(jù)1.2.2.1節(jié)中的公式計算其質(zhì)量濃度，結(jié)果如圖2所示。由于豆油的DNA質(zhì)量濃度很低，在圖2B中不能顯示，其結(jié)果是CTAB法為0.002μg/g，Omega? 硅膠柱法為0.017μg/g，Wizard?磁珠法為0.012μg/g，Omega? 磁珠法為0.024μg/g，Affimag 磁珠法為0.032μg/g。由圖2可知，采用Affimag磁珠提取方法所提取的DNA含量大部分樣品較高，A260/A280比值為1.10～1.80，表明此方法在DNA提取過程中細胞裂解液裂解程度較完全，去除雜質(zhì)(糖類、蛋白質(zhì)類)能力較強；同時在提取過程中避免了高速離心，只需要吸附、洗滌、洗脫步驟即可得到DNA樣品，提取過程中對DNA機械力損傷較小。

2.2 5種方法提取DNA的PCR和qRT-PCR檢測

以5種方法提取的各種食品的基因組DNA為模板，對大豆樣品和馬鈴薯樣品分別進行大豆內(nèi)源基因Lectin和馬鈴薯內(nèi)源基因UGP的PCR擴增，將擴增產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖3。

圖 3 不同方法提取的樣品內(nèi)源基因PCR電泳檢測Fig.3 Agarose gel electrophoresis patterns of PCR products

對于CTAB法來說，大豆類食品中只有大豆和豆腐擴增到目的條帶，而腐乳和大豆油由于樣品加工程度深，并且加入了一些添加劑，所提取的核酸樣品未能得到目的條帶，電泳中條帶為引物二聚體擴增條帶；馬鈴薯樣品中，只有馬鈴薯淀粉由于加工程度較深未能擴增到目的條帶。而幾種試劑盒方法，腐乳只有Omega?硅膠柱法可以擴增到目的基因，大豆油和馬鈴薯淀粉未能擴增到目的條帶，一方面可能是由于樣品本身原因?qū)е绿崛『怂針悠焚|(zhì)量少低于PCR或凝膠電泳的檢測限，另一方面可能是所提取的核酸樣品中核酸聚合酶抑制劑的存在導(dǎo)致不能有效擴增。本實驗采用的Affimag磁珠方法，大豆和馬鈴薯所有樣品都能擴增得到目的條帶，尤其大豆油和馬鈴薯淀粉均可以擴增出特異的目的條帶(圖3)，并且在含量、質(zhì)量和純度等方面滿足了PCR和目的擴增基因的電泳檢測靈敏度的要求，擴增的目的條帶清晰。表明該方法更加適用于從深加工食品中提取核酸樣品。

同時，為了驗證PCR擴增結(jié)果的可靠性，同時進行了大豆和馬鈴薯內(nèi)源基因的qRT-PCR擴增，由于qRT-PCR在反應(yīng)中加入了熒光標(biāo)記引物，除了可以進行定量研究之外，還提高了核酸擴增反應(yīng)的準(zhǔn)確性以及檢測的靈敏度[16]，因此，為了進一步驗證核酸的可擴增性，以5種方法提取的各種食品的基因組DNA為模板，對內(nèi)源基因進行qRT-PCR擴增，從所得的擴增曲線以及Ct值(表3)可得到從待檢樣品中檢測到各樣品對應(yīng)內(nèi)源基因的含量，Ct值結(jié)果與普通PCR擴增到的目的條帶亮度(圖3)基本一致。同時，qRT-PCR進一步驗證了本方法在相同樣品量的條件下所提取的大豆油和馬鈴薯淀粉的DNA含量最高(Ct值分別為34.10和28.64)，表明本方法所提取的DNA可以用于qRT-PCR檢測。

表 3 各種樣品DNA qRT-PCR的Ct值Table 3 qRT-PCR Ct of the DNA samples

2.3 市售產(chǎn)品轉(zhuǎn)基因成分的檢測

為了檢測幾種市售食品是否含有轉(zhuǎn)基因成分，采用本方法提取所購買的樣品核酸，并且通過qRT-PCR擴增內(nèi)源基因(大豆類食品擴增Lectin基因片段，馬鈴薯類擴增UGP基因片段)以及外源基因CaMV35S啟動子和NOS終止子，通過實驗結(jié)果的Ct值(表4)對各種轉(zhuǎn)基因食品中的轉(zhuǎn)基因含量進行測定，結(jié)果表明，各食品內(nèi)源基因擴增的Ct值均小于36，表明所提取的DNA樣品為各自對應(yīng)的基因組DNA，大豆、馬鈴薯Ct值較小，表明所提取的DNA相對含量較高；其他幾種食品由于受加工過程的影響，以及食品本身的特性，Ct值較大，DNA含量較低。根據(jù)CaMV35S啟動子和NOS終止子的擴增Ct值(均大于36)表明，所購買食品均為非轉(zhuǎn)基因食品。qRT-PCR用時短，僅需70min，不需后續(xù)電泳檢測，減少了檢測時間。將本方法與qRTPCR聯(lián)合應(yīng)用，可以縮短轉(zhuǎn)基因食品的檢測時間，減少檢測結(jié)果假陰性的可能性，提高轉(zhuǎn)基因檢測的準(zhǔn)確性。

表 4 樣品各基因組qRT的Ct值Table 4 qRT Ct of the DNA samples

3 結(jié) 論

本實驗以超高磁性的四氧化三鐵磁珠為分離基質(zhì)，提取深加工食品的基因組或片段DNA的量較高，純度較高，能夠滿足PCR以及qRT-PCR實驗的要求，均達到或超過試劑盒的提取效果，同時，僅有Affimag方法可以從淀粉、豆油等深加工食品中提取得到基因組DNA碎片，并且通過PCR電泳檢測到目的基因，且qRT-PCR的Ct值均小于36，也證明了所提取DNA可以用于目的基因的檢測，表明該方法可以從深加工食品中提取到核酸片段，該方法的提取效率和靈敏度較高。此過程無需使用有機溶劑，安全性較高，操作較簡單，耗時短，不到1.5h即可完成DNA提取步驟，滿足高通量自動核酸提取技術(shù)發(fā)展的要求，可以應(yīng)用于出入境大批量常規(guī)樣品檢驗的DNA快速提取，加快檢驗速度。

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