戰(zhàn)曉鳳，鄔應(yīng)龍*

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014)

豌豆是世界各地廣泛種植的主要食用豆之一，其產(chǎn)量在豆科類農(nóng)作物中排名第四，僅低于黃豆、花生和干大豆，產(chǎn)量超過(guò)1000萬(wàn)t[1]。傅翠珍等[2]對(duì)我國(guó)西部地區(qū)豌豆成分進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，其籽粒中總淀粉含量為28.70%～58.69%，平均為49.17%，而蛋白質(zhì)和粗纖維含量分別高達(dá)25%和5%左右。豌豆淀粉主要作為制取豌豆?jié)饪s蛋白的副產(chǎn)物，產(chǎn)量巨大[3]。在豌豆淀粉糊化溶液中，由于較多的直鏈淀粉相互作用，致使淀粉更易老化，出現(xiàn)溶液渾濁和水分析出等現(xiàn)象，尤其經(jīng)反復(fù)多次凍融，其穩(wěn)定性更差。豌豆淀粉的這類性質(zhì)限制了其在食品工業(yè)的廣泛應(yīng)用[4]。據(jù)報(bào)道在淀粉分子上引進(jìn)了一定數(shù)量的羥丙基團(tuán)可有效地改善淀粉糊的性質(zhì)，增強(qiáng)淀粉糊的親水性和保水性能，使淀粉糊的透明度和穩(wěn)定性增高，不易沉淀[5]。羥丙基改性在馬鈴薯淀粉[6]、甘薯淀粉[7]、木薯淀粉[8]等薯類淀粉，小麥淀粉[9]、指狀小米淀粉[10]、大米淀粉[11]等谷類淀粉被報(bào)道并具有良好的效果，但在更加易老化的豆類淀粉的研究中卻鮮見報(bào)道。本研究為制備羥丙基豌豆淀粉對(duì)制備工藝中的各主要影響因素進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)其性質(zhì)進(jìn)行研究，以期為羥丙基豌豆淀粉進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豌豆淀粉 市售；環(huán)氧丙烷、1,2-丙二醇等試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HS80恒溫水浴搖床 中國(guó)科學(xué)院武漢科學(xué)儀器廠；7200分光光度計(jì) 尤尼柯(上海)儀器有限公司；HG-9245A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；Super3型快速黏度測(cè)試儀 澳大利亞New Port公司；PHS-3C型數(shù)顯酸度計(jì) 上海綠宇精密儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 羥丙基豌豆的制備

稱取一定量的豌豆淀粉，配成40%(m/m)的淀粉乳，緩慢加入20%(m/m)硫酸鈉，于搖床上混勻30min。之后用1mol/L NaOH溶液調(diào)至一定pH值，并將一定量的環(huán)氧丙烷加入淀粉乳中，密閉容器(用氮?dú)庾鳛楸Ｗo(hù))。反應(yīng)攪拌一定時(shí)間，待反應(yīng)結(jié)束后，用0.5mol/L硫酸調(diào)pH值至5.5。抽濾，蒸餾水洗滌3次，烘干，粉碎，得羥丙基豌豆淀粉。

1.3.2 羥丙基淀粉取代度的測(cè)定

以羥丙基改性淀粉中羥丙基含量表示改性淀粉的取代度。羥丙基含量的測(cè)定采用分光光度法，淀粉樣品(100mg)加入100mL的容量瓶中，再加入(25mL 0.5mol/L)的硫酸。混合物在沸水浴鍋中消化直至獲得澄清的溶液，冷卻后蒸餾水定容至100mL。移液管移取溶液(1mL)到25mL刻度測(cè)試管中，插入冷水中，逐滴加入管中8mL濃硫酸。充分混勻后，試管放入沸水中水浴20min。之后將其放入冰水浴中直至溶液冷卻。將茚三酮試劑(0.15g茚三酮溶于10mL 12.5% NaHSO3，0.6mL)加入具塞管中，混勻后放入25℃水浴100min。溶液用濃硫酸定容到25mL，混合充分。然后轉(zhuǎn)移到1cm比色皿中，10min后，595nm處測(cè)定吸光度，淀粉空白作為對(duì)照[12-13]。羥丙基淀粉的摩爾取代度(MS) 按下式計(jì)算：

式中：H為羥丙基的含量/%；F為試樣或空白樣稀釋倍數(shù)；M樣為在標(biāo)準(zhǔn)工作曲線上對(duì)應(yīng)的丙二醇質(zhì)量/g；M原為在標(biāo)準(zhǔn)工作曲線上查得的原淀粉空白樣中丙二醇質(zhì)量/g；W樣為試樣質(zhì)量/g；W原為原淀粉質(zhì)量/g；0.7763為丙二醇含量轉(zhuǎn)換成羥丙基含量的轉(zhuǎn)換系數(shù)；2.79為羥丙基含量轉(zhuǎn)換成取代度的轉(zhuǎn)換數(shù)。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

豌豆淀粉乳40%(m/m)，無(wú)水硫酸鈉20%。分別考察環(huán)氧丙烷添加量(2%、6%、10%、14%、18%、22%)，pH值(9.5、10.1、10.7、11.3、11.9)，反應(yīng)溫度(30、34、38、42、46℃)，反應(yīng)時(shí)間(4、8、12、16、20、24h)?？疾靻我灰蛩貢r(shí)，其余條件固定為：環(huán)氧丙烷添加量10%、pH11.3、溫度40℃、時(shí)間12h。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以環(huán)氧丙烷的添加量、反應(yīng)pH值、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間為影響因素，羥丙基的取代度為響應(yīng)值，利用Design Expert 8.0軟件對(duì)4個(gè)因素設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)法。因素水平見表1。

表 1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Factors and their coded levels for Box-Behnken design

1.3.5 體外消化性的測(cè)定

取原淀粉、高取代度(HS)、中等取代度(MS)、低取代度(LS)，考察化學(xué)改性對(duì)豌豆淀粉體外消化性的影響。

參考Englyst等[14]方法略有改動(dòng)。分別取100mg淀粉(干基)裝在兩個(gè)100mL三角瓶中，加入10mL蒸餾水，混勻后沸水浴15min，冷卻后加入醋酸緩沖液10mL和直徑為10mm的玻璃珠7個(gè)混勻，將三角瓶放在37℃搖床中10min后，加入5mL酶液Ⅲ，以此刻為零時(shí)，在37℃搖床中以190r/min的轉(zhuǎn)速搖動(dòng)，20min后，取其中一個(gè)三角瓶煮沸滅活后全部轉(zhuǎn)移，測(cè)定還原糖值，得到G20。再過(guò)100min后，再取另外一個(gè)三角瓶煮沸滅活全部轉(zhuǎn)移，測(cè)定G120。

快速消化淀粉(RDS)含量/%=(G20－游離葡萄糖)× 0.9/m×100

慢消化淀粉(SDS)含量/%=(G120－G20)×0.9/m×100

抗性淀粉(RS)含量/%=(總葡萄糖－G120)×0.9/m×100

式中：m為樣品質(zhì)量/mg；G20為反應(yīng)20min時(shí)測(cè)得的還原糖含量；G120為反應(yīng)120min時(shí)測(cè)得的還原糖含量。

1.3.6 快速黏度儀(rapid visco-analyser，RVA)的測(cè)定

稱2.5g不同取代度的羥丙基淀粉(絕干)用移液管加入25mL蒸餾水，于RVA容器中混勻。采用RVA Super3 Standardl標(biāo)準(zhǔn)的程序升溫-降溫循環(huán)：在50℃保持1min，后經(jīng)3.5min加熱到95℃，再在95℃保持3min，然后，在3.5min內(nèi)降低到50℃，然后在50℃保持2min。每個(gè)樣品測(cè)定3次。

1.3.7 溶脹度的測(cè)定

精確稱取淀粉0.25g，轉(zhuǎn)移到離心管中(離心管稱質(zhì)量w1)，在離心管中加入50mL蒸餾水，用可變漩渦混勻器混勻30s，在水浴中選擇34～90℃，保溫1h，之后將懸浮液快速冷卻到室溫，5000×g離心15min。獲得沉淀物，將上清液倒掉后，稱取殘?jiān)|(zhì)量(w2)。

淀粉溶脹度/%=[(w2－w1)/m－1]×100

式中：m為稱取的淀粉樣品干質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 反應(yīng)條件對(duì)取代度的影響

從圖1可以看出，羥丙基豌豆淀粉的取代度隨環(huán)氧丙烷添加量升高而逐漸增大。當(dāng)環(huán)氧丙烷用量少于14%時(shí)，產(chǎn)品的取代度提高較快；當(dāng)其用量超過(guò)14%后，取代度的提高程度逐漸趨于緩慢；其他條件一定時(shí)，取代度隨pH值的增加，淀粉的分子取代度提高較快，當(dāng)其pH值超過(guò)11.3，羥丙基淀粉分子取代度的提高速度很緩慢；升高溫度可提高淀粉與環(huán)氧丙烷的有效碰撞機(jī)率，故使羥丙基反應(yīng)效率提高，取代度增大。當(dāng)反應(yīng)溫度低于42℃時(shí)，產(chǎn)品的分子取代度和反應(yīng)效率隨溫度升高而明顯增大，當(dāng)溫度超過(guò)42℃，產(chǎn)品取代度的提高趨于緩慢，當(dāng)反應(yīng)溫度達(dá)到50℃以后，淀粉大量糊化；淀粉的取代度隨反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間達(dá)到20h后趨于穩(wěn)定。

圖 1 反應(yīng)條件對(duì)取代度的影響Fig.1 Effect of reaction condition on substituent degree

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化羥丙基豌豆淀粉的制備條件

2.2.1 響應(yīng)面法的試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法優(yōu)化羥丙基豌豆淀粉制備工藝，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以羥丙基取代度為響應(yīng)值，試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見表2。

表 2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及響應(yīng)值結(jié)果Table 2 Box-Behnken experimental design and corresponding results

2.2.2 模型回歸方程方差分析

利用Design Expert 8.0軟件對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，對(duì)表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析后得到模型為二次多項(xiàng)回歸方程，取代度(MS)對(duì)反應(yīng)pH值、環(huán)氧丙烷添加量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間的方程為：MS＝0.10＋0.063A＋0.046B＋0.058C＋0.026D＋0.028AB＋0.037AC＋0.018AD＋0.015BC＋1.068×10-3BD＋8.926×10-3CD－6.090×10-3A2－0.023B2＋5.728×10-3C2－5.145×10-3D2。

對(duì)模型進(jìn)行方差分析結(jié)果(表3)可知，用上面所得的方程描述因子回歸得P＜0.0001，方程回歸極顯著，A、B、C、D、AB、AC、AD、B2也極其顯著，說(shuō)明用上述回歸方程描述各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系時(shí)，其因變量和全體自變量之間的線性關(guān)系顯著，即這種試驗(yàn)方法是可靠的。從回歸方程各項(xiàng)方差的進(jìn)一步檢驗(yàn)也可知，A、B、C、D都是影響羥丙基取代度的關(guān)鍵因子?；貧w模型預(yù)測(cè)的最佳羥丙基豌豆淀粉制備工藝條件為環(huán)氧丙烷添加量12%、反應(yīng)溫度40℃、反應(yīng)pH值為11.3、反應(yīng)時(shí)間18h，此條件下，值得同等高取代度改性淀粉，各因素量值最低。

表 3 二次回歸模型的方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance for the fitted regression equation

利用Design Expert軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合得到二次回歸方程的響應(yīng)面及其等高線主要見圖2，并對(duì)二因素交互作用影響羥丙基取代度進(jìn)行分析。圖2a為反應(yīng)時(shí)間(18h)和pH值(11.3)不變，環(huán)氧丙烷添加量和反應(yīng)溫度對(duì)產(chǎn)物取代度的交互作用。固定環(huán)氧丙烷的添加量，隨著反應(yīng)溫度的升高，在40℃以下區(qū)間，產(chǎn)物取代度的變化隨溫度的升高而增加；高于40℃，反應(yīng)溫度升高對(duì)于產(chǎn)物取代度影響不明顯；在環(huán)氧丙烷添加量水平較低時(shí)，溫度的升高，產(chǎn)物取代度反而有所降低。圖2b表明，當(dāng)環(huán)氧丙烷的添加量一定時(shí)，pH11.3以下，產(chǎn)物取代度的隨溫度的升高而變大；pH11.3以上，反應(yīng)pH值變化對(duì)于產(chǎn)物取代度影響較弱。圖2c為環(huán)氧丙烷添加量和反應(yīng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)物取代度的交互作用。環(huán)氧丙烷的添加量一定時(shí)，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，反應(yīng)時(shí)間18h以內(nèi)時(shí)，產(chǎn)物取代度隨溫度升高明顯變大；反應(yīng)時(shí)間超過(guò)18h，再延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間對(duì)于產(chǎn)物取代度影響不明顯。其中，最高取代度不到0.2。圖2d表明，反應(yīng)時(shí)間18h、反應(yīng)溫度40℃條件下，產(chǎn)物取代度的隨兩者變化而增加較大；18h、40℃以上時(shí)，反應(yīng)溫度及反應(yīng)時(shí)間對(duì)于產(chǎn)物取代度影響不大。其中，最高取代度為0.14。

圖 2 各因素交互作用的的響應(yīng)面及等高線分析Fig.2 Analysis of response surface and contour of any two factors

2.3 體外消化性的測(cè)定

表 4 化學(xué)改性豌豆淀粉消化性Table 4 Digestibility of chemically modified pea starch

由表4可知，未改性的豌豆淀粉幾乎全部被消化(78.5%RDS，20.3%SDS，1.20%RS)。用環(huán)氧丙烷醚化之后，RS從1.20%增加到32.7%、25.8%和16.1%；總消化性從98.8%降低到67.3%、74.2%和83.9%；SDS均有不同程度降低。可以推測(cè)，羥丙基化可以增加完全糊化后豌豆淀粉抗酶解能力，這是由于引入的羥丙基團(tuán)起到了空間阻礙作用，使淀粉酶不易與淀粉分子結(jié)合成活性復(fù)合物。HS的消化性與MS、LS相比，其中RDS降低2.0%和15.0%，RS增加7.1%和16.6%，TDS降低6.9%和16.6%。羥丙基取代度增加其消化性呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)，這與Leegwater等[16]的結(jié)果相一致。HS的SDS較LS由17.6%降低到12.7%，而RS由25.8%增加到32.7%，可能是通過(guò)改性，SDS部分轉(zhuǎn)化成為RS[15]。

2.4 RVA的測(cè)定

圖 3 淀粉的RVA糊化性質(zhì)Fig.3 Pasting profiles of starches measured by RVA

表 5 不同取代度羥丙基豌豆淀粉RVA特性值Table 5 The RVA value of different substitution degree hydroxypropyl pea starch

如圖3所示，豌豆原淀粉及羥丙基豌豆淀粉糊化曲線，在開始加熱到95℃保溫區(qū)間里，取代度分別為0.05、0.10、0.15的實(shí)驗(yàn)組的糊化曲線相似，具有相近的黏度峰值。冷卻階段，原淀粉比變性淀粉具有較大的黏度回升值。如表5所示，羥丙基化顯著改變了豌豆淀粉的糊化性質(zhì)，其糊化性質(zhì)取決于取代度水平。羥丙基化后峰值黏度和崩解值增加，與此同時(shí)糊化溫度和回生值降低。類似的現(xiàn)象在玉米淀粉中有所報(bào)道[17]。與原淀粉相比，豌豆所有的羥丙基淀粉糊化溫度下降了11～18℃，而峰值黏度增加了74%～109%，降低的糊化溫度和增加的峰值黏度反映了豌豆淀粉顆粒內(nèi)部相關(guān)黏結(jié)力強(qiáng)度下降，可能是羥丙基基團(tuán)促進(jìn)了滲透，加速了水分子進(jìn)入淀粉顆粒，改性顆粒的無(wú)定形區(qū)域塑化作用的初始速率增加[18]，羥丙基化使低取代度變性淀粉糊峰值黏度提高；當(dāng)取代度超過(guò)0.1，隨取代度增加，峰值黏度會(huì)有所降低，主要是淀粉顆粒內(nèi)聚力變?nèi)酢Ｓ袌?bào)道表明低摩爾取代度的羥丙基淀粉(MS≤0.2)具有較低的糊化溫度，如芭蕉芋淀粉降低了8℃[19]，馬鈴薯淀粉6～14℃[20]，羥丙基淀粉的回生值比原淀粉低約16%～59%。變性淀粉上的大量羥丙基基團(tuán)具有較強(qiáng)空間效應(yīng)，阻礙了淀粉鏈的靠攏、結(jié)晶。

2.5 溶脹度的測(cè)定

圖 4 溫度對(duì)豌豆原淀粉及其羥丙基淀粉溶脹度的影響Fig.4 Effect of temperature on free swelling capacities of native and hydroxypropyl pea starch

如圖4所示，各淀粉溶脹度隨著溫度升高呈上升趨勢(shì)。在36～90℃范圍內(nèi)，羥丙基豌豆淀粉溶脹度均高于原淀粉。同一測(cè)定溫度下，溶脹度隨羥丙基豌豆淀粉取代度增加而升高。一定溫度條件下，引入的羥丙基基團(tuán)利于淀粉非晶區(qū)對(duì)水分子的吸收，增強(qiáng)了吸水性[21]。與原淀粉相比，各取代度的羥丙基豌豆淀粉達(dá)到溶脹度最大值的溫度均有提前。且羥丙基取代度越高，溶脹度越大。可能因?yàn)榱u丙基的引入削弱淀粉鏈間的結(jié)合力，使水合作用加快，增加淀粉顆粒親水性。說(shuō)明豌豆淀粉經(jīng)羥丙基化可增加其溶脹度。

3 結(jié) 論

3.1 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法對(duì)進(jìn)行了優(yōu)化，并對(duì)4個(gè)關(guān)鍵因素的最佳水平及其交互作用進(jìn)行了研究，得出制備羥丙基豌豆淀粉最佳工藝參數(shù)為：環(huán)氧丙烷添加量12%、反應(yīng)pH11.3、反應(yīng)溫度40℃、反應(yīng)時(shí)間18h。

3.2 豌豆淀粉經(jīng)羥丙基化后，其性質(zhì)有很大改觀，表現(xiàn)出良好的體外抗消化性，且抗消化性取決于取代度的高低；淀粉的起始糊化溫度、峰值溫度和峰值時(shí)間明顯提前；淀粉溶脹度最大值溫度提前，溶脹度增大。

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