陳文榮，葉杰君，李永強(qiáng)，張真真，曹詣斌，郭衛(wèi)東

(浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，金華 321004)

低溫是影響經(jīng)濟(jì)作物產(chǎn)量和品質(zhì)的主要環(huán)境因素之一。植物經(jīng)低溫脅迫后，植物脯氨酸、甜菜堿和可溶性糖等兼容滲透劑大量積累，從而改變了原有的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)以及脂質(zhì)膜和碳水化合物的組成[1]。同時(shí)，低溫脅迫能夠誘導(dǎo)植物體內(nèi)某些基因的表達(dá)，這些基因的表達(dá)蛋白可能直接參與低溫脅迫的應(yīng)答或者間接調(diào)控其他靶基因的表達(dá)[2]。Weiser[3]早在1970年就提出植物抗寒性誘導(dǎo)過(guò)程中基因表達(dá)改變的觀點(diǎn)，指出多年生木本植物的低溫適應(yīng)性可能需要兩個(gè)條件，即特異基因的轉(zhuǎn)錄激活和在最大抗寒過(guò)程中新蛋白質(zhì)的低溫誘導(dǎo)合成。陳香波等[4]列表總結(jié)了從擬南芥、黑麥、歐洲油菜、大麥、菠菜、小麥、苜蓿、馬鈴薯等鑒定分離出與植物抗寒性有關(guān)的低溫誘導(dǎo)基因62個(gè)，并指出這些基因的功能與抗冰凍脫水、膜脂相變、低溫下酶活性以及“抗凍活性”有關(guān)。

柑橘屬(Citrus)植物的果實(shí)是世界第一大水果類別，我國(guó)的柑橘產(chǎn)量位居世界第一。柑橘屬植物是亞熱帶植物，性喜溫暖，對(duì)低溫反應(yīng)敏感，所以溫度是影響柑橘屬植物產(chǎn)量和品質(zhì)的一個(gè)重要?dú)夂蛞蛩?。佛?Citrusmedicavar.sarcodactylisSwingle)是蕓香科柑橘屬香櫞的變種，其果型奇特，具有較高的觀賞和藥用價(jià)值，也是中國(guó)特色的物種。但是由于佛手抗寒性差，植株半致死溫度為-4℃左右[5]，低溫凍害后其品質(zhì)和產(chǎn)量均會(huì)受到影響。研究表明，低溫脅迫下佛手的ERF6基因[6]和GRAS基因[7]的表達(dá)量發(fā)生明顯的變化，低溫對(duì)兩種基因的表達(dá)均有誘導(dǎo)作用。由于抗寒性差的原因，佛手的栽培地局限在亞熱帶北緣以南地區(qū)，這很大程度的限制了佛手在我國(guó)北方廣大地區(qū)的栽培、種植和佛手產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

目前，對(duì)寒敏感柑橘類植物的研究很少[8]，對(duì)佛手等寒敏感柑橘類植物對(duì)低溫應(yīng)答的分子途徑、低溫誘導(dǎo)特異基因的表達(dá)變化情況和引起寒敏感的分子機(jī)理少有報(bào)道。本文以浙江金華地區(qū)佛手主栽品種青皮佛手為試材，采用mRNA差異顯示技術(shù)獲得佛手低溫脅迫前后差異表達(dá)的cDNA片段，BLAST確定其功能后，采用半定量PCR技術(shù)確定這些基因在佛手低溫脅迫前后的表達(dá)量變化情況，從而獲得寒敏感佛手低溫脅迫相關(guān)基因，分析低溫應(yīng)答分子機(jī)制。通過(guò)本研究為佛手寒敏感基因的獲得和寒敏感機(jī)制的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

選取長(zhǎng)勢(shì)一致的2年生青皮佛手(C.medicacv. Qingpi)盆栽苗，采自浙江師范大學(xué)佛手實(shí)驗(yàn)基地——浙江錦林佛手有限公司。在人工氣候室進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)及抗寒鍛煉，溫度設(shè)置參照劉祖祺等的方法，預(yù)培養(yǎng)溫度為20(黑夜)/28(白天) ℃，光照每天14 h，光照強(qiáng)度100 μmol·m-2·s-1，濕度75%，定期澆水；預(yù)培養(yǎng)3周后在2 d時(shí)間內(nèi)將溫度緩慢降至4 ℃進(jìn)行冷鍛煉7d。

1.2 低溫處理

隨機(jī)選取3盆青皮佛手盆栽苗移入冷庫(kù)，處理?xiàng)l件為溫度-4 ℃，光照14 h，濕度75%，溫度控制精度為±0. ℃1，處理時(shí)間為24 h。取完整、無(wú)病蟲害的自當(dāng)年生春夏梢頂向下數(shù)第5—11葉位的7張葉片用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 DDRT-PCR分析

1.3.1 DDRT-PCR引物及內(nèi)參引物的設(shè)計(jì)

mRNA差異顯示分析引物按Genhunter Corporation RNA imageTM Kit 序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，引物序列見(jiàn)表1。引物由上海invitrogen合成。

表1 錨定引物、隨機(jī)引物及內(nèi)參引物列表

1.3.2 總RNA提取及mRNA純化

采用Trizol試劑盒(invitrogen)提取葉片總RNA，DNAase消化去除基因組DNA，并采用OligotexTM-d(T)30 mRNA 純化試劑盒(TaKaRa)對(duì)提取的總RNA進(jìn)行mRNA純化。

1.3.3 cDNA第一鏈合成

純化得到的mRNA應(yīng)用3種錨定引物(H-T11G，H-T11C， H-T11A)參照invitrogen的SuperscriptTMIII Reverse Transcriptase進(jìn)行mRNA反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。

1.3.4 DDRT-PCR擴(kuò)增

將3′錨定引物3條，5′隨機(jī)引物8條，共24對(duì)引物組合，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系和程序主要參考Liang等1992年提供的方法，略加更改。25 μL反應(yīng)體系中含10×PCR Buffer(Mg2+Plus) 2.5 μL、dNTP(2.5mmol/L each) 2 μL、錨定引物(20 μmol/L)和隨機(jī)引物(20 μmol/L) 各2.0 μL、TAKARA Taq(5 U/μL) 0.2 μL以及2 μLcDNA模板溶液，加無(wú)菌純水補(bǔ)充總體積至25 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min，然后進(jìn)行94 ℃變性30 s，40 ℃退火2 min、72 ℃延伸1 min的循環(huán)反應(yīng)，共40個(gè)循環(huán)，最后于72 ℃下延伸5 min，4 ℃保存。

1.3.5 差異片段的分離及回收

采用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離差異片段，銀染顯色。從銀染結(jié)果中選取差異表達(dá)的條帶進(jìn)行回收，選取的標(biāo)準(zhǔn)是，處理和對(duì)照條帶同一高度上有無(wú)差異和明顯的表達(dá)量差異。聚丙烯酰胺凝膠回收使用BioFlux的Biospin聚丙烯酰胺凝膠DNA回收試劑盒進(jìn)行。

1.3.6 差異片段的重?cái)U(kuò)及回收

直接取回收的差異片段2 μL作為模板，選擇對(duì)應(yīng)的引物組合，進(jìn)行二次擴(kuò)增，PCR的體系與程序與上文中相同。重?cái)U(kuò)后1%的瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下檢測(cè)重?cái)U(kuò)后的條帶是否與回收的條帶片段大小相同，如是同一條帶進(jìn)行瓊脂樣凝膠的回收。瓊脂糖凝膠回收用的試劑盒是上海生工生產(chǎn)的UNIQ-10 DNA膠回收試劑盒(SK1131)回收和純化目的片段。

1.4 差異片段的克隆

采用氯化鈣2次重懸法制備JM109感受態(tài)細(xì)胞，回收的差異片段與pMD18-T Simple Vector(TaKaRa)16 ℃進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入JM109感受態(tài)細(xì)胞，菌液涂平板后挑取單菌斑培養(yǎng)，做菌液PCR檢測(cè)對(duì)重組子進(jìn)行陽(yáng)性鑒定，反應(yīng)體系和程序和生成目的片段的PCR反應(yīng)一致。

1.5 陽(yáng)性轉(zhuǎn)化重組子的測(cè)序和序列的生物信息學(xué)分析

陽(yáng)性克隆子的測(cè)序工作由上海英駿生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司(Invitrogen,China)商業(yè)化完成，采用通用引物M13F/M13R組合起始測(cè)序。序列對(duì)比在NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)網(wǎng)站上，進(jìn)行BLASTx和BLASTn分析。

1.6 半定量RT-PCR鑒定目的基因表達(dá)量差異

1.6.1 引物設(shè)計(jì)

β-actin引物參考Genbank中已發(fā)表的序列，設(shè)計(jì)兼并引物，在佛手cDNA中擴(kuò)增出目的片段后，克隆、測(cè)序，再設(shè)計(jì)特異引物，設(shè)計(jì)的佛手特異引物序列為：Sense：TGCCATCCACGCCGTTCTATCT，Antisense：ATCACGACCAGCCAAGTCCAAA，引物均采用primer primer5設(shè)計(jì)，由上海生物工程有限公司合成。

1.6.2 半定量RT-PCR反應(yīng)條件的確定

以cDNA為模板，目的基因引物對(duì)和β-actin在異管同臺(tái)PCR中進(jìn)行反應(yīng)，設(shè)置不同的循環(huán)數(shù)，22、24、26、28、30、32、34、36個(gè)循環(huán)數(shù)，確定合適的條件，保證擴(kuò)增均處于線性期。PCR反應(yīng)程序參數(shù)為94 ℃預(yù)變性5 min，然后進(jìn)行94 ℃變性30 s，50—60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s的循環(huán)反應(yīng)，循環(huán)數(shù)為22—36個(gè)，最后于72 ℃下延伸5 min，4 ℃保存。

1.6.3 PCR產(chǎn)物的檢測(cè)

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在含溴化乙錠的2.0%瓊脂糖凝膠中電泳，電泳結(jié)果在紫外燈下用Bio-red公司成像系統(tǒng)自帶Quantity One軟件進(jìn)行掃描成像和光密度分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA的提取與檢測(cè)結(jié)果

提取的總RNA經(jīng)DNA酶消化后在全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(Thermo)上測(cè)定OD260/OD280，結(jié)果比值均在1.8—2.0之間，說(shuō)明RNA樣品的純度較好。用1%的瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定總RNA完整性，電泳結(jié)果顯示，28S、18S條帶清晰，無(wú)降解，說(shuō)明總RNA完整性好，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 mRNA差異顯示結(jié)果

以青皮佛手對(duì)照和處理組葉片總RNA為模板，分別用3種錨定引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，得到6種cDNA；再以這6種cDNA為模板，3種錨定引物與8種隨機(jī)引物組合進(jìn)行PCR擴(kuò)增。對(duì)相同引物組合擴(kuò)增得到的對(duì)照組和處理組的PCR產(chǎn)物進(jìn)行差異比較。在mRNA差異顯示過(guò)程中，聚丙烯酰胺凝膠上24對(duì)引物組合在佛手mRNA中共擴(kuò)增出3000多條cDNA序列。圖1為其中7組引物對(duì)擴(kuò)增出的佛手對(duì)照和處理cDNA片段。

通過(guò)DDRT-PCR，比較對(duì)照組和處理組擴(kuò)增結(jié)果，121條差異表達(dá)的cDNA片段被成功克隆和測(cè)序。經(jīng)生物信息學(xué)分析，差異表達(dá)序列中有33條為功能已知序列，88條為未知序列(其中5條具有開(kāi)放性閱讀框)。

2.3 半定量RT-PCR分析結(jié)果

將上述的33條已知差異表達(dá)序列及5條具有開(kāi)放性閱讀框的未知序列進(jìn)行半定量RT-PCR分析，以進(jìn)一步確定低溫脅迫前后這些差異表達(dá)片段表達(dá)量的變化。差異片段進(jìn)行RT-PCR的引物序列、退火溫度及PCR反應(yīng)循環(huán)數(shù)見(jiàn)表2。

表2DDRT的產(chǎn)物進(jìn)行半定量RT-PCR驗(yàn)證時(shí)各產(chǎn)物對(duì)應(yīng)的引物序列、退火溫度和循環(huán)數(shù)

Table2Oligonucleotideprimersequences,PCRconditionsandcyclenumbersfortheconfirmationofdifferentialdisplay(DD)productswithquantitativerelativereversetranscription(RT)-PCR

差異產(chǎn)物DDproduct正向特異引物序列Forwardpirmer(5′-3′)反向特異引物序列Reversepirmer(5′-3′)PCR退火溫度PCRannealingtemperatuer/℃循環(huán)數(shù)Cyclenumbersβ-actinTGCCATCCACGCCGTTCTATCTATCACGACCAGCCAAGTCCAAA55301-C1AAGGTTGATTGCCTCTACATTGCATAGCGGTTCCGTCCC55282-G2GATTTCGGTCCTATTCTGTTGGTTTCGCAGTTGTTCGTCTTTC55362-C7ACAACTCTAAAACCTTCGGGGTGCCTTCCACTTTCAATAA50283-G1GATTGCCACACTTCCCACATGACCCAAACACCCAACACAT55303-G15CCCCCTTGCTTGTCAACCTGCAACATTCGTCAACGCTCCG60323-G24GCTGAAGAGTTGAGAAAGAAGACAAGACATTGAAAATAAGAAGAAAAA50363-G17GTTGACTGCTTGTCCTCTCCCGCTTCCTCTGTCCCCTCCTTGGT55343-G19AGCGAACTTGAACCCCCGATGCAGCAATGCCAGCAACACA55324-G23TTTGGCAGAACCAGTTACACATCTTCCCAGTTGACATCCT50365-C2TGAGGACATCAAGTTGGAGACAAAGGCAGTTCAAGAAGAAGACG55345-C4GATTGCCGAAATAAGAAGGATGAATGAAGTGGGAAAGAATAAGGAG55325-C15AAAACATCATTGGAGGAACCTGAAGAAACAAAGATTGAAACATA50306-C1TTTGGTTACTTCTTTCTGTCTTGTGCGGTTCCGTCCCTCTT55306-C24TGTTGATTGTAAATGCGACGTTACGGTTCTTTCTCCACGA55306-C22TACCCAAATCTTTCCCCTTTGAAATAGAAGATAACCCTGATAG50366-C19GACCAGGATACATTGATAGGAAGCCAAGCAACCAGGGAAAGACA55326-A5-1ACATAAACTCACCACAGAACGAAGAGGATAGAACACTGTGATAACC55307-3-29GATAATCTGAGCACAACACCGCCACACGAATAGGGAATAATACAACG55367-6-33-1ACCAATCTCTAAGCCACTGCTGCTCAAACATCACACAACC55367-6-5TGTTTTTATTTGCGGACTTTACAAACAACATCATAAATCCAAT50367-6-15ATTGAAAAAACAAAGAAGGGGGAGCACAAAACATACGAAAAGCC55368-3-10GAAAGCATAAAATAAAACTGTGTGTCCCAAACGGGCTCATA55368-3-11GCTTCGGTCAGGCAGGAGAAAACTTAGGCATCATCATAACAAA55348-3-13ACGGTCCTGGAGAGACTTATGCCAATGAGATGAGGCAAACA55288-3-17GGCAGAGGAAAAGAAAGCAAAACGGGTCAGAGCGTAAGGTAGTG55288-6-39-1CTTATTCCGAGTGCTCTGTTTTGTCCGACGACCTTATTTGTATC55347-6-42GCGGTGTTGTGCTCTTATTATAGTTCTCCCTCTATTGCTTTTG50348-3-32TACTTGGATTGATAATAACTAACTTATGTATGCTTGGTCGCC55364-29-3CGTCAGTAACATACACAAGCACAAAAAATAAAAGAGGGCATA55362-G8TTTCGGTCCTATTCTGTTGGCTTTCGCAGTTGTTCGTCTT55366-C30GAGGCAACAACATTTAGCATTTTGTCTACCACTTAGGAGGAGGG55308-4-11-3GTCAGGCAATCCAGCAACTTCAAAGTCAGCGACAAGG50328-6-43GTAGTGGCTGCGGTAGGATAAGGGGCAAAGGAACAT55349-4-18-3ACATTGTTGTTCGGTTTTTTTGAACTGACTTTTGACCAGCATTCT50349-4-20-3AACATTGCCAGCGAACGCGAGGTCTGTAGTGGGTGC50369-4-4-2AAGAAACAAAGACTGAAACATATGGAGGAACCACAGAAATAATA5030G22TTTGGAGAGGGTAAAAAGGGTGCAATAGGAAAGTAGCAGTGTT50365-C7CGAGAAGAGAGGAGCCGTGGGGAGGATAGATGGGGCGATT5530

為了提高半定量RT-PCR的準(zhǔn)確性，每個(gè)差異片段做不同模板來(lái)源重復(fù)，PCR板內(nèi)重復(fù)和不同批次PCR重復(fù)，只有這3個(gè)重復(fù)表達(dá)趨勢(shì)一致的差異片段才被視為陽(yáng)性。每一批次的PCR反應(yīng)都帶有內(nèi)參β-actin，并在同一塊瓊脂糖凝膠上成像，只有同塊膠上的β-actin表達(dá)量一致的，才記做1個(gè)重復(fù)，這樣可以盡可能的減少凝膠成像上所帶來(lái)的假陽(yáng)性。

根據(jù)半定量RT-PCR分析鑒定，38個(gè)差異片段中有4個(gè)是假陽(yáng)性片段，34個(gè)陽(yáng)性片段。在通過(guò)鑒定的陽(yáng)性片段中，有29個(gè)差異片段低溫脅迫前后表達(dá)量上調(diào)，其表達(dá)量變化見(jiàn)圖2；有5個(gè)差異片段低溫脅迫前后表達(dá)量下調(diào)，其表達(dá)量變化見(jiàn)圖3。

圖2 29個(gè)上調(diào)基因經(jīng)過(guò)半定量RT-PCR分析后的瓊脂糖凝膠電泳圖

圖3 5個(gè)下調(diào)基因經(jīng)過(guò)半定量RT-PCR分析后的瓊脂糖凝膠電泳圖

將這34個(gè)陽(yáng)性差異片段根據(jù)其對(duì)應(yīng)的功能和寒脅迫的關(guān)系進(jìn)行分類，可分為植物逆境應(yīng)答、新陳代謝、細(xì)胞壁重建、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、氧化應(yīng)激、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、蛋白、脂肪和糖合成和轉(zhuǎn)運(yùn)、未知功能蛋白，共8類，其對(duì)應(yīng)功能、分類情況和序列信息見(jiàn)表3。

表3 DD產(chǎn)物對(duì)應(yīng)功能列表

續(xù)表

DDProduct長(zhǎng)度Length/bp引物Primers表達(dá)水平(與actin比值)Expressionlevel功能FunceionEG19720T11G+AP54．47±0．252葉綠素酶1Chlorophyllase-19×10-484-G23847T11G+AP60．163±0．008向光素phototropins3×10-748-3-11270T11C+AP35．77±0．208NADH脫氫酶亞單位5NADHdehydrogenasesubunit57．0細(xì)胞壁重建Cellwallmodification7-6-33-1376T11A+AP64．37±0．569伸展蛋白extensin-likeprotein1．17-6-5180T11A+AP16．5±0．5纖維素合酶蛋白cellulosesynthaseprotein9．07-3-29419T11C+AP815．3±0．3葡聚糖轉(zhuǎn)葡糖苷酶(XET)xyloglucanendotransglycosylase5×10-14信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)Signaltransduction5-C4270T11C+AP16．67±0．862蛋白磷酸酯酶2Cphosphatase2C-relatedprotein0．0153-G24308T11G+AP64．97±0．416鈣調(diào)素結(jié)合蛋白calmodulin-bindingprotein3×10-8轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)Transcription8-3-32231T11C+AP83．08±0．225細(xì)胞周期檢查點(diǎn)蛋白mitoticcheckpointfamilyprotein5．62-G8458T11G+AP73．8±0．458鳥苷戴帽酶α亞基mRNAcappingenzymesubunitα5．6抗氧化性O(shè)xidativeresistance8-3-10175T11C+AP314．97±0．351過(guò)氧化物酶peroxidase1×10-598-4-29-3370T11A+AP88．37±0．153硫氧還原酶蛋白thioredoxinfamilyprotein1×10-16蛋白、脂肪和糖合成和轉(zhuǎn)運(yùn)Protein，fatandcarbohydratesynthesisandtransduction3-G1653T11G+AP113．40±0．173延伸因子elongationfactorprotein3×10-426-C22211T11C+AP66．37±0．231ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白ABCtransporterfamilyprotein4×10-135-C7243T11C+AP20．087±0．004氨酰tRNA合成酶Aminoacyl-tRNAsynthetases2×10-991-C1217T11C+AP16．10±0．265亞精胺/腐胺轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)通透酶potBspermidine/putrescinetransportsystempermeasePotB9．06-A5-1376T11A+AP712．30±0．173半乳糖轉(zhuǎn)移酶galactosyltransferasefamilyprotein3．2未知功能Unknownfunction8-6-43199T11A+AP75．53±0．208未知unknownfunction9-4-20-3191T11A+AP26．10±0．265未知unknownfunctionG22270T11G+AP55．27±0．058未知unknownfunction

3 討論

低溫脅迫容易引起植物光合、呼吸作用關(guān)鍵基因的表達(dá)下調(diào)，同時(shí)植物生長(zhǎng)停滯以保證代謝所需的碳水化合物及能量；植物抗冷機(jī)制還包括細(xì)胞物理結(jié)構(gòu)(質(zhì)膜組成和細(xì)胞骨架)的適應(yīng)性發(fā)變、胞內(nèi)滲透保護(hù)物質(zhì)(脯氨酸、甜菜堿和可溶性糖)大量積累[1]、抗氧化劑的合成水平上升；使植物恢復(fù)物質(zhì)與能量代謝平衡。植物對(duì)冷脅迫的應(yīng)答過(guò)程中發(fā)生的一系列生理、生化變化，是復(fù)雜的內(nèi)在分子機(jī)制調(diào)控的結(jié)果，涉及大量的基因在表達(dá)模式、轉(zhuǎn)錄水平及轉(zhuǎn)錄后修飾方式等方面發(fā)生變化，但不同植物對(duì)低溫脅迫的應(yīng)答機(jī)制也存在著一定的差異[2]。揭示植物在逆境下所表現(xiàn)出的復(fù)雜的基因表達(dá)變化情況，對(duì)于正確解答植物對(duì)逆境的應(yīng)答機(jī)制有非常重要的科學(xué)意義。

相對(duì)于枳等耐寒的柑桔屬植物，佛手對(duì)低溫脅迫較敏感，-4 ℃低溫處理后，嫩葉出現(xiàn)萎蔫等典型癥狀[5]。本研究通過(guò)mRNA差異顯示技術(shù)篩選和半定量RT-PCR技術(shù)驗(yàn)證，獲得了34個(gè)陽(yáng)性差異cDNA片段。這34個(gè)佛手低溫脅迫相關(guān)基因，根據(jù)其功能的歸屬大致可分為以下幾類：8個(gè)與植物組織抵御相關(guān)基因、9個(gè)與光合作用或其他代謝相關(guān)基因、3個(gè)細(xì)胞壁代謝相關(guān)基因、5個(gè)與蛋白、脂肪和糖合成和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因、2個(gè)與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因、2個(gè)與抗氧化相關(guān)基因、2個(gè)與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)相關(guān)基因和3個(gè)功能未知基因。以下探討其中一部分關(guān)鍵基因的功能和應(yīng)答機(jī)理。

3.1 光合作用相關(guān)基因

低溫使得生物膜結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化，進(jìn)而導(dǎo)致植物體內(nèi)新陳代謝的有序性被打破，特別是光合作用受到影響。植物葉綠體的類囊體膜在光下催化ADP形成ATP的反應(yīng)，有兩種類型：循環(huán)式光合磷酸化(cyclic photophosphorylation)和非循環(huán)式光合磷酸化。在34個(gè)佛手低溫脅迫相關(guān)基因中，有4個(gè)基因?qū)?yīng)蛋白功能與循環(huán)式光合磷酸化的光合鏈相關(guān)：6-C19(類囊體蛋白ALB2、ALB3,Ablinteractor-like protein-2、3)、6-C1(P700)、2-G2(質(zhì)體藍(lán)素蛋白,plastocyanin-like protein)、7-6-15(細(xì)胞色素f,cytochrome f)。半定量PCR結(jié)果表明，佛手的Ablinteractor-like和P700，在低溫脅迫后表達(dá)量明顯下調(diào)；plastocyanin-like和cytochromef表達(dá)量略微上調(diào)。這些基因在低溫脅迫后表達(dá)量的變化，說(shuō)明佛手在低溫逆境中其循環(huán)式光合磷酸化途徑受到了影響，進(jìn)而影響到佛手的光合作用，這可能是低溫造成佛手光合能力下降的原因之一。

除此之外，在佛手低溫脅迫下獲得的光合相關(guān)基因片段還有8-4-11-3、G19、8-3-17、8-3-17、4-G23分別同源于γ碳酸酐酶(γ-type carbonic anhydrase protein)、葉綠素酶1(Chlorophyllase-1)、ATP合酶CFO亞基I(ATP synthase CF0 subunit I)及向光素(phototropins)基因。其中γ碳酸酐酶和葉綠素酶對(duì)應(yīng)的片段在低溫脅迫后表達(dá)量增加。碳酸酐酶被認(rèn)為在逆境條件下參與了光合速率的調(diào)節(jié)，Downton和Slatyer[9]認(rèn)為在干旱或高溫條件下光合速率的變化與碳酸酐酶活性的變化有一定的相關(guān)性。葉綠素酶1的作用是降解葉綠素，低溫脅迫能使原有的葉綠素受到破壞而降解，本研究中佛手葉綠素酶1基因表達(dá)量的增加，可能是用于水解低溫下受破壞的佛手葉綠素。ATP合酶CFO亞基Ⅰ和向光素對(duì)應(yīng)的佛手差異片段在低溫脅迫后表達(dá)量減少，魏家綿等[10]研究表明，葉綠體中的ATP合酶亞基Ⅰ可以通過(guò)與亞基Ⅱ-CF1亞基δ的交聯(lián)會(huì)引起光合磷酸化的抑制。向光素能夠結(jié)合黃素單核苷酸(FMN)進(jìn)行自動(dòng)磷酸化作用，它介導(dǎo)植物向光性運(yùn)動(dòng)、葉綠體移動(dòng)與氣孔開(kāi)放等反應(yīng)，在藍(lán)光信號(hào)傳導(dǎo)反應(yīng)中它啟動(dòng)生長(zhǎng)素載體的運(yùn)動(dòng)和誘導(dǎo)Ca2+的流動(dòng)，從而調(diào)節(jié)植物細(xì)胞代謝相關(guān)反應(yīng)。

植物體代謝的重新調(diào)整，是植物增加抗性的主要機(jī)理之一[11]，而佛手的低溫引起的差異片段中有8個(gè)基因與光合作用有關(guān)，這就說(shuō)明了在低溫脅迫下佛手的光合作用受到了很大的影響，從而影響到了佛手的正常代謝。

3.2 植物逆境應(yīng)答相關(guān)基因

低溫脅迫會(huì)導(dǎo)致多種基因的應(yīng)激上調(diào)，以應(yīng)對(duì)突如其來(lái)的冷害，增加植物對(duì)寒冷的抵御能力。在佛手低溫脅迫獲得的差異片段中，有8個(gè)與植物逆境應(yīng)答有關(guān)，這些片段經(jīng)BLAST比對(duì)后與擬南芥等植物逆境脅迫下表達(dá)的、有功能注釋的基因同源，且這些片段在低溫脅迫后均上調(diào)。植物通過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)或上調(diào)表達(dá)一系列基因，在植物逆境應(yīng)答中降解異常蛋白、修復(fù)損傷蛋白、運(yùn)輸有毒物質(zhì)、維持細(xì)胞平衡，從而增加植物對(duì)脅迫環(huán)境的抵御能力。

8-3-13高度同源于擬南芥在輻射和化學(xué)試劑誘導(dǎo)下產(chǎn)生的DNA損傷修復(fù)蛋白DRT[12]基因，DRT能與脅迫后受到損傷的DNA結(jié)合，從而起到對(duì)損傷DNA的保護(hù)作用[13]。本研究中，佛手DRT的表達(dá)量在低溫下明顯增加，有利于了修復(fù)低溫脅迫造成的DNA損傷，減輕對(duì)植株生長(zhǎng)、代謝的影響。

環(huán)境脅迫下，植物會(huì)啟動(dòng)蛋白降解以維持細(xì)胞的正常功能[14]。5-C2高度同源于擬南芥26S蛋白酶體亞基(26S proteasome regulatory subunit)的基因。26S蛋白酶體被認(rèn)為在依賴ATP的非溶酶體降解途徑中起著重要作用[15]，它不僅能破壞不穩(wěn)定的調(diào)節(jié)蛋白，而且還能降解長(zhǎng)命的組成性表達(dá)蛋白；另外，它能快速消除因突變或多種環(huán)境脅迫(如高溫、氧化脅迫和重金屬)造成的結(jié)構(gòu)不正常的蛋白質(zhì)，部分介導(dǎo)生物的抗逆性[16-17]，因此它在逆境下對(duì)維持細(xì)胞的生存能力似乎是不可缺少的。佛手低溫脅迫后5-C2的表達(dá)量明顯上調(diào)，過(guò)量的26S 蛋白酶體將對(duì)佛手由于低溫脅迫產(chǎn)生的一些不正常的蛋白質(zhì)進(jìn)行降解，以提高其對(duì)低溫的抵御能力。

硫氰酸酶(Rhodanese domain protein)能使有毒的氰化物轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)毒的硫氰酸鹽，具有使植物組織解毒的功能[18]。而在佛手低溫脅迫后明顯上調(diào)的6-C30高度同源于擬南芥逆境中高表達(dá)的Rhodanesedomain。植物在低溫脅迫下容易積累有毒的中間物質(zhì)，硫氰酸酶能夠減少其中氰化物對(duì)植株造成的傷害。

8-6-39-1同源于擬南芥缺鐵激發(fā)的病原無(wú)毒蛋白(Avirulence protein, Avr)基因，此基因的作用機(jī)制是與抗性基因R(Resistance gene, 簡(jiǎn)稱R基因)相互識(shí)別、結(jié)合而作用從而增加植物對(duì)脅迫環(huán)境的適應(yīng)性。具體作用機(jī)制是R基因的受體蛋白識(shí)別特定的avr基因產(chǎn)物，從而激發(fā)含有蛋白激酶的信號(hào)傳遞，誘導(dǎo)植物抗性表達(dá)[19]。

轉(zhuǎn)座酶(Ac-like transposase protein)和逆轉(zhuǎn)座子蛋白(Retrotransposon-like protein)都被認(rèn)為和植物的脅迫抗性有一定關(guān)系，7-6-42同源于擬南芥的Ac-liketransposase，3-G17同源于水稻的Retrotransposon-like，它們?cè)诜鹗值蜏孛{迫后表達(dá)量都明顯增加。轉(zhuǎn)座酶與抗病基因核糖體蛋白S5(RPS5)有一定關(guān)系[20]，而逆轉(zhuǎn)座子蛋白與水稻[21]、小麥[22]、玉米[23]和煙草[24]抵御冷害逆境有關(guān)，表明佛手在逆轉(zhuǎn)座子基因功能性上與其它作物在這個(gè)方面具有一定的共性。

植物受病原物侵染時(shí)常產(chǎn)生一些發(fā)病相關(guān)蛋白(Pathogenesis-related Proteins，簡(jiǎn)稱PR蛋白)進(jìn)行抵御，β-1,3-葡聚糖酶(β-1,3-glucanase)即是其中之一[25]。3-G15 98%同源于受乙烯脅迫的甜橙中分離鑒定的β-1,3-glucanase[26]，同時(shí)81%同源于受寒冷脅迫誘導(dǎo)的“Fortune”柑橘(克萊門氏小柑橘x酸桔)中分離鑒定的β-1,3-glucanase[27]。β-1,3-glucanase在佛手低溫脅迫后表達(dá)量明顯增加，它的增加能加速β-1,3-葡聚糖的水解[28]，水解的寡糖產(chǎn)物被認(rèn)為是植物防御反應(yīng)的重要激發(fā)子。

3.3 細(xì)胞壁代謝相關(guān)基因

佛手低溫脅迫下獲得的差異片段中，有3個(gè)片段的功能與細(xì)胞壁組分和細(xì)胞壁代謝相關(guān)，它們通過(guò)增厚細(xì)胞壁、調(diào)整細(xì)胞壁的成分，從而增加佛手對(duì)低溫的耐受能力，其對(duì)應(yīng)功能是：纖維素合酶(Cellulose synthase protein)、伸展蛋白(Extensin-like protein)、葡聚糖轉(zhuǎn)葡糖苷酶(Xyloglucanendotransglycosylase,XET)。

纖維素和伸展蛋白是植物細(xì)胞壁的主要組成成分，7-6-5和7-6-33-1高度同源于擬南芥的Cellulosesynthase和Extensin-like，這2個(gè)基因在佛手低溫脅迫后表達(dá)量的都增加。可以被認(rèn)為是在受到低溫脅迫時(shí)，佛手通過(guò)加強(qiáng)細(xì)胞壁合成能力，加厚細(xì)胞壁來(lái)抵御低溫對(duì)它的傷害，同時(shí)提高其抵御寒冷的能力[29]。同時(shí)佛手的伸展蛋白基因100%同源于香櫞在病毒脅迫下獲得cDNA片段[30]，此片段在病毒脅迫后香櫞中也是上調(diào)表達(dá)，伸展蛋白的積累量與細(xì)胞經(jīng)脅迫后受到的傷害程度呈正相關(guān)[31]，這也在一定程度上證明了佛手抗寒性低在-4℃的低溫下細(xì)胞已經(jīng)受到傷害[32]。

7-3-29與擬南芥的Xyloglucanendotransglycosylase高度同源，XET能夠改變植物細(xì)胞壁主要成分，因此在形態(tài)學(xué)發(fā)生和組織形成過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用[33]。擬南芥中存在著XET基因家族，其中TCH4能夠迅速的對(duì)低溫進(jìn)行反應(yīng)，通過(guò)增加TCH4的表達(dá)量調(diào)整植物細(xì)胞壁的成分、細(xì)胞大小、形狀，從而增加對(duì)低溫的抗性。

3.4 抗氧化性相關(guān)基因

細(xì)胞的抗氧化能力與植物的抗寒性呈正相關(guān)的。植物遭遇低溫脅迫或經(jīng)歷低溫鍛煉其實(shí)都是經(jīng)歷一個(gè)氧化脅迫的過(guò)程。低溫下由于植物對(duì)O2的利用能力降低，多余的O2能在代謝過(guò)程中被轉(zhuǎn)化成對(duì)植物有毒害作用的活性氧。故過(guò)剩的O2對(duì)需O2生物有潛在毒性，必須通過(guò)植物抗氧化系統(tǒng)及時(shí)清除。

8-3-10同源于過(guò)氧化物酶(POD)基因，并在佛手低溫脅迫后基因表達(dá)量增加。這說(shuō)明低溫對(duì)POD有一定誘導(dǎo)作用，而低溫誘導(dǎo)產(chǎn)生的POD一定程度緩解了植物氧化性傷害；但隨氧化程度的加重，植物細(xì)胞受到傷害加重甚至死亡，這些抗氧化酶合成的量也將逐漸降低并最終失活。

硫氧還蛋白(Thioredoxin family protein)在維持細(xì)胞氧化還原平衡上起著重要作用[34]，8-4-29-3同源于擬南芥的thioredoxinfamily。硫氧還蛋白M1型基因AtTRX m1與生物環(huán)境脅迫有一定的相關(guān)性，尤其在逆境脅迫引起的氧化脅迫中，蛋白質(zhì)中半胱氨酸殘基易被活性氧氧化，在蛋白質(zhì)分子內(nèi)或分子間形成較穩(wěn)定的二硫鍵(—S—S—)，這些被氧化半胱氨酸殘基能為TRX系統(tǒng)還原，從而恢復(fù)其功能，除此之外，Trx還直接或間接調(diào)控植物抗氧化保護(hù)酶系統(tǒng)的活性[35]，因此，本研究中TRX的上調(diào)表達(dá)能夠增強(qiáng)植物對(duì)逆境的耐受力。

3.5 其他重要功能基因

6-C22高度同源于擬南芥的ATP-binding轉(zhuǎn)運(yùn)體(ABC)基因，從半定量結(jié)果來(lái)看，佛手的ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)體基因在低溫脅迫后表達(dá)量明顯上調(diào)。Moussatova等[36]認(rèn)為ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)體是一種整合的膜蛋白，可以在有ATP的前提下把細(xì)胞所產(chǎn)生的毒素和異生素轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞外[37-38]。而從植物適應(yīng)脅迫環(huán)境是一個(gè)需要 ATP的過(guò)程來(lái)推測(cè)，循環(huán)電子傳遞或葉綠體呼吸電子傳遞可能會(huì)提供額外的ATP 以適應(yīng)低溫脅迫下一些耗能的反應(yīng)[39-40]。低溫脅迫下ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)量增加，佛手可供給的ATP的增加，從而對(duì)低溫脅迫下的佛手起保護(hù)作用。

1-C1同源于亞精胺/腐胺轉(zhuǎn)運(yùn)通透酶potB基因，在低溫脅迫后表達(dá)量增加。多胺廣泛存在于生物細(xì)胞中，是一類低分子脂肪含氮物，多胺與植物的抗逆性關(guān)系密切，包括水分脅迫、溫度脅迫和鹽脅迫。在逆境脅迫下，植物細(xì)胞內(nèi)多胺含量及合成酶的活性顯著上升，所以用于轉(zhuǎn)運(yùn)多胺的通透酶的量也將上升，以提高對(duì)增加的亞精胺和腐胺的轉(zhuǎn)運(yùn)能力[41]。

綜上所述，佛手受低溫脅迫時(shí)有一個(gè)復(fù)雜的生理和分子調(diào)控下的抵抗機(jī)制。低溫脅迫下，有大量相關(guān)基因表達(dá)或差異表達(dá)，根據(jù)基因功能分析，其中與植物逆境應(yīng)答和光合作用有關(guān)的基因的下調(diào)表達(dá)可能是造成佛手寒敏感的主要原因。要找到佛手寒敏感機(jī)制的關(guān)鍵基因及信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制還有待于更深入和廣泛的研究。

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